SCT 3023-2004 麻痹性贝类毒素的测定 生物法.pdf

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1、I CS B 5 0 6 7 . 0 5 0 SI : 中 华 人 民 共 和 国 水 产 行 业 标 准 S C / T 3 0 2 3 -2 0 0 4 麻痹性贝类毒素的测定 D e t e r mi n a t i o n o f p a r a l y s i s s h e l l f i s h p o i s o n 生物法 Bi o a s s a y 2 0 0 4 一 0 1 一 0 7 发布 2 0 0 4 一 0 3 一 0 1 实施 中华人 民共和 国农业部 发 布 s C /r 3 0 2 3 -2 0 0 4 麻痹性贝类毒素的测定生物法 范 围 本标准规定了麻痹性

2、贝类毒素（ P S P ） 的测定方法生物法。 本标准适用于软体动物贝类可食部分中麻痹性贝类毒素（ P S P ） 的测定， 其他贝类食品中P S P的测 定可参照执行。 2 原理 根据小鼠注射贝类抽取液后的死亡时间， 查出鼠单位， 并按小鼠体重， 校正鼠单位， 计算确定每 1 0 0 g 贝肉内的P S P的含量。所测定结果代表存在于贝肉内各种化学结构的麻痹性贝类毒素的总量。 3 定义 下列定义适用于本标准。 鼠单位m o u s e u n i t , M U 对体重为2 0 g 的小鼠 腹腔注射1 m L麻痹性贝类毒素后， 小鼠在1 5 m i n 时死亡所需的最低毒素量。 4 试剂 4

3、 . 1 盐酸溶液： 0 . 1 m o l/ L . 4 2 盐酸溶液： 5 m o l / L o 4 . 3 氢氧化钠溶液： 0 . 1 m o l 几 。 4 . 4 麻 痹性贝 类毒素（ S a x i t o x in ) 标准溶液： 1 0 0 rt g / m L ， 经酸化， 含有2 0 的乙醇作为保护剂， 冷藏保 存， 无限期稳定。 5 仪器和设 备 5 . 1 均质器。 5 . 2 天平（ 感量0 . 1 g ) . 5 . 3 离心机。 5 4 p H计。 5 . 5 秒表。 5 . 6 玻璃皿： 烧杯、 量筒、 容量瓶、 搅拌棒等。 5 . 7 注射器： 1 m l

4、. 5 . 8 注射器针头： 8 # 。 5 . 9 小鼠： 体重为1 9 g -2 1 g 的健康I C x系雄性小鼠， 若体重1 9 g 或2 1 g ， 查表C . 1 的校正系数便 可得到实际的死亡时间， 体重 2 3 g 或已用过的小鼠则不能使用。 6 IC R系小鼠毒性单位的确定 6 . 1 P S P 工作标准溶液 用移液管取1 0 0 p g / m L , S a x i to x in 标准液1 M L于1 0 0 M L 容量瓶中， 加人用盐酸酸化至州 为3 的蒸馏 S C / T 3 0 2 3 -2 0 0 4 水并定容。 该液为1 p g / m L S a x i

5、 to x in 标准液， p H 在2 . 0 一 4 . 0 之间。 在3 一 4 条件下能 稳定数周。 6 . 2 测定用标准溶液 分别用1 0 m L , 1 5 m L , 2 0 m L , 2 5 m L 和3 0 m L 水 稀释1 0 m L 浓度为1 p g / m L 的S a x it o x i n 标准液， 稀释液的p H应为2 - 4 a 6 . 3 中值死亡时间的标准液选择 6 . 3 . 1 将按6 . 2 配制的各浓度的标准稀释液各 1 M L 腹腔注射小鼠数只， 选择中值死亡时间为5 m i n - - 7 m in 的浓度。如某浓度稀释液已达到要求， 还

6、需以1 m L水的增减量进行补充稀释试验。 例如： 用2 5 m L水稀释的1 0 M L标准液在5 min 一7 min 杀死小鼠， 还需进行2 4 mL + 1 0 m L和2 6 m L 十1 0 m L的稀释度的试验。 6 . 3 . 2 先将小鼠 称重（ 精确到0 . 5 g ) ， 以1 0 个小鼠 为一组。 用中 值死亡时间 在5 m in - m in 内 的各 种 浓度的标准稀释液两份（ 最好是兰 份） 注射小鼠， 测定并记录每只小鼠腹腔注射完毕至停止呼吸的所需 死亡时间。 6 . 3 . 3 记录注射完毕至死亡时间的最短间隔为 5 s ， 即 7 s 记为 5 s , 8

