SARS冠状病毒M蛋白全长基因的克隆、表达与纯化.pdf

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1、文章编号： 1 0 0 2 - 2 6 9 4 （2 0 0 5） 1 2 - 1 1 0 0 - 0 3 S A R S冠状病毒M 蛋白全长基因的 克隆、 表达与纯化 雷明军1， 吴少庭2， 戴五星1， 秦莉1， 潘晖榕1， 袁仕善2， 黄达娜2， 高世同2， 张仁利2， 林绮萍3 摘要： 目的克隆S A R S冠状病毒M蛋白基因编码序列，构建原核重组表达质粒p E T 2 3 a - M，并在大肠杆菌B L 2 1 （D E 3） 中进行表达、 纯化。表达产物用W e s t e r nB l o t检测其抗原性。方法 R T - P C R扩增M编码基因目的片段，胶回收纯化， 插入克隆载

2、体p M D - 1 8 T载体并转化大肠杆菌D H 5 。序列测定后亚克隆至表达质粒载体p E T 2 3 a，构建重组体p E T 2 3 a - M， 转 化大肠杆菌D H 5 。筛选阳性克隆， 以限制性酶切分析鉴定后， 转化大肠杆菌B L 2 1（D E 3） 以异丙基硫代半乳糖苷 （I P T G）进行 诱导表达。用S D S - P A G E与免疫印迹分析表达产物。结果 P C R扩增出约6 7 5 b p的 特异性片段， 与预期片段大小相符， 测序 鉴定无有义突变； 所构建的p E T 2 3 a - M重组体阳性克隆经P C R与双酶切鉴定， 与预期结果一致； S D S -

3、 P A G E显示表达产物约 2 7 k D； 表达产物经金属螯和层析纯化； 免疫印迹表明表达产物能被混合的S A R S病人恢复期血清识别。结论 成功克隆了 S A R S冠状病毒M蛋白基因编码序列， 构建了p E T 2 3 a - M表达质粒， 诱导表达并纯化出了S A R S冠状病毒M蛋白， 并以免疫 印迹鉴定。本研究的成功为进一步进行S A R S病毒诊断试剂与疫苗的开发奠定了基础。 关键词： S A R S；M蛋白； 基因表达； 蛋白纯化； 免疫印迹； 中图分类号： R 3 7 3 . 1 文献标识码： A C l o n i n g ， e x p r e s s i o na

4、 n dp u r i f i c a t i o no f t h eMg e n e f r o LS A R SC o r o n a v i r u s L E IM i n g - j u n，WUS h a o - t i n g，D A IW u - x i n g，Q I NL i，P A NH u i - r o n g，Y U A NS h i - s h a n， H U A N GD a n a，G A OS h i - t o n g，Z H A N GR e n - l i，L I NQ i - p i n g （T o n g j iM e d i c a l c

5、 o l l e g e o fH u a z h o n gU n i v e r s i t y，W u h a n4 3 0 0 3 0， C h i n a） A B S T R A C T：T o c l o n e t h eMg e n e o f S A R SC o r o n a v i r u s，e x p r e s s i nE.c o l ia n dp u r i f y t h e e x p r e s s i o np r o d u c t s，t h eMg e n e f r a g - m e n t o f S A R SC o r o n a

6、v i r u sw a s a m p l i f i e da n dc l o n e d i n t o t h ep M D - 1 8 Tv e c t o r . A f t e rn u c l e o t i d e s e q u e n c i n g，t h eMg e n e f r a g m e n t w a s s u b c o l n e d i n t o t h e e x p r e s s i o n v e c t o r p E T 2 3 aw i t h c o r r e c t o r i e n t a t i o n a n d t

7、 h e n t r a n s f o r m e d i n t oE.c o l iD H 5 . T h e p l a s m i d f r o m t h e c o r r e c t e d c l o n e i d e n t i f i e db yP C Ra n de n d o n u c l e a s e d i g e s t i o nw a s t r a n s f o r m e d i n t oE.c o l iB L 2 1 （D E 3） a n d t h e n i n d u c e d f o r e x - p r e s s i

8、o n . T h e e x p r e s s i o np r o d u c tw a sp u r i f i e db ym e t a l - c h e l a t e da f f i n i t yc h r o m a t o g r a p h ya n da n a l y z e db yW e s t e r nb l o t t i n g . I tw a s f o u n d t h a t t h e 6 7 5 b p g e n e f r a g m e n tw a s a m p l i f i e d b yR T - P C R. N u

