Fas系统参与介导烧伤后心肌细胞凋亡及牛磺酸的影响.pdf

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1、收稿日期:2 0 0 5-0 4-1 9 基金项目:国家自然科学基金资助项目(N o . 3 0 0 6 0 0 2 9) 作者简介:万福生(1 9 5 7-) , 男, 教授, 研究方向: 基因表达调控。 O a s系统参与介导烧伤后 心肌细胞凋亡及牛磺酸的影响 万福生1, 龚文华1, 赵小曼1, 余乐涵1, 李 华1, 李国辉2 ( 南昌大学1.医学院生化与分子生物学教研室, 2.第一附属医院烧伤中心, 江西 南昌3 3 0 0 0 6) 摘要:目的 观察F a s系统在烧伤后心肌细胞凋亡中的作用及牛磺酸的影响。方法 选健康W i s t a r大鼠, 随机 分成对照组(S h a m)

2、、 烧伤组( 造成4 0%T B S A 度烧伤) 和牛磺酸保护组( 烫伤后即刻腹腔注射牛磺酸4 0 0m g/ k g ) 。用原位末端标记(TUN E L) 法检测凋亡细胞,R T - P C R检测F a smR NA表达, 免疫组化检测F a s/F a s L和 C a s p a s e - 8/3蛋白表达和荧光法分析C a s p a s e - 3活性。结果 烧伤组大鼠伤后6h和2 4h心肌细胞凋亡指数分别 为8. 9 62. 1 0和1 8. 6 72. 4 8, 较对照组(0. 9 20. 3 4) 有显著性升高,F a s蛋白阳性表达指数分别为1 3. 5 11. 5 6

3、 和1 4. 5 51. 8 9, 也显著性高于对照组(2. 4 60. 7 5) ;C a s p a s e - 3活性分别为1. 3 80. 1 6和1. 9 60. 7 1, 较对照组 (0. 3 50. 0 6) 有显著性差异。烧伤组凋亡指数与F a s表达之间有良好的相关性( r=0. 8 6) 。牛磺酸保护组细胞凋 亡指数为2. 1 40. 6 8,F a s蛋白表达为3. 7 10. 8 2,F a smR NA表达为0. 1 70. 0 3,C a s p a s e - 3活性为0. 8 80. 1 6, 较烧伤组均有显著性降低。结论 F a s系统参与了介导烧伤后心肌细胞

4、凋亡, 牛磺酸对烧伤后心肌细胞F a s表达 及其信号转导有较好的拮抗作用。 关键词:O a s;细胞凋亡;心肌;牛磺酸;烧伤 中图分类号:R-3 3 2 文献标识码:A 文章编号:1 0 0 0-2 2 9 4( 2 0 0 5)0 5-0 0 0 4-0 4 O a sA n t i g e n i s I n v o l v e d i nE a r l yP o s t - P u r nS t a g eA p o p t o s i so f C a r d i o m y o Q y t e sa n dE f f e Q t so fT a u r i n eo n i t W

5、A NO u - s h e n g 1, G O N G W e n - h u a 1, Z H A OX i a o - m a n 1, Y UL E - h a n 1, L IH u a 1, ( 1.D e p a r t m e n t o fB i o c h e m i s t r ya n dM o l e c u l a rB i o l o g y,2.B u r nC e n t e ro fF i r s tA f f i l i a t e d H o s p i t a l,N a n c h a n gU n i v e r s i t y,N a n c

6、h a n g3 3 0 0 0 6,C h i n a) A B S T R A C T:O P j e Q t i v e T o i n v e s t i g a t et h ea p o p t o s i so fc a r d i o m y o c y t e sa n di t sr e l a t i o n s h i pw i t h c h a n g e so fF a s a n t i g e ne x p r e s s i o nd u r i n g t h e e a r l yp o s t - b u r ns t a g e a n de f f

7、 e c t so f t a u r i n eo n t h e m. M e t h o d s H e a l t h ya d u l tW i s t e r r a t sw e r e r a n d o m l yd i v i d e d i n t o t h e c o n t r o l g r o u p(w i t h o u tb u r n - e d) ,t h eb u r n e dg r o u p(s u b j e c t e dt oa4 0%T B S A d e g r e es c a l di n j u r y)a n dt a u r