7、s 记为 l o s （ 见附录 B ) o 6 . 4 毒素转换系数（ C F ） 的计算 6 . 4 . 1 小鼠中值死亡时间的选择 若注射某浓度标准稀释液的1 0只小鼠中值死亡时间5 m in 或7 m i n 则弃去该组结果； 若注射另 一浓度标准稀释液的1 0 只小鼠中值死亡时间在5 min -7 m in ， 即使个别小鼠死亡时间5 m i n 或 7 m in ， 也应使用该组的数据。但是若注射某浓度标准稀释液后， 1 0只小鼠中有3 只以 L 存活， 则要另取 1 0只小鼠进行重复试验。 6 . 4 . 2 校正鼠单位（ A) 根据注射毒素后中值死亡时间为5 m i n -7

8、m in的1 0 只小鼠的个别死亡时间， 由附录B分别查出鼠 单位（ M) ， 再由附录c查出小鼠的重量校正因子（ k ) ， 每毫升标准稀释液的校正鼠单位（ A） 按公式（ 1 ) 计算。 Ak X M ， ， ( 1 ) 式中： A校正鼠单位（ MU) ； M鼠单位( MU) ； k小鼠的重量校正因子。 6 . 4 . 3 毒素转换系数（ F) 毒素转换系数（ F ） 按公式（ 2 ) 一计算。 FC I A ， ( 2 ) 式中： F毒素转换系数； C 每毫升实际 毒素 含量（ p g S A X / m 1 . ) ; A校正鼠单位（ MU ） 。 6 . 4 . 4 计算每组1 0

9、只 小鼠 的 平均毒素转换系数值仃） ， 再计算各组间的平均毒素转换系数值（ F ) ， 并 以此为标准做常规检测。 6 . 5 毒素转换系数（ F ） 值的定期检查 6 . 5 . 1 如P S P检测间隔时间较长， 每次测定时要用适当的标准稀释液注射5 只小鼠， 重新测定F值。 如果一周有几次 检测， 则用中 值死亡时间5 m in - 7 m i n 的标准稀释液每周检查一次， 测得的F值应在 原测定厂值的士 2 0 范围内。 6 . 5 . 2 若结果不符， 用同 样的 标准稀释液另外注射5 只小鼠， 综合先前注射的5 只小鼠 结果， 算出了 S C / T 3 0 2 3 -2 0

10、0 4 值。 并用同 样的 标准稀释液注射第二组1 0 只 小鼠， 将第二组求出的了 值和第一组的了 值进行平均， 即 为一个新的F值。 6 . 5 . 3 重复检查的户值通常在原结果的士 2 0 之内， 若经常发现有较大偏差， 在进行常规检测前应调 查该方法中是否存在未控制或未意识到的可变因素。 7 样品的测定 71 检样的制备 7 . 1 1 牡蜗、 蛤及贻贝 用清水彻底洗净贝类外壳， 切断闭壳肌， 开壳 ， 用清水淋洗内部去除泥沙及其他外来杂质 ， 仔细取出 贝肉， 切勿割破肉体。收集贝肉沥水5 m in ( 避免贝肉堆积） ， 捡出碎壳等杂物， 将贝肉均质。开壳前不能 加热或用麻醉剂。

11、 7 . 1 . 2 扇贝 取可食部分（ 闭壳肌） 用作检测。沥干及均质过程同7 . 1 . 1 的规定。 7 . 1 . 3 贝类罐头 将罐内所有内 容物（ 包括贝肉组织及汁液） 于均质器中均质。 大容量的罐头， 则过滤分离贝肉及汁液， 分别称重， 将固 形物和汤汁按比例混合 ， 充分均质。 7 . 1 . 4 冷冻贝类 在室温下， 使冷冻的样品（ 带壳或脱壳的） 呈半冷冻状态， 按 7 . 1 . 1 规定的方法清洗、 开壳、 淋洗、 取 肉、 均质。 7 . 2 提取 7 . 2 . 1取1 0 0 g 按7 . 1 处理的 样品于8 0 0 m L 烧杯中， 加0 . 1 m o l

12、/ L H C l 溶液1 0 0 m L 充分搅拌， 检查 p H ( p H应为2 . 0 - - 4 . 0 ) 。需要时， 可逐滴加人5 m o l / L H C l 溶液或0 . 1 m o l / L N a O H溶液调整p H ， 加碱 时速度要慢， 同时需不断搅拌， 防止局部碱化破坏毒素。 7 . 2 . 2 将混合物加热， 并徐徐煮沸5 m i n ， 冷却至室温， 调节p H至2 . 0 - - 4 . 0 ( 切勿 4 . 5 ) 。将混合物移 至量筒中并稀释至2 0 0 m L o 7 . 2 . 3 将混合物倒回烧杯， 搅拌至均质状， 使其沉降至上清液呈半透明状，