9、c l e o t i d e s e q u e n c i n g s h o w e d t h e r ew a s n o s e n s em u t a t i o n . A2 7 K D p r o t e i nw a s e x p r e s s e da f t e r i n d u c t i o na n dp u r i f i e db ym e t a l - c h e l a t e da f f i n i t yC h r o m a t o g r a p h y .W e s t e r nb l o t t i n g r e s u l t

10、 i n d i c a t e d t h a t t h e e x p r e s s e dp r o d u c t s c o u l db e r e c o g n i z e db y s e r a o f S A R SP a t i n a t s .Mg e n e o f S A R SC o r o n a v i r u sw a s s u c c e s s i v e l yc l o n e da n de x - p r e s s e d i nE.c o l ia n d t h e e x p r e s s e dg e n e p r o d

11、 u c t sw e r e s u c c e s s f u l l yp u r i f i e da n d r e c o g n i z e db yS A R Sp a t i e n t s i s s e r u m. K E YWO R D S：S A R S；m e m b r a n e p r o t e i n；g e n e e x p r e s s i o n；p r o t e i np u r i f i c a t i o n；w e s t e r nb o l t 2 0 0 2年1 1月， 中国广东省首次发现严重急性 呼 吸 综 合 征（s e

12、v e r ea c u t er e s p i r a t o r ys y n d r o m e S A R S） 的病人。紧接着， 在2 0 0 3年2月， 中国香港 地区也报道了其首例S A R S病例。随后， 该病在世 界范围内迅速流行， 造成了严重的公共卫生危机。 在2 0 0 4年， 中国广东地区再次出现S A R S散发病 例， 使研究者认识到控制S A R S任务的艰巨。目前， S A R S病原体已被确定为一种新型的冠状病毒， 即 S A R S冠状病毒 1 - 6 。S A R S冠状病毒是一种正链 R N A病毒， 已测定了病毒全基因组序列 5 - 7 。一般 认为

13、S A R S冠状病毒具有四种结构蛋白： S蛋白、N 蛋白、 M蛋白与E蛋白。其中M蛋白在其它冠状 病毒中为病毒包膜的主要组成部分， 也是病毒最丰 通讯作者： 吴少庭 作者单位： 1 .华中科技大学同济医学院生物化学与分子生物学系， 武汉 4 3 0 0 3 0； 2 .深圳市疾病预防控制中心分子生物室， 深圳5 1 8 0 2 0； 3 .华南农业大学动物医学系， 广州5 1 0 0 8 9 0011 中 国 人 兽 共 患 病 杂 志 C h i n e s e J o u r n a l o f Z o o n o s e s 2 0 0 5，2 1（1 2） 富的蛋白， 为了进行S A

14、 R S冠状病毒的下一步研究 及其疫苗的研制开发， 我们克隆了S A R S冠状病毒 的M蛋白基因并实现了其在大肠杆菌中的表达并 将其纯化。 1 材料与方法 1 . 1 病毒株、 大肠杆菌菌株和质粒 S A R S冠状病 毒为深圳市疾病预防与控制中心微生物检验科何雅 青副主任技师惠赠。大肠杆菌菌株D H 5 、 B L 2 1 （D E 3） p l y s S为本室保存。p MD 1 8 - T载体购于大连 宝生物公司， p E T 2 3 a表达载体购自N o v a g e n公司。 1 . 2 主要试剂和工具酶 d N T P、T a qD N A聚合 酶、 标准分子量蛋白购于P r

15、o m e g a公司； 病毒R N A 纯化试剂盒Q I A a m pV i r a lR N A M i n iK i t系美国 Q I A G E N公司生产；R T - P C R试剂盒T a K a R aR N A P C RK i tV e r 2 . 1 D N A凝胶回收试剂盒、T 4 D N A连 接酶、 S a lI，B a mH I限制性内切酶、 标准D N A分子 量M a r k e r购于大连宝生物公司； 质粒D N A抽提试 剂盒系华大基因上海鼎安-赛北盛生物科技有限公 司产品； 异丙基硫代半乳糖苷 （I P T G） 、 S D S - N a、E D -