8、 i n et r e a t m e n t g r o u p(t r e a t e db yi n t r a p l e u r a l i n j e c t i o nt a u r i n e4 0 0m g / k g ). T e r m i n a ld e o x y n u c l e o t i d yt r a n s f e r - a s e - m e d i a t e dd UT Pf l u o r e s c e n t n i c ke n d l a b e l i n g(TUN E L) 、R T - P C Ra n dS - P i mm

9、 u n o h i s t o c h e m - i c a l s t a i n i n gw e r eu s e dr e s p e c t i v e l yt od e t e r m i n e t h ea p o p t o s i sa n dg e n e se x p r e s s i o no fF a s/F a s L a n dc a s p a s e - 8/3,a n dC a s p a s e - 3a c t i v i t yw a sd e t e c t e db yF l u o r o s p e c t r o p h o t o

10、 m e t r y . R e s u l t s C a r - d i o m y o c y t e sa p o p t o s i s i n d e x so f t h eb u r n e dg r o u p sa t 6a n d2 4p o s t b u r nh o u r s(P BH s)w e r e8. 9 6 2. 1a n d1 8. 6 72. 4 8r e s p e c t i v e l y,p o s i t i v ee x p r e s s i o n i n d e x e so fF a sp r o t e i nw e r e1

11、3. 5 11. 5 6 a n d1 4. 5 51. 8 9r e s p e c t i v e l y,C a s p a s e - 3a c t i v i t yw e r e1. 3 80. 1 6a n d1. 9 60. 7 1r e s p e c t i v e l y, c o m p a r e dw i t ht h e c o n t r o l . T h e r ew e r ea l l s i g n i f i c a n t i n c r e a s e d . T h e r ew e r e c o r r e l a t i o n(r=0.

12、 8 6) b e t w e e nc a r d i o m y o c y t e sa p o p t o s i si n d e x e sa n dF a sg e n ee x p r e s s i o no ft h eb u r n e dg r o u p s . C o m - 4 江西医学院学报R S S T年第U T卷第T期 A c t aA c a d e i a eM e d i c i n a eJ i a n g x iR S S T,V o l U T,N o T p a r e dw i t ht h eb u r n e dg r o u p,c a

13、 r d i o m y o c y t e sa p o p t o s i s i n d e x s、F a sg e n ee x p r e s s i o na n dc a s p a s e - 3 a c t i v i t y so f t a u r i n et r e a t m e n tg r o u pw e r ea l l l o w e rs i g n i f i c a n t l y . C o n Q l u s i o n F a sa n t i g e ni si n - v o l v e di nc a r d i o m y o c y

14、 t ea p o p t o s i sd u r i n gt h ee a r l yp o s t b u r ns t a g e,a n dt a u r i n ee x e r t sag o o da n - t a g o n i s t a c t i o no nF a sg e n ee x p r e s s i o n i nc a r d i o m y o c y t e sa n ds i g n a l t r a n s d u c t i o np a t h w a yo fF a s d e a t hr e c e p t o r . K E Y

15、 WO R W S:O a s;a p o p t o s i s;Q a r d i o m y o Q y t e;t a u r i n e;P u r n F a s(A p o - 1,C D 9 5) 是由F a s基因表达的一种分 布于多种细胞表面的膜受体蛋白分子, 也是一种凋 亡相关抗原, 其配体(F a s L) 则由F a s L基因表达的 大分子蛋白 1。研究表明2许多病理因素如缺血, 缺氧及病毒感染等均可诱导F a s和F a s L的表达, 当F a s L与F a s结合后, 可诱导细胞凋亡。随着细 胞凋亡现象在多种心血管疾病中被证实,F a s系统 是否参与介导烧

16、伤后心肌细胞凋亡成为目前关注的 热点。研究烧伤后不同时间心肌中F a s系统的表达 变化与心肌细胞凋亡的关系, 对阐明严重烧伤后心 功能障碍甚至“ 休克心” 发生的机制有重要意义 3, 对严重烧伤后多脏器损害的防治具有重要指导作 用。本研究利用原位末端标记(TUN E L) 法观察大 鼠4 0%T B S AI I I度烧伤后不同时间心肌细胞凋亡, 用半定量R T - R C R观测心肌中F a smR NA的表 达, 以探讨烧伤后心肌细胞凋亡率与F a s系统变化 的关系及牛磺酸对其的影响。 X 材料与方法 X. X 烧伤模型制作 U 选择健康W i s t a r大鼠( 南昌大学医学院实验