13、 不能堵塞注射针头即可， 必 要时将混合物或上清液以3 0 0 0 r / min 离心5 m i n ， 或用滤纸过滤。保留进行小鼠注射用的足量液体。 7 . 3 小鼠试验 7 . 3 . 1以 感量为0 . 1 g 的 天平将小鼠 称重并记录重量。 每个 样品注射3 只 小鼠。 7 . 3 . 2 对每只试验小鼠腹腔注射 1 m L 提取液。注射时若有一滴以上提取液溢出， 须将该只小鼠 丢弃， 并重新注射一只小鼠。 7 . 3 . 3 记录注射完毕时间， 仔细观察并用秒表记录小 鼠停止呼吸时的死亡时间（ 到小鼠呼出最后一 口 气止） 。 7 . 3 . 4 若注射样品原液后， 1 只或 2

14、 只小鼠的死亡时间大于 7 m in ， 则需再注射至少 3 只小鼠以确定样 品的毒力。 7 . 3 . 5 若小鼠的死亡时间小于 5 m in ， 则要稀释样品提取液后， 再注射另一组小鼠（ 3 只） ， 得到 5 m in - 7 m i n 的死亡时间； 稀释提取液时， 要逐滴加人0 . 1 m o l / L 或0 . 0 1 m o l / L H C I 溶液， 调节p H至2 . 0 一4 . 0 0 8 结果的计算与判断 毒力的计算 根据小鼠的死亡时间， 在附录B中查出相应的每毫升注射液的鼠单位数M， 将存活鼠的死亡时 S C / T 3 0 2 3 -2 0 0 4 间视为大

15、于 6 0 min 即相当于 0 . 8 7 5 MUo 8 . 1 . 2 若试验动 物重 量1 9 g 或 2 1 g ， 则根据附录C 查出 重量校正系数k 8 . 1 . 3 样品中 P S P的含量按公式（ 3 ) 计算。 X 一 -y k ,M ; 、 1 ) x 2 0 0 式中： X 样品中P S P 含量， 每百克样品中鼠单位（ MU/ 1 0 0 g ) ; k i每只小鼠的重量校正系数； 从 每只小鼠的鼠单位数， 鼠单位（ MU) ; D 样品提取液的稀释倍数； 2 0 0 样品量， 克（ g ) 8 . 2 毒力单位转换 样品中的毒力单位按公式（ 4 ) 计算。 F x

16、 8 0 fc g / 1 0 0 g 4 0 0 M U/ 1 0 0 式中： F毒素转换系数； 8 0 j i g / 0 0 g 样品中P S P 限量( 4 g / 1 0 0 g ) ; 4 0 0 MU / 1 0 0 g 样品中P S P限量( MU / 1 0 0 g ) o 。 。 ( 3 ) 94 ( 4 ) S C / T 3 0 2 3 -2 0 0 4 附录A （ 资料性附录） 麻痹性贝类毒素标准物质的浓度及毒性 A . 1 加拿大海洋研究所麻痹性贝类毒素标准物质的浓度 A . 1 1石房 蛤毒素（ S T X ） 的 浓度： 1 4 0 j g / m L o A

17、. 1 2 新石房蛤毒素（ N e o ） 的浓度： 1 4 0 tt g / m L o A . 1 3 膝沟藻毒 素1 ( G T X - 1 ） 的 浓度： 7 4 r g / m L o A . 1 . 4 膝沟藻毒 素2 ( G T X - 2 ） 的 浓度： 1 2 0 ti g / m L o A . 1 . 5 膝沟 藻毒 素3 ( G T X - 3 ） 的 浓度： 2 9 t g / m L . A . 1 . 6 膝沟 藻毒素4 ( G T X - 4 ) 的 浓度： 3 2 ti g / m L o 以上 6 种毒素分别贮存于 4 个安瓶瓶中， 每个安瓶中有 0 . 2