16、T A - N a 2、T r i s碱、 氨苄青霉素系上海生工生物工程 公司产品； H R P标记的羊抗人I g G购于P i e r c e公 司； S A R S病人康复期血清由深圳东湖医院提供； 其 它试剂为国产分析纯。 1 . 3 方法 1 . 3 . 1 病毒R N A的提取与纯化按病毒R N A纯 化试剂盒Q I A a m p ! V i r a lR N AM i n iK i t说明书进 行。 1 . 3 . 2 M基因的扩增与TA克隆 以S A R S冠状 病毒基因组R N A为摸板，按R T - P C R试剂盒试剂 盒说明书以随机引物进行反转录反应。然后使用如 下引物

17、： 5- G G AT C CA T GG C AG A CA A CG G T A C - 3 与5- G T CG A CC T GT A CT A GC A AA G C A A TA T3扩增M基因。反应体系为取1 . 5l 反转录产物， 加入1 0 *P C R缓冲液1 0 l，2 . 5 m m o l L的d N T P8l，2 5 m m o l L的M g C l 28l ， 正反向引物 各5 0 p m o lL， T a q聚合酶5 U， 补加d d H2O至总体积 1 0 0l。置P E 9 7 0 0 D N A扩 增 仪 上， 经9 4 变 性 2 m i n后在以

18、下条件下进行扩增反应：9 4 0 3s，5 2 3 0 s，7 2 5 4S， 共3 0个循环； 最后7 2 延伸5 m i n。 产物经1 . 5 %的琼脂糖凝胶电泳检测。并回收纯化 P C R产物， 克隆至p MD 1 8 - T载体中。 1 . 3 . 3 M蛋白原核重组表达质粒的构建 大量提 取重组的p MD 1 8 - T - M质粒， 分别用B a m H和 S a l双酶切切出M基因片段， 在琼脂糖凝胶电泳 后切胶回收并与同样处理的B a m H和S a l双酶 切的p E T 2 3 a连接， 转化大肠杆菌D H 5 ， 菌落P C R 鉴定阳性克隆， 抽提质粒D N A， 用

19、B a m H和S a l 双酶切双酶切进一步鉴定并转化大肠杆菌B L 2 1 （D E 3） 。 1 . 3 . 4 M蛋白的表达 接种含重组表达质粒的大 肠杆菌B L 2 1（D E 3） 于少量于含2 0 0 g m l氨苄青霉素 及2 %葡萄糖的L B培养基中， 培养至生长饱和后， 1 : 5 0转 种 并 培 养 至O D6 0 0E0 . 6，补 加I P T G至 0 . 2 m m o l L， 置2 5 诱导表达1 0 h， 离心收集菌体， 重 悬于1 *样品缓冲液中， 1 0 0 水浴处理5 m i n，1 00 0 0 g 离心1 0 m i n， 取上清进行S D S

20、-P A G E电泳分析。 1 . 3 . 5 M蛋白的纯化 接种含重组表达质粒的大 肠杆菌B L 2 1（D E 3） 于少量培养基中， 3 7 培养过 夜； 按1： 5 0稀释转入3 0 0 m lL B中，3 7 培养至 O D6 0 0E0 . 6， 补加I P T G至1 m m o l L， 置2 5 诱导 表达5 h， 离心收集菌体， 重悬于含2 0 m m o lLT r i s - C l，p H 7 . 9，5 0 0 m m o l LN a C l， 1 0 %甘油的缓冲液 中。冰浴超声裂解细菌， 4 ，2 00 0 0 g离心1 0 m i n， 收集上清。参照N O

21、 V A G E N P E T载体手册， 纯化目 的蛋白， 并进行S D S - P A G E电泳分析。 1 .3 . 6 重组M蛋白的抗原性分析在S D S- P A G E电泳后将凝胶上的蛋白转印至硝酸纤维素膜 上， 3 7 封闭2 h （P B S， 3 %脱脂奶粉，0 . 0 5 %吐温 2 0） 。一抗 （混合的1 0份S A R S病人恢复期血清） 用 封闭液1 : 1 0 0稀释， 4 作用过夜，P B S T （P B S， 0 . 0 5 %吐温2 0） 洗4次。酶标二抗为封闭液1 : 5 0 0 0稀释的H R P标记的羊抗人I g G，3 7 作用2 h。 D A B