17、动 物中心提供) 8 0只, 雌雄各半, 体重(2 4 32 5)g, 随 机分成对照组( S h a m) , 烧伤组(B) 和牛磺酸保护组 ( B+T a u) 。 烧伤组: 腹腔注射戊巴比妥钠(3 0m g / k g ) 麻 醉, 脱毛, 2 4h后于9 2水浴1 8s, 造成4 0%T B S A 度烧伤( 经病理切片证实) , 按每公斤体重1%烧 伤面积4m L等渗盐水腹腔注射, 即将总量一半分 为2等份, 分别于伤后即刻和伤后4h注射, 另一半 分成4等份, 分别于伤后8h, 1 2h,1 6h及2 4h注 射, 分笼喂养大鼠, 自由进食, 饮水。并于伤后1h, 3h,6h,1

18、2h、2 4h及4 8h处死动物, 取心肌做有关 分析。牛磺酸保护组( B+T a u) : 在伤后即刻腹腔 注射牛磺酸( 4 0 0m g / k g ) , 并于伤后2 4h处死动物, 余操作同烧伤组。对照组( S h a m) :3 7水1 8s, 不补液, 1h后处死动物, 余操作同烧伤组。 XY R 凋亡细胞的原位末端标记( T U N E L) 及半定量 分析 心肌组织常规石蜡包埋、 切片。采用末端脱氧 核苷酸转移酶(T d T酶) 介导的带荧光的d UT P缺 口末端标记法(TUN E L) 标记凋亡细胞核中D NA - 末端( 试剂购自美国I n t e r g e公司) 。结

19、果判断: 光 镜下正常心肌细胞核呈蓝色, 凋亡细胞核呈深浅不 一的棕色, 即阳性细胞。每张切片选择5个视野, 每 个阳性视野计算2 0 0个细胞中阳性细胞数, 以计算 平均阳性细胞数所占的百分比作为凋亡细胞的阳性 指数(A p o p t o s i s i n d e xA I) 。 XY 3 O a s/O a s L和C a s p a s e - Z/3蛋白表达及半定量 分析 取上述心肌石蜡标本相应部位的连续切片5 张, 按S - P法进行免疫组化及HR P/A E C染色( 北 京中山生物技术公司) , 第一抗体 均 为 免 抗 鼠 的 F a s、C a s p a s e - 8

20、及C a s p a s e - 3蛋 白 的 多 克 隆 抗 体 ( S a n t aC r u z公司) 。每张切片于阳性区选择5个无 重叠视野, 每视野计数2 0 0个心肌细胞中待测蛋白 阳性表达指数( P o s i t i v ee x p r e s s i o n i n d e xP E I) 。 X. U O a s基因m R N A表达的检测及半定量分析 采用R T - P C R检测心肌中F a s及a c t i n( 作为内 对照) 的mR NA表达变化( 试剂购自P r o m e g a公 司) , 扩增F a s的引物序列为上游引物: 5 C C AG G -

21、 GA C T GATAG C AT C T T T GAG G 3 下游引物为:5 T G T GAAAG T C C T GAA C C C TAAG G;C - a c t i n上 游引物为: 5 T C AT GAAG T G T GA C AT C G 3 , 下游 引物为5 AAA C T G C A C G T G T G TAAA C 3 , F a s扩 增片段的长度为4 3 6b p,C - a c t i n扩增长度为2 8 9 b p 。扩增步骤主要为:一步法提取总R NA, 要求 总R NA浓度A 2 6 0/A 2 8 0为1. 72. 0;单管行 R T - P

22、 C R反应: 将mR NA逆转录成c D NA及c D NA 扩增过程在同一管内进行( 具体操作按药盒说明书 进行) 。P C R反应条件为9 5 2m i n, 第1个循环, 9 43 0s、5 0 3 0s、6 8 6 0s重复3 5个循环, 然 后6 8延 伸8 m i n。凝 胶 电 泳 与 拍 照: 取1 0 L P C R反应产物于1. 5%琼脂糖凝胶( 含溴化乙 锭) 中电泳, 紫外灯下观察、 拍照。 5 江西医学院学报R S S T年第U T卷第T期 A c t aA c a d e i a eM e d i c i n a eJ i a n g x iR S S T,V o