18、 m L溶解于 0 . 1 m o l / L醋酸的各种毒素 标准。 A . 2 麻痹性贝类毒素各成分的毒性强度 麻痹性贝类毒素各成分的毒性强度见表A. 1 o 表 A . 1 麻痹性贝类毒素各成分的毒性强度 成分 毒性 相对于 S T X的毒性 滩 岛 x i t o x i n 8. 3 1 0 0 Ne osa x i t o x i n 7. 3 88 GTX- 1 6. 0 7 2 GTX- 2 2. 3 2 8 GTX- 3 4 4 8 GTX- 4 4. 4 5 3 G T X - 5 ( B l ) 0 . 4 2 5 . 1 G T X - 6 ( m） 0 . 2 7 3

19、. 3 C- 1 0. 0 3 0. 36 C- 2 0. 5 6 0 G 3 0. 0 7 0. 8 C- 4 0. 2 9 3. 5 d c - S TX 5. 0 6 0 d c - Ne o 4. 7 5 7 d c - GTX- 1 3. 7 4 5 d c-GTX- 2 4. 6 5 5 d e - GTX- 3 5. 3 6 4 d c - GT X- 4 3. 7 4 5 S C A T 3 0 2 3 -2 0 0 4 附录B （ 规范性附录） 麻痹性贝类毒素死亡时间一鼠单位的关系 表 B l 麻痹性贝类毒素死亡时间一鼠单位的关系 时 间，鼠 单位 1时间 R * 1lr_1

20、u 时间 “鼠 单 位 MU MU 1 ：0 0 1 0 0 ：3 0 2. 9 8 6 : 0 0 1 . 6 0 ：1 0 6 6. 2 ：3 5 2. 8 8 ：1 5 1 . 5 4 ：1 5 3 8. 3 ：4 0 2. 7 9 ：3 0 1 . 4 8 ：2 0 2 6. 4 ：4 5 2. 7 1 ；4 5 1 . 4 3 ：2 5 2 0. 7 ：5 0 2 . 6 3 7 ; 0 0 1 . 3 9 ：3 0 1 6 . 5 ：5 5 2 . 5 6 ：1 5 1 . 3 5 ：3 5 1 3 . 9 4: 0 0 2 . 5 0 ：3 0 1 . 3 1 ：4 0 1 1

21、. 9 ：0 5 2 . 4 4 ：4 5 1 . 2 8 ：4 5 1 0. 4 ：1 0 2 . 3 8 8 : 0 0 1 . 2 5 ：5 0 9. 3 3 ：1 5 2 . 3 2 ：1 5 1 . 2 2 ：5 5 8 . 4 2 ：2 0 2 . 2 6 ：3 0 1 . 2 0 2 : 0 0 7. 6 7 ：2 5 2 . 2 1 ：4 5 1 1 8 ：0 5 7 . 0 4 ：3 0 2 . 1 6 9: 0 0 1 . 1 6 ：1 0 6 . 5 2 ：3 5 2 . 1 2 ：3 0 1 1 3 ：1 5 6 . 0 6 ：4 0 2 . 0 8 1 0: 0 0

22、1 . 1 1 ：2 0 5 . 6 6 ：4 5 2 . 0 4 ：3 0 1 . 0 9 ：2 5 5 . 3 2 ：5 0 2 . 0 0 1 1 ：0 0 1 . 0 7 5 ：3 0 5 . 0 0 ：5 5 1 . 9 6 ：3 0 1 . 0 6 ：3 5 4 . 7 3 5 ：0 0 1 . 9 2 1 2; 0 0 1 . 0 5 ：4 0 4. 4 8 ：05 1. 89 1 3: 0 0 1 . 0 3 ：4 5 4. 2 6 ： 1 0 1 . 8 6 1 4: 0 0 1. 01 5 ：5 0 4 . 0 6 ：1 5 1 . 8 3 1 5: 0 0 1 . 0 0

23、 0 ：5 5 3 . 8 8 ：2 0 1 . 8 0 3: 0 0 3 . 7 0 ：3 0 1 . 7 4 ：0 5 3 . 5 7 ：4 0 1 . 6 9 ：1 0 3 . 4 3 ：4 5 1 . 6 7 ：1 5 3 . 3 1 ：5 0 1 . 6 4 ：2 0 3 . 1 9 ：2 5 3 . 0 8 s 一 T 3 0 2 3 -2 0 0 4 表 B . 1 （ 续） 鼠单位 MU 鼠单位 NU 鼠单位 N几I 0. 9 5 43 0. 0 0 0. 9 1 7 0. 9 484 0: 0 0 0. 8 9 8 0. 9 7 2 0. 9 426 0: 0 00. 8 7 5 0. 9 34 柳1：00聊圳硼5：00 0. 9 6 50. 9 37 啊咖咖20：00 以分秒表示。