22、显色，P B S终止反应。 2 结果 2 1 M基因的扩增与克隆 从S A R S冠状病毒基 因组R N A扩增出大小接近7 0 0b p的D N A片段， 与 预期的大小 （6 7 5 b p） 一致 （图1） 。将鉴定后的 p MD 1 8 - T - M进行测序分析并与G e n B a n k中已报道 的S A R S冠状病毒M蛋白基因编码序列比较， 与 G u a n等 （A Y 3 0 4 4 9 1） 的报道一致； 但与其他多数报 道比较， 在第1 8 9位有一无义突变 （C“G） 。 2 . 2 原核重组表达质粒的构建与鉴定 重组质粒的 双酶切获得了大小接近7 0 0 b p的

23、插入片段， 与预期 的一致 （图2） 。 2 . 3 重组M蛋白的表达表达的重组菌的裂解液 经S D S - P A G E分离、 染色后， 在约2 7 k D处出现一条 新生蛋白带 （图3） ， 与预期的一致 （M蛋白本身约 2 5 k D， 加上载体上C端的H i s 6 T a g及N端的T 7 T a g约为2 7 k D） 。 2 . 4 重组M蛋白的纯化含M蛋白的融合蛋白 1011 2 0 0 5，2 1（1 2） 中 国 人 兽 共 患 病 杂 志 C h i n e s e J o u r n a l o f Z o o n o s e s 的超声裂解液上清经N i + 2 螯

24、合层析后得到纯化 （图 3） 。 2 . 5 重组M蛋白的W e s t e r nb l o t分析纯化的重组 蛋白M的W e s t e r n b l o t分析表明在约2 7 k D处出现识 别条 带， 正常人血清未出现特异性条带 （图4） 。 图1 M基因的R T - P C R扩增图 1，M基因R T - P C R；M， 标准分子量D N A F i g . 1 P C Ro fM 1，R T - P C Ro fMg e n e；M，D N AM a r k e r 图2重组质粒P E T 2 3 a - M的酶切鉴定 1，p E T 2 3 aB a m H +S a l消

25、化；2，P E T 2 3 a - M B a m H+S a l消化；M 1、M 2，标准分子量D N A F i g . 2 I d e n t i f i c a t i o no fP E T 2 3 a - Mb yr e s t r i s t i v ee n z y L ed i - g e s t i o n. 1，P E T 2 3 ad i g e s t e dw i t hB a m Ha n dS a l，2， P E T 2 3 a - Md i g e s t e dw i t hB a m Ha n dS a l，M 1、 M 2，D N AM a r k e

26、 r . 图3重组M蛋白的电泳图谱 1， 未经I P T G诱导；2，B L 2 1 （D E 3） 经I P T G诱导；3， P E T 2 3 a - M未经I P T G诱导；4，P E T 2 3 a - M经；I P T G 诱导， 5， 纯化后的M蛋白 ，M，标准分子量蛋白； F i g . 3 S D S - P A G Eo f r e c o L b i n a n tMp r o t e i n M，P r o t e i nm a r k e；1，B L 2 1 （D E 3） w i t h o u t I P T G i n d u c - t i o n；2，B

27、L 2 1（D E 3）w i t h I P T G i n d u c t i o n；3， p E T 2 3 a - Mt r a n s f o r m a n t sw i t h o u t I P T Gi n d u c t i o n；4， M，p E T 2 3 a - Mt r a n s f o r m a n t sw i t hI P T Gi n d u c t i o n . 5， Mp r o t e i na f t e r p u r i f i c a t i o n . 图4 M蛋白免疫印迹图谱 M， 标准分子量蛋白；2 . S A R S血清识别；

28、1， 正常血清 识别 F i g . 4 W e s t e r nB l o t o f p E T 2 3 a - M M，P r o t e i nm a r k e r；2，r e c o g n i z e db yS A R Sp a t i e n t s e r u m. 1，r e c o g n i z e db yn o r m a l s e r u m. 3 讨论 在已往进行的冠状病毒研究中， 冠状病毒的保 护性抗原主要有S蛋白、 N蛋白与M蛋白。M蛋白 是其中最保守的一种蛋白， 并决定着病毒体的多形 态性。M蛋白在成熟的病毒颗粒中位于病毒颗粒 的表面并与N蛋白相互作