23、 l U T,N o T X. T 心肌C a s p a s e - 3活性测定 取心肌0. 3g, 用冷生理盐水洗2次, 剪碎, 在 1 0 0目和2 0 0目尼龙网上, 用眼科镊子夹持, 以冷 P B S液冲洗, 收集细胞置1 0m L离心管中,20 0 0g 离心5m i n,弃上清。用P B S( p H 7. 4) 洗沉淀2次, 加细胞裂解液0. 5m L, 充分振荡后, 室温下作用3 0 m i n,1 50 0 0g离 心1 5 m i n, 取 上 清1 0 0L加 HE P E S缓冲液1. 0 m L, 再加A C - D E V D - AMC 1 0 g( 1g/L)

24、 ,3 7水浴6 0 m i n, 于激发波长3 8 5 n m, 发射波长4 6 5n m, 测其荧光强度变化, 其活性 单位用D E V D - AMCn m o l/ ( h m g ) 蛋白表示。 X. 统计学处理 所有实验数据均以xs表示, 采用S P S S 1 1. 0 软件处理分析, 两组间比较采用S t u d e n t st检验。 R 结果 R. X 烧伤后心肌细胞凋亡数目变化( 表X ) 与假烫伤组( S h a m) 比较, 烧伤组大鼠在伤后6 4 8h的不同时相点的心肌细胞凋亡数均有显著 性增加( P0. 0 5) , 在伤后1 2h, 心肌细胞凋亡数达 峰值; 在

25、伤后2 4 h, 牛磺酸保护组心肌细胞凋亡数显 著性地低于烧伤组(P0. 0 5) , 表明牛磺酸对烧伤 后心肌细胞凋亡有较好的拮抗作用。 RY R 心肌组织O a s基因m R N A表达( 表X ) 心肌组织F a s基因mR NA经R T - P C R和电泳 检测, F a s电泳条带(4 3 6b p) 与C - a c t i n(2 8 9b p) 条 带清晰可见, 经密度扫描仪测得F a s条带与C - a c t i n 条带峰面积积分, 以F a s/a c t i n比值表示F a s基因 mR NA表达水平变化, 结果显示: 烧伤后3h心肌 F a s基因mR NA表达

26、即呈显著性升高, 于伤后1 2h 达峰值, 伤后4 8hF a s基因mR NA表达与假烫伤 组无显著性差别。在伤后2 4h, 牛磺酸保护组心肌 F a smR NA的表达与烧伤组比较有显著性下降(P 0. 0 5) 。提示, 牛磺酸对烧伤后心肌F a s基因转录 有一定的抑制作用。 R. 3 心肌组织C a s p a s e - 3活性变化( 表X ) 烧伤组大鼠心肌C a s p a s e - 3活性在伤后6h即 显著高于对照组, 伤后1 2h达峰值, 伤后2 4h仍然 高于对照组, 并发现牛磺酸对伤后C a s p a s e - 3活性 升高有一定的抑制作用。 RY U 心肌组织O

27、 a s /O a s、C a s p a s e - Z及C a s p a s e - 3蛋 白表达的变化( 表R) 表1 心肌细胞凋亡指数、O a sm R N A表达及C a s p a s e - 3活性( xs) 组别 n 心肌细胞凋亡指数 A I(%) F a smRNA表达 (F a s/a c t i n) C a s p a s e - 3活性 (n m o l/ (hm g) S h a m1 00. 9 20. 3 40. 1 30. 0 30. 3 50. 0 6 烧伤组(B) 伤后1h1 01. 4 50. 4 30. 6 40. 0 7*0. 4 30. 0 7

28、伤后3h1 01. 6 90. 7 0*0. 7 20. 0 7*1. 3 80. 1 6* 伤后6h81 7. 3 12. 3 1*0. 8 10. 0 8*1. 4 70. 2 0* 伤后1 2h82 1. 5 22. 5 7*0. 9 20. 0 8*2. 1 80. 1 8* 伤后2 4h81 8. 6 72. 4 8*0. 5 70. 0 7*1. 9 60. 1 7* 伤后4 8h81 4. 1 02. 6 3*0. 2 10. 0 50. 8 50. 1 5* B+T a u1 02. 1 40. 6 80. 1 70. 0 30. 8 80. 1 6* 与对照组比较*P0. 0

