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1、6 6 8 第2 2 卷第6 期 2 0 0 9 年6 月 医学研究生学报 V 0 1 2 2N o 6 J o u r n a lo fM e d i c a lP o s t g r a d u a t e s J u n 2 0 0 9 论著摘要 P e r c o l l 密度梯度离心分离大鼠肝星状细胞 许小兵，李敏利，郭婧芸，吴文娟，朱人敏 臀黧喜答鬈篙消化帆江辅杓o 0 0 2( 南京军区南京总医院) ” 关键词：肝星状细胞；密度梯度离心；P e r c o l l 中图分类号：R 3 3 1文献标识码：A文章编号：1 0 0 8 - 8 1 9 9 ( 2 0 0 9 ) 0 6
2、 - 0 6 6 8 - 0 2 肝星状细胞( h e p a t i cs t e l l a t ec e l l s ，H S C ) 活化 并分泌胶原等基质成分，是肝纤维化发生、发展的 中心环节1 ；是目前肝纤维化实验研究的热点。 H S C 分离培养技术的发展代表了近代H S C 研究的 进步。有研究者发现，肝间质细胞体外培养时具 有分泌细胞外基质的功能 2 - 3 】。K n o o k 等H 明确 这些细胞为肝星状细胞，基于其细胞内富含维生 素A 脂滴产生的浮力，确立了肝原位酶灌注消化 及密度梯度离心的分离方法，成功分离H S C 。P e r - c o i l 是常用的密度梯
3、度离心试剂，具有无毒性、形 成密度梯度稳定的特点J ，本试验探索P e r c o l l 分 离H S C 时的合理密度梯度，取得分离H S C 的最佳 效果，为深入研究肝纤维化的发病机制打下基础。 1 材料和方法 1 1 实验动物成年雄性S D 大鼠9 只，每次使用 1 只，体重3 5 0 4 0 0 9 ，常规饲料喂养，正常饮水。 1 2 试剂 型胶原酶、D N A 酶1 、H e p e s 、E D T A 、 H a n k s 液购自S i g m a 公司；P e r c o l l 购自G E 公司； D M E M 培养基购自G i b c o 公司；胎牛血清购自杭州 四季
4、青公司；小鼠抗人、大鼠D e s m i n 单克隆抗体、 仅S M A 单克隆抗体购自武汉博士德公司，T R I T C 标 记山羊抗小鼠l g G 二抗购自南京拜奥德公司。 收稿日期： 基金项目： 作者简介： 通讯作者： 1 3 分离用液前灌注原液( 8 ) ：H e p e s7 2g 、 E D T A0 4g 、葡萄糖3 6g 、K C l0 4 9 、N a 2H I 叼4 1 2 H 2 0 5 8 9 、K H 2 P 0 40 4 9 、双蒸水2 2 0 m l ；使用时抽取3 5 m l 及 5 碳酸氢钠3 0 I l l l 加入1 8 5m l 等渗盐水中，配置成前 灌
5、注液2 5 0 m l 。后灌注液：H a n k s 液7 5I I l l 、型胶原酶 3 6n a g 、D N A 酶1 7m g 、H e p e s0 3 6g 。细胞分离液：B S A 2 5g 、D n a s e l1 0m g 、P B S1t 3 0 0m l 。 1 4 方法 1 4 1操作步骤将9 只S D 大鼠全身麻醉( 腹 腔注射氯胺酮1 0 m g 1 0 0 9 、肝素2 5 0 0 U 1 0 0 9 ) 后， 去胸腹部毛、仰卧位固定，固定鼠尾，碘附消毒。 取大十字切口，切开皮肤和腹部肌肉，下压肝组 织，剪断镰状韧带至肝上下腔静脉。将9 号输液 针胶管插入门
6、静脉，并固定。同时，迅速剪开膈 肌，游离并结扎肝上下腔静脉，剪开游离好的肝下 下腔静脉。 采用3 7 预热的前灌注液2 0m l m i n 灌注约 1 5 r a i n ，肝表面变为黄白色时完整分离肝，并转移 入超净台，使用3 7 预热的后灌注液( 0 5m s m l 型胶原酶、0 0 5m s m l D n a s e l 酶、H a n k s 液3 5 m 1 ) ，于3 7 水浴中循环灌流，流速为2 0m l m i n ， 约1 5r a i n 后肝组织完全软化，即停止灌注。将肝 及酶液倒入培养皿中，去除肝包膜，钳夹分离肝 2 0 0 8 1 0 - 2 1 ；修订日期：2
7、 0 0 8 1 2 1 6 南京军区南京总医院科研基金重点资助项目( 批准号：2 0 0 5 0 5 2 9 ) 许小兵( 1 9 8 0 一) ，男，江苏如皋人，医师，医学硕士研究生，从事消化内科专业。 朱人敏( 1 9 5 1 - ) ，男，浙江萧山人，主任医师，医学博士，博士研究生导师，从事消化内科专业。E m a i l ：c a t 4 0 9 1 2 6 c o n l 万方数据 第6 期许小兵，等P e r c o l l 密度梯度离心分离大鼠肝星状细胞 6 6 9 细胞约1 5m i n ，形成肝细胞悬液，4 D M E M 培养基 约4 0m l 稀释，2 0 0 目筛网(
