《[农业标准]-NYT553-2002 禽支原体病诊断技术.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《[农业标准]-NYT553-2002 禽支原体病诊断技术.pdf（5页珍藏版）》请在三一文库上搜索。
1、I C S 1 1 . 2 2 0 B 4 1 NY 中 华 人 民 共 和 国 农 业 行 业 标 准 N Y / T 5 5 3 -2 0 0 2 禽支原体病诊断技术 D i a g n o s t i c t e c h n i q u e s f o r a v i a n my c o p l a s mo s i s ( m y c o p l a s m a g a l l i s e p t i c u m) 2 0 0 2 一 0 8 一 2 7发布 2 0 0 2 门2 一 0 1实施 中 华 人 民共 和 国农 业 部 发 布 N Y / T 5 5 3 -2 0 0 2
2、 目 11舀 禽支原体病( a v i a n m y c o p l a s m o s i s ) 又称鸡败血支原体( m y c o p l a s m g a l l i s e p t i c u m， 简称M G ) ， 常引 起鸡的慢性呼吸道疾病。 M G也可感染火鸡， 引起传染性窦炎。 世界动物卫生组织仁 w o r l d O r g a n i z a t i o n f o r A n i m a l H e a l t h ( 英) , O f f i c e I n t e r n a t i o n a l d e s E p i z o o t i e s ( 法
3、) , O I E 将本病例B类动物疫病， 我国 将 其列为二类疫病。 本标准规定的方法与O I E 诊断试验与疫苗标准手册 推荐相应方法一致。 本标准的附录A为规范性附录。 本标准由农业部畜牧兽医局提出。 本标准由全国动物检疫标准化技术委员会归口。 本标准起草单位: 农业部动物检疫所。 本标准起草人: 郭福生、 尹燕博、 蒋正军、 孙淑芳、 陆明哲、 龚振华。 N Y / T 5 5 3 -2 0 0 2 禽支原体病诊断技术 1 范围 本标准规定了禽支原体( MG) 分离鉴定和快速血清凝集试验( R S A ) 的技术要求。 本标准适用于鸡和火鸡及其产品MG的检测。 2 禽支原体的分离和鉴定
4、 21 材料准备 2 . 1 门培养基制备见附录A( 规范性附录) 。 2 . 1 . 2 兔抗MG阳 性血清和抗免荧光抗体结合物。 2 . 2 分离 2 . 2 . 1 采样 活禽从鼻腔、 食管、 气管、 泄殖腔和交合器中取样。死禽从鼻腔、 眶下窦、 气管或气囊采样， 也可吸取 眶下窦和关节渗出物或结膜囊内冲洗物。对于鸡胚从卵黄囊内表面、 口咽和气囊采样。 2 . 2 . 2 样品的处理 采样后应尽快培养。 如须运输， 小块组织置于支原体培养基中， 拭子在培养基中用力搅拌数次， 将培 养基运回实验室尽快培养。 2 . 2 . 3 接种 将样品0 . 2 m I 一 接种于1 . 8 mI支原
5、体液体培养基中， 依次1 0 倍稀释至1 0 - 3 ， 密封， 3 T C 培养。 同时 将样品接种于支原体固体培养基中， 置于含5 %-1 0 %二氧化碳( C O Q ) 培养箱中培养。 2 . 2 . 3 . 1 每天检查液体培养基酸碱度， 一旦发现p H值变化， 立即接种于固体培养基中培养。 若培养基 酸碱度没有变化， 每隔3 d -5 d盲传一代， 共传3 代， 培养 1 0 d 后接种于固体培养基上培养 2 . 2 - 3 . 2 固体培养基上若有菌落生长， 用低倍显微镜观察菌落， 可见中央突起呈荷包蛋样( 有时不典 型) ， 需进一步作血清学鉴定。 2 . 3 鉴定 2 . 3