29、 5,*P0. 0 1; 与牛磺酸保护组比较, P0. 0 5 表2 心肌组织O a s/O a s L、C a s p a s e - Z和C a s p a s e - 3蛋白表达水平( xs,) 组别 n F a sP r o t e i n P E I F a s LP r o t e i n P E I C a s p a s e - 8 P r o t e i nP E I C a s p a s e - 3 P r o t e i nP E I S h a m1 02. 4 60. 7 51. 8 90. 3 10. 7 20. 1 20. 8 50. 1 3 烧伤组(B) 伤后

30、1h1 08. 7 11. 2 1*2. 1 60. 2 91. 2 50. 4 01. 0 50. 1 2 伤后3h1 01 3. 5 11. 2 1*2. 5 00. 4 66. 7 80. 8 5*1. 7 00. 1 8* 伤后6h82 1. 0 22. 3 4*2. 6 00. 3 7*8. 1 10. 8 2*4. 2 30. 5 6* 伤后1 2h81 8. 6 42. 0 7*2. 1 20. 4 04. 0 50. 3 5*2. 8 60. 3 2* 伤后2 4h81 4. 5 51. 8 9*2. 0 80. 3 82. 5 30. 2 4*2. 5 10. 2 6* 伤后

31、4 8h84. 8 00. 8 5*1. 9 70. 3 51. 0 20. 2 11. 5 50. 2 7 B+T a u1 03. 7 10. 8 22. 1 00. 3 11. 7 10. 2 31. 3 10. 2 3 与对照组比较*P0. 0 5,*P0. 0 1; 与牛磺酸保护组比较P0. 0 5 6 江西医学院学报R S S T年第U T卷第T期 A c t aA c a d e i a eM e d i c i n a eJ i a n g x iR S S T,V o l U T,N o T 由表2可见, 烧伤组大鼠心肌F a s蛋白表达在 伤后1h即呈显著性高于对照组( P

32、0. 0 5) , 于伤后 6h达峰值, 伤后4 8h仍显著高于对照组;F a sL蛋 白仅在伤后6h较对照组有显著性区别,C a s p a s e - 8 蛋白在伤后3h也呈显著性增高, 伤后6h达峰值, 伤后2 4h仍高于对照组;C a s p a s e - 3蛋白表达在伤 后6h开始呈显著性升高。 R. T 心肌细胞凋亡与F a s系统表达的相关性 通过分析F a s蛋白阳性指数(P E I) 与心肌细胞 凋亡指数(A I) 间的关系, 结果发现二者间良好的相 关性( r=0. 8 6,P0. 0 5) 。分析还发现F a s蛋白表 达与C a s p a s e - 3活性间也存在

33、相关性( r=0. 8 3,P 0. 0 5) 。 3 讨论 细胞凋亡是一种在基因调控不进行的主动有序 的生理性死亡过程, 但细胞凋亡在烧伤后心脏功能 障碍中的病理生理意义目前尚未被阐明。研究表 明 5, 细胞凋亡也参与了烧伤后心肌损害, 心肌细胞 凋亡是引起烧伤后心功能障碍的重要原因之一, 其 机制主要与NO、 氧自由基及钙平衡失调有关。许 多证据表明F a s系统参与了心力衰竭, 病理性心肌 炎及心肌缺血及再灌注损伤的心肌细胞凋亡 1,6, 笔者研究证实 7, 牛磺酸能抑制严重烧伤大鼠心肌 肿瘤坏死因子 - (TN F - ) 和血管紧张素(A n g) 的生成, 对严重烧伤大鼠心肌损害有

34、较好的护作用。 本研究结果显示, 伤后6h心肌细胞凋亡开始呈显 著性增多, 伤后1 2h细胞凋亡数达峰值, 牛磺酸保 护组心肌细胞凋亡数显著性地低于烧伤组( 见表 1) 。烧伤组心肌F a smR NA和F a s蛋白表达在烧 伤后3h即呈显著性增高, 伤后2 4h仍高于对照 组,C a s p a s e - 8蛋白在伤后3h也开始升高, C a s p a s e - 3活性在伤后6h开始呈显著性升高, 牛磺酸保护 组心肌细胞凋亡指数与烧伤组比较有显著性降低, 且F a smR NA和C a s p a s e - 8蛋白及C a s p a s e - 3活性 均有显著性降低, 相关性分