8、 0 ，2 2i x m 0 1 ) 滤过，玻璃 注射器芯轻轻研磨肝组织，P B S 液冲洗。将细胞悬 液移入2 支5 0m l 离心管中，吸管吹打混匀，4 0 9 离 心4m i n ，去沉淀，取上清5 5 0g ，离心6m i n ，取沉淀 合为1 管，加入D M E M 重悬为5 0 m l ，5 5 0g 再次离 心6 m i n ，取沉淀，加入D M E M 重悬为1 5m l ，加入 1 0 m l1 0 0 P e r c o l l 工作液，混匀后，轻轻上覆2 5 P e r c o l l 液体约1 5m l 及P B S 液1 0 m l ，形成3 层不连 续密度梯度，2
9、0 9 0 0g 离心2 0m i n ，2 5 P e r c o U 层有白色细胞带，用1 6 号针头插入液面下此处抽 吸约为5m l ，加D M E M 培养液至5 0m l ，9 0 0g 离心 1 0m i n ，沉淀重悬于约1 0m lD M E M + 1 0 胎牛血 清培养基中，计数细胞产量，并行锥虫蓝染色试 验，判断其活力。按1 1 0 6 孑L 接种于6 孔板，2 4h 后首次换液，以后视情况每2 3 d 换液1 次。如需 作免疫组化等分析，可将细胞接种于内有玻片的6 孔板中。当细胞融合达到8 0 一9 0 左右可进行 传代。传代时按常规使用0 2 5 胰酶+ 0 0 4
10、E D T A 。 1 4 2 细胞成活率鉴定常规锥虫蓝排斥法。 1 4 3 细胞纯度鉴定培养皿中放人盖玻片，待细 胞贴壁伸展后，取出盖玻片，行D e s m i n 免疫荧光染 色法鉴定。 2结果 采用相差显微镜观察刚分离出的H S C ，细胞 呈圆球形，直径较肝巨噬细胞及内皮细胞大，约1 0 t x m ，在荧光显微镜下3 2 8n m 紫外光激发下，可观 察到自发较弱的绿色荧光，2 4h 后，绝大多数的细 胞已贴壁，多呈圆形或椭圆形；4 8h 后，细胞开始 伸展，细胞体增大呈多边形，少数已伸出伪足呈星 形。7d 后，细胞继续伸展，折光性的颗粒渐减少 ，绝大多数细胞呈星形，细胞开始增殖，部
11、分细胞 相互融合呈片状。1 2 1 4 d 后，增殖的细胞铺满瓶 底，并可使用胰酶消化传代，5 6 代后增殖能力逐 渐减弱。 每只大鼠的H S C 得到的数量为( 2 9 4 0 5 3 ) x 1 0 1 ，细胞成活率为( 9 7 8 0 7 ) ，D e s m i n 免疫荧 光阳性细胞为( 9 4 8 - I - 2 8 ) ；培养9d 后，仅一S M A 阳性细胞为( 7 1 2 4 8 ) 。 3 讨 论 H S C 活化、增殖、分泌各种细胞因子及细胞外 基质，在肝纤维化发生、发展过程中起关键作用。原 代H S C 的分离、培养是进行肝纤维化研究的基础， H S C 的数量较少，约
12、占肝细胞总数的5 一8 ，大 鼠H S C 与肝实质细胞比值约为1 3 ：1 0 0 1 。有实验 者早期曾采用增加维生素A 摄取法，以提高H S C 产 量，后期发现，随着年龄增加H S C 内维生素A 脂滴 增加，因而采用了更大及年长大鼠( 3 5 0g 以上) ， H S C 【6 。83 产率得以增加。因此，实验采用了较大的 大鼠，以期取得H S C 高产量。在实验过程中，影响 H S C 产量及存活率的因素有：合理密度梯度； 与其他细胞黏附量；混杂细胞碎片量；分离总时 间；适当的酶消化时间。 P e r c o l l 作为常用梯度离心分离介质之一，常用 于骨髓细胞的分离培养l o
13、】，较N y c o d e n z 等碘化 物经济实惠，同时，因其黏滞度低，梯度形成更为 迅速、稳定，易于洗脱，但国内类似实验中使用较 少。R a l f 等认为，H S C 分布于密度梯度1 0 2 5 1 0 3 5s m l 密度层次中，本实验前期参考了H a k a n ”J 测定的不同浓度P e r c o l l 的实际密度表，使用不同的 P e r c o l l 密度梯度进行H S C 分离，发现2 5 一4 0 P e r c o l l 不连续的密度梯度既保证了更好的细胞纯 度，最大可能减少混杂肝巨噬细胞及肝窦内皮细胞， 避免了复杂的淘洗过程，使分离过程简化，又保证 H
14、S C 的产量无明显减少。 H S C 易与肝细胞、细胞碎片黏附，因此，在实验 过程尽量减少细胞间黏附。本实验过程中使用含牛 血清清蛋白及D N A 酶离心分离液2 | ，反复吹打细 胞悬液，避免H S C 和肝细胞黏附，有效提高了H S C 的产量。 前期实验中比较了不同的加样方法，发现底部 加样较好。细胞悬液与1 0 0 P e r c o l l 充分混匀，放 置在梯度离心底层，在低速离心过程中，细胞逐步漂 浮至相应密度梯度层，而细胞碎片等沉积于底层，减 少了细胞碎片的混杂，增加了H S C 产量”J 。 翁山耕等 1 3 1 在实际应用中发现，链霉蛋白酶灌 注消化的程度难以把握，遂省略