6、 . 1 用间接荧光抗体试验Q F A ) 鉴定MG.取 1 . 0 c m-1 . 5 c m的琼脂块， 菌落面朝上置于载玻片 上， 第一块载玻片上放一块待检分离物、 一块已知MG菌落( S 或R株) 、 一块已知其他支原体菌落， 第 二块载玻片上放一块待检分离物。 2 . 3 . 2 第一块载玻片上每块琼脂块上加一滴适当稀释的兔抗M G血清， 第二块载玻片上琼脂块上加 一滴正常兔血清。 2 . 3 . 3 琼脂块在湿盒中室温条件下反应3 0 m i n 后， 分别放到含有磷酸盐缓冲液( P B S ) ( p H 7 . 2 ) 的不同 器皿中， 冲洗 1 0 m i n ， 共冲洗 2
7、次。 2 . 3 . 4 将琼脂块放回原玻片. 吸水纸吸取过多的水分， 每块琼脂加上稀释好的抗兔荧光抗体结合物， 反 应、 洗涤同前， 最后将琼脂块放回玻片， 吸干多余水分后于人射式荧光显微镜下检查结果 2 . 4 结果判定 菌落呈现亮绿色荧光时为阳性反应， 若仅有暗淡的菌落轮廓， 与背景荧光颜色差别不大为阴性。其 他已知支原体菌落、 第二块载玻片分离物为阴性; 第一块载玻片分离物、 与己知MG菌落为阳性结果 时， 证明分离物为鸡毒支原体。 N Y / T 5 5 3 -2 0 0 2 3 快速血清凝集试验( R S A) 3 . 1 从鸡群采集的血清样品， 如不能立即进行试验， 应 4 保存
8、， 不能冻结。 3 . 2 试验用染色抗原、 阳性及阴性对照血清。 3 . 3 操作方法: 室温中加一滴( 2 0 V L ) 血清于白瓷板或玻板上， 再加等量染色抗原， 用棉签或火柴棒将 其混合， 轻轻摇动玻板使之混合均匀。试验设阳性血清及阴性血清对照。 3 . 4 结果判定: 室温条件下， 5 6 C 3 0 m i n 处理后的鸡血清2 m i n内， 火鸡血清3 m i n内判定结果。 规定 时间内， 发生完全凝集的， 判为阳性。如仅在液滴边缘部分出现凝集， 或超过2 m i n ( 火鸡 3 m i n ) 在边缘 出现凝集， 判为可疑。超过规定时间无凝集者， 判为阴性。 NY /
9、T 5 5 3 -2 0 0 2 附录A ( 规范性附录) 支原体培养墓的制备 A . 1 支原体肉汤培养基 A . 1 . 1 新鲜酵母浸出液的制备: 称取 2 5 0 g 具有活性的鲜酵母， 悬浮于1 0 0 0 m L蒸馏水中， 加热至沸 点， 冷却。 3 0 0 0 r / mi n离心2 0 mi n , T IK出上清液， 用0 . 1 mo l / L氢氧化钠( N a O H) 调p H至7 . 8 -8 . 0 。 过 滤除菌， 置4 C保存备用。 A . 1 . 2 甲液: 不含结晶紫的支原体( P P L O ) 肉 汤培养基( D i f c o ) 1 4 . 7 g
10、 ， 加蒸馏水或去离子水7 0 0 m L , A . 1 . 3 乙液: 猪血清( 5 6 灭活 3 0 m i n ) 1 5 0 m L ， 质量浓度为 2 5 %新鲜酵母浸出液 1 0 0 m l ， 质量浓度 为1 0 %葡萄糖溶液 1 0 m l ， 质量浓度为 5 %乙酸铭 1 0 m L , 2 0 0 0 0 0 I U/ m I青霉素G 5 m L ， 质量浓度为 0 . 1 %酚红2 m l 。将以上各种成品混合即乙液( 也可用犊牛血清或马血清代替猪血清) 。 将甲液经1 2 1 k P a 灭菌1 5 m i n ， 冷却后加人乙液调p H值至7 . 8 , 即为支原体肉汤培养基。 A . 2 支原体固体培养基 取不含支原体生长抑制物的纯琼脂1 0 g ， 加人到上述甲液中， 混合后如前所述高压灭菌， 置5 6 水 浴中。然后加人乙液， 小心混匀， 避免产生气泡， 然后倒人平皿中厚度约0 . 4 c m， 冷却后备用。