35、析表明, 烧伤后心肌细胞 凋亡, 与F a s表达间有良好的相关性。提示,F a s系 统参与了烧伤后心肌细胞凋亡。牛酸酸对烧伤后心 肌细胞凋亡有较好的拮抗作用, 其机制可能与抑制 F a s表达有关。导致烧伤后心肌细胞凋亡因素很 多, 其中心肌缺血 ( 氧) 及 大 量 炎 性 细 胞 因 子 ( 如 TN F ) 分泌是最重要因素。一方面心肌缺氧可诱 导凋亡活化因子M t d基因表达, 促进细胞凋亡; 另 一方面缺氧可诱导心肌细胞表面F a s表达增加, 进 而与F a s L结合触发凋亡的发生。尽管缺血心肌细 胞凋亡的分子机制尚未完全阐明, 但F a s系统参与 细胞凋亡的途径较为清晰

36、8,9, 其主要过程包括如 下 :死亡受体分子的活化,凋亡酶复合体的形 成, 即F a s - F a s L - F A D D-C a s p a s e - 8酶原串联构成 的复合物,效应C a s p a s e的活化。经F a s诱导的 细胞凋亡特点为 1 0: 凋亡并不要求细胞核存在, 不 依赖于细胞外钙离子及细胞核和细胞浆出现固缩及 碎片形成。F a s信号转导细胞凋亡的通路目前认为 至少有4条, 并已发现有多种F a s介导凋亡的抑制 机制 8。本研究表明, F a s系统参与介导了烧伤后 心肌细胞凋亡, 牛磺酸对烧伤后心肌细胞F a s表达 及其信号传递有较好的拮抗作用。通过

37、抑制F a s系 统信号转导路径中的某一环节, 可望成为抑制烧伤 后心肌细胞凋亡的重要手段。 参考文献: 1 T i mm e rT,d eV r i e sE G,d eJ o n yS. F a sr e c e p t o r - m e d i a t e da p - o p t o s i s:ac l i n i c a l a p p l i c a t i o nJ. JP a t h o l,2 0 0 2,1 9 6(2) :1 2 5- 1 3 4. 2 万福生, 王青松, 吴绮明, 等.牛磺酸对心肌缺血损伤细胞凋亡 与F a s/F a s L基因表变化的影响J.中国

38、药物与临床,2 0 0 4,4 (1) :1 7-1 9. 3 黄跃生.烧伤后早期心肌损害的分子机制及防治研究进展J. 中华烧伤杂志2 0 0 4,1 0(5) :2 5 7-2 5 9. 4 黄跃生, 李志清, 吴庆云, 等.缺血缺氧在大鼠烧伤后“ 休克心” 中的作用及其机制研究J.中华创伤杂志,2 0 0 2,1 8(4) :2 0 5- 2 0 9. 5 张家平, 黄跃生, 周新.严重烧伤大鼠心肌细胞凋亡与心功能损 害的关系J.中华烧伤杂志,2 0 0 2,2 1(3) :1 7 3-1 7 6. 6 H a r a l d . T h eF a ss i g n a l i n gp

39、a t h w a y:m o r e t h a nap a r a d i g mJ. S c i e n c e,2 0 0 2,2 9 6(3 1) :16 3 5-16 3 6. 7 万福生, 李国辉.牛磺酸对严重烧伤大鼠心肌损害的保护作用 J.中华烧伤杂志,2 0 0 5,2 1(3) :1 7 3-1 7 6. 8 任含平, 施广霞. F a s信号转导与其抑制机制J.国外医学生 理、 病理科学与临床分册,2 0 0 4,2 4(4) :3 2 8-3 3 1. 9 S h i g e k a z uN. A p o p t o s i sb yd e a t hf a c t o r IJ. C e l l,1 9 9 7,8 8: 3 5 7. 1 0 H e n g a r t h e rMO. T h eb i o c h e m i s t r yo fa p o p t o s i sJ. N a t u r e, 2 0 0 0,4 0 7(68 0 5) :7 7 0-7 7 6. 7 江西医学院学报R S S T年第U T卷第T期 A c t aA c a d e i a eM e d i c i n a eJ i a n g x iR S S T,V o l U T,N o T