29、用 8 。S A R S冠状病毒 M蛋白全长2 2 1个氨基酸， 等电点为9 . 3。氨基酸 序列分析表明S A R S冠状病毒M蛋白含有三个跨 膜区而不含信号肽， 其C末端的1 2 1个氨基酸位于 病毒粒子内部， 推测为与病毒核衣壳相互作用的部 分。在本研究中， 参考G e n B a n k中S A R S冠状病毒 M蛋白的基因序列设计引物， 从S A R S冠状病毒 R N A中扩增M蛋白基因， 对M蛋白进行克隆、 表 达和纯化分析。所得结果表明， 采用R T - P C R扩增 出M蛋白的基因片段， 经克隆和测序分析后， 被亚 克隆至原核表达载体p E T 2 3 a， 成功构建了S

30、A R S冠 状病毒M蛋白的原核重组表达质粒P E T 2 3 a - M。 在大肠杆菌B L 2 1（D E 3） p l y s S中对p E T 2 3 a - M进行 表达， S D S - P A G E上表达条带条带较弱， 但在亲和层 析获得一相应分子量大小的纯化蛋白条带， 且能被 S A R S病人血清识别。表明此蛋白确为M蛋白。 表达较弱可能与M蛋白内部含有一个疏水性区域 而对大肠杆菌宿主细胞具有细胞毒性有关。下一步 研究将分析该蛋白对S A R S的诊断价值及其诱导的 细胞和体液免疫应答的效果， 从而S A R S的诊断和 防治研究提供科学依据。 参考文献： 1 世界卫生组织

31、.严重急性呼吸综合征 （S A R S） -累计报告可能病 例数 E BO L2 0 0 3 - 0 7 - 1 1. H t t： w w w.w p r o . w h o . i n ts a r s c h nS A R S C u m u l a t i v e C a s e R e p o r t . 2 K s i a z e kT G，E r d m a nD，G o l d s m i t hC S，e t a l . An o v e l c o r o n a v i r u s a s s o c i a t e dw i t hs e v e r ea c u t

32、er e s p i r a t o r ys y n d r o m eJ.N E n g lJ M e d，2 0 0 3，3 4 8 （2 0） ： 1 9 5 3 - 6 6 . （下转第1 0 6 7页） 2011 中 国 人 兽 共 患 病 杂 志 C h i n e s e J o u r n a l o f Z o o n o s e s 2 0 0 5，2 1（1 2） 图6重组质粒P G E X - 4 T - 1 -C sT P双酶切、 P C R鉴定 M 1：D L 2 0 0 0分子量标记M 2：D L 7 5 0 0分子量标记 1： 重组质粒P G E X - 4

33、T - 1 -C sT PP C R扩增2； 重组质粒 P G E X - 4 T - 1 -C sT PE c o R、X h o双酶切3； 空质粒 P G E X - 4 T - 1 -E c o R、X h o双酶切 F i g . 6T h ei d e n t i f i c a t i o no ft h eP G E X - 4 T - 1 -C sT Pb yP C R a L p l i f i c a t i o na n dd i g e s t i o nw i t hr e s t r i c t i o ne n z y L e 产生相应抗体， 有学者用虫体石蜡、

34、冰冻切片免疫荧 光抗体方法研究虫体的抗原定位， 结果虫肠粘膜上 皮细胞处的荧光最为明显， 示此处的抗原性最强。 吴中兴等用免疫金银染色法对虫体的切片进行抗原 定位的研究， 在虫体的肠管和皮层有明显的金银颗 粒沉着 4 。国外也有学者将一些血吸虫表膜相关 蛋白作为候选诊断和疫苗分子 5 - 6 。由此本实验所 发现的华支睾吸虫表膜相关蛋白作为华支睾吸虫 病诊断分子的意义值得探讨。进一步实验可以用免 疫组化方法判定T P是否定位在华支睾吸虫成虫皮 层， 进行T P的免疫反应性、 免疫原性和作为华支睾 吸虫病特异诊断分子的研究。 本研究通过对本室构建的华支睾吸虫成虫全长 c D N A质粒文库的随机

35、测序获得了一个具有完整阅 读框的新基因c D N A序列。通过生物信息学分析， 该c D N A序列的推导氨基酸序列与日本血吸虫和曼 氏血吸虫的表膜蛋白、 表膜相关抗原等相似性和同 源性较高， 暂把此新基因命名华支睾吸虫T P基因， 并成功 构 建 了 原 核 重 组 表 达 质 粒P G E X - 4 T - 1 - C sT P， 为进一步研究其结构和功能奠定了基础。 参考文献： 1 张锡林， 徐文岳， 段建华， 等.斯氏肺吸虫和华支睾吸虫基因组多 态D N A的初步分析 J .第三军医大学学报，2 0 0 0，2 2：8 6 5 . 2 李孜， 余新炳， 吴忠道， 等.日本血吸虫新基因