15、了链霉蛋白酶E 灌 注，而直接用低速离心法来去除肝细胞。本实验 ( 下转第6 7 2 页) 万方数据 6 7 2 医学研究生学报2 0 0 9 年6 月第2 2 卷 蛋花汤为主。脑卒中患者的护理还要取得家属的支 持和配合，并指导家属以乐观的态度去面对患者的 疾病。患者出院后，建议家属每天至少给患者吃5 种以上的蔬菜和水果，每周至少吃3 次鱼，每天控制 食盐在5g 以内，常喝牛奶和适量淡绿茶，不食腌制 品、油炸品、辛辣刺激性食物，不食动物内脏等高油 脂食物。 3 结语 成功的心理护理是脑卒中患者康复期护理的基 础，完善的饮食护理是康复期护理的关键，功能锻炼 是提高生活质量的主要手段，对重症患者并
16、发症的 预防是康复期护理能否顺利进行的保障“ 8o 。脑卒 中患者要达到完全康复是一个长期的过程，只要合 理采用上述措施，制订切实可行的计划，生活要有规 律，并加强恢复期功能锻炼，保持乐观的心情，就可 有效地缩短康复期。 参考文献： 1 】史莉神经内科病人的心理护理体会 J 】蛇志，2 0 0 7 ，3 ( 1 9 ) ： 7 3 2 - 7 3 3 2 程娟，叶静4 6 例侧脑室肿瘤患者手术前后的护理 J 医学研究生学报，2 0 0 8 ，2 1 ( 5 ) ：5 5 9 - 5 6 0 3 李金萍，郑瑞红。吴晶晶，等轻度锥体外系征与老年人日常生 活能力的关系及护理对策 J 医学研究生学报，
17、2 0 0 8 ，2 1 ( 5 ) ：5 1 0 - 5 1 2 【4 范欣中风偏瘫患者的康复护理体会 J 内蒙古中医药， 2 0 0 8 ，3 l ( 8 ) ：3 7 ，4 7 5 王碧清中风患者的康复护理 J 柳州医学，2 0 0 8 ，2 1 ( 3 ) ： 1 8 3 1 8 4 6 胡明英，李华1 5 0 例脑中风患者的护理体会 J 医学理论 与实践，2 0 0 7 ，2 0 ( 4 ) ：1 6 3 1 6 4 7 赵爱武，张瑞中风后遗症的临床观察与护理 J 】中华中 西医杂志。2 0 0 3 ，1 0 ( 4 ) ：4 5 5 - 4 5 7 8 李琳，孙琳，刘云老年病房实施
18、人性化护理的体会 J 医学研究生学报，2 0 0 7 ，2 0 ( 8 ) ：8 9 3 8 9 4 ( 责任编辑：张锐) 夺夺夺夺夺夺夺夺夺夺夺夺夺夺夺夺夺夺夺夺夺夺夺夺夺夺夺夺夺夺夺 ( 上接第6 6 9 页) 采用上述方法，同时采用肝体外灌注，提高了灌注的 效率，实验时间大为缩短，4h 左右可完成全部分离 工作，保证了细胞的成活率。 实验过程中为尽量减少细胞受损，我们反复 摸索了酶灌注消化的合理时间，发现约1 5m i n 酶 灌注消化后肝组织即能完全软化，立即使用4 。C D M E M 培养基重悬细胞，终止消化，后续流程中全 程使用培养基，虽增加了培养基用量，但大大提高 了H S C
19、 成活率。 总之。改良P e r c o l l 密度梯度离心方法分离、培 养大鼠H S C 有效且可靠，为进一步进行H S C 研究 奠定基础。 参考文献： 2 】 3 】 S c o t tL F r i e d m a n ，h e p a t i cs t e l l a t ec e l l s ：p r o t e a n ，m u l t i f u n c t i o n - a 1 a n de n i g m a t i cc e l l so ft h el i v e r 【J P h y s i o lR e v 。2 0 0 8 ，8 8 ( 3 ) ：1 2 5
20、1 7 2 G a l a m b e sJ T 。H o l l i n g s w o r t hM A ，F a l e kA ，e ta 1 T h er a t eo f s y n t h e s i so fg l y c o s a m i n o g l y c a n sa n dc o l l a g e nb yf i b r o b l a s t se u l t u r o df r o ma d u l th u m a nl i v e rb i o p s i e s J C l i nI n v e s t ，1 5 r 7 7 ，6 0 ( 2 ) ：1
21、 0 7 1 1 4 V o s sB 。R a u t e r b e r gJ ，P o t tG ，e ta 1 N o n p a r e n c h y m a lc e i l sc u l t i - r a t e df r o me x p l a n t s o ff i b r o t i cl i v e rr e s e m b l ee n d o t h e l i a la n d s m o o t hm u s c l ec e l l sf r o mb l o o dv e s s e lw a l l s J H e p a t o i o g y ，