36、精氨酸酶的扩增及 序列分析 J .中国公共卫生，2 0 0 4，2 0 （2） ： 1 5 0 . 3 裴福全.华支睾吸虫病诊断抗原研究进展 J .中国寄生虫学与 寄生虫病杂志， 1 9 9 8，1 6 （4） ： 3 0 4 . 4 刘宜升， 陈明.华支睾吸虫的生物学和华支睾吸虫病防治 M . 北京： 科学出版社， 1 9 9 8：6 0 . 5A m r M S h a b a a n 1，M a g d y M M o h a m e d，M o h g aS A b d a l l a h，e t a l . C l o n i n ga n d c h a r a c - t e r

37、 i z a t i o no f aS c h i s t o s o m am a n s o n i1 Ha n d 3 0 Sc l o n e s a s t w o t e g u m e n t a l v a c c i n ec a n d i - d a t ea n t i g e n sJ. A c t a B i o c h i mP o l，2 0 0 3，5 0 （1） ： 2 6 9 . 6 L iY，A u l i f fA，J o n e sMK，e t a l . I m m u n o - g e n i c i t ya n d i m m u n o

38、 l o c a l - i z a t i o n o f t h e 2 2 . 6k D a a n t i g e n o fS c h i s t o s o m a j a p o n i c u mJ. P a r a - s i t e I m m u n o l，2 0 0 0，2 2 （8） ： 4 1 5 收稿日期： 2 0 0 4 - 1 2 - 2 0； 修回日期：2 0 0 5 - 0 3 - 0 2 （上接第1 1 0 2页） 3D r o s t e nC，G u n t h e rS，P r e i s e rW，e t a l . I d e n t i f

39、 i c a t i o no f an o v e l c o r o n a v i r u s i np a t i e n t sw i t hs e v e r ea c u t er e s p i r a t o r ys y n d r o m e J. NE n g l JM e d，2 0 0 3，3 4 8 （2 0） ： 1 9 6 7 . 4R o t aP A，O b e r s t eM S，M o n r o eS S，e ta l .C h a r a c t e r i z a t i o no fa n o v e l c o r o n a v i r

40、u s a s s o c i a t e dw i t h s e v e r e a c u t e r e s p i r a t o r y s y n d r o m e . JS c i e n c e，2 0 0 3， 3 0 0 （5 6 2 4） ： 1 3 9 4 . 5 Q i nE，Z h o uQ，Y uM，e ta l . Ac o m p l e t es e q u e n c ea n dc o m p a r a t i v e a n a l y s i s o fS A R S - a s s o c i a t e dv i r u s （I s o

41、l a t eB J 0 1） J. C h i n e s eS c i - e n c eB u l l e t i n，2 0 0 3，4 8 （1 0） ： 9 4 1 - 9 4 8 . 6 祝庆余， 秦鄂德， 王翠娥， 等.非典型肺炎病例标本中新型冠状病 毒的分离与鉴定 J.中国生物工程杂志， 2 0 0 3，2 3 （4） ： 1 0 6 - 1 1 2 . 7M a r r aMA，J o n e s S J M，A s t e l l C R， e t a l . T h eC o m p l e t eS e q e n c eo f T h eS A R S - A s

42、s o c i a t e dC o r o n a v i r u s . J S c i e n c e，2 0 0 3，3 0 0 （5 6 2 4） ： 1 3 9 9 - 1 4 0 4 . 8 N a r a y a n a nK，M a e d aA，M a e d a J，e t a l . C h a r a c t e r i z a t i o no fC o r o n - a v i r u sMP r o t e i na n dN u c l e c a p s i di n t e r a t i o ni nI n f e c t e dC e l l s J. J V i r o l，2 0 0 0，7 4 （1 7） ：8 1 2 7 - 8 1 3 4 . 收稿日期： 2 0 0 5 - 0 1 - 2 7； 修回日期：2 0 0 5 - 0 5 - 1 6 7601 2 0 0 5，2 1（1 2） 中 国 人 兽 共 患 病 杂 志 C h i n e s e J o u r n a l o f Z o o n o s e s