22、 1 9 8 2 ，2 ( 4 ) ：1 9 - 2 8 4 5 6 7 】 8 9 】 1 0 1 2 1 3 K n o o kD L ，S e f f e l a a rA M ，d eL e e u wA M F a t s t o r i n gc e l l so ft h e r a tl i v e r T h e i ri s o l a t i o na n dp u f f ? c a t i o n J E x pC e l lR e s ， 1 9 8 2 ，1 3 9 ( 8 ) ：4 6 8 - 4 7 1 H a k a nP F r a e t i o n a
23、 t i o no fc e l l sa n ds u b c e l l u l a rp a r t i c l e sw i t l IP e r - c o H J B i o c h e mB i o p h y sM e t h o d s ，2 0 0 0 ，4 4 ( 1 ) ：1 - 3 0 C , e e r t sA H i s t o r y ，h e t e r o g e n e i t y ，d e v e l o p m e n t a lb i o l o g y ，a n df u n e t i o no fq u i e s c e n th e p
24、a t i cs t e l l a t ec e i l s J S e m i n a r si nl i v e rd i s - e a ，2 0 0 l ，2 1 ( 6 ) ：3 1 2 3 3 5 F r i e d m a nS L 。R o l lF J I s o l a t i o na n dc u l t u r eo fh e p a t i cl i p o c y t e s ， K u p f f e rc e l l s ，s i n u s o i d a le n d o t h e l i a lc e H sb yd e n s i t yg r a
25、 d i e n t c e n t r i f u g a t i o nw i t hS t r a c t a n J A n a lB i o c h e m ，1 9 8 7 ，1 6 1 ( 5 ) ： 2 0 7 - 2 1 8 F r i e d m a nS L ，R o l lF J ，B o y l e sJ ，e t 以H e p a t i cl i p o e y t e s ：t h e p r i n c i p a lc o l l a g e n - p r o d u c i n gc e i l so fn o r m a l r a tl i v e
26、r J 】P r o e N a t l A c a dS e iU S A 。1 9 8 5 。8 2 ( 3 ) ：8 6 8 1 8 6 8 5 梁雪，粟永萍，孔佩艳，等人骨髓间充质干细胞体外培养 及鉴定 J 医学研究生学报，2 0 0 7 ，2 0 ( 5 ) ：4 5 9 - 4 6 2 朱芳，张国成，许东亮大鼠骨髓基质细胞体外增殖分化的 实验方法研究 J 医学研究生学报，2 0 0 7 ，2 0 ( 3 ) ：2 3 6 - 2 3 9 W e i s l d r e h e nR G l n e rA M I s o l a t i o na n dc u l t u r i n
27、 go fh e p a t i cs t e l l a t ee e n D M e t h o d sM o l e c u l a rM e d c i n e ，2 0 0 5 。1 1 7 ( 3 ) ：9 9 1 1 3 A l b e r tG ，T o s h i mN 。K a f f n eH E P u r i f i c a t i o no fr a th e p a t i cs t e l l a t e c e i l sb ys i d es c a R e r - a c t i v a t e dc e l ls o r t i n g J H e p a t o l o g y ，1 9 9 8 ， 2 7 ( 2 ) ：5 9 0 - 5 9 8 翁山耕，冷希圣改良法大鼠肝星状细胞的分离培养及鉴定 J 北京大学学报( 医学版) ，2 0 0 1 。3 3 ( 7 ) ：8 3 - 8 6 ( 责任编辑：张锐) 万方数据