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1、SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 S N/ T 1 4 1 8 -2 0 0 4 鸭病毒性肝炎 I 型病毒血清中和试验 S e r u m n e u t r a l i z a t i o n t e s t f o r d u c k v i r u s h e p a t i t i s t y p e I v i r u s 2 0 0 4 - 0 6 - 0 1 发布 2 0 0 4 - 1 2 - 0 1 实施 中华人民共和匡 国家 质 量 监 督检 验 检 疫 总 婿 S N/ T 1 4 1 8 -2 0 0 4 o il台 本标准的附录A为规范性附录， 附录B为资料
2、性附录。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位: 中华人民共和国珠海出人境检验检疫局。 本标准主要起草人: 陈琅、 黄新民、 徐海聂、 杨素、 潘文波、 廖秀云。 本标准系首次发布的出人境检验检疫行业标准。 S N/ T 1 4 1 8 -2 0 0 4 鸭病毒性肝炎 I型病毒血清中和试验 范围 本标准规定了鸭病毒性肝炎 工 型病毒血清中和试验操作方法. 本标准适用于检测血清中的鸭病毒性肝炎 工 型病毒抗体。主要用于鸭病毒性肝炎的诊断及病原鉴 定 、 免疫水平 的监测和流行病学调查。 2 缩略语 下列缩略语适用于本标准。 B ME: E a g l e s B a s
3、 a l Me d i u m细胞基础盐培养基 2. 2 C P E: 细胞病变。 2 3 D E K: 鸭胚肾细胞。 2. 4 DEL: 鸭胚肝细胞 。 2. 5 D HV 一 工: 鸭病毒性肝炎工型病毒。 2. 6 F C S : 胎牛血清。 2. 7 ME M: E a g l e s Mi n i m a l E s s e n t i a l Me d i u m细胞培养基。 2 日 P F U: 空斑形成单位。 2. 9 T C I D , : : 半数细胞培养感染量. 原理 病毒感染敏感的细胞单层后， 可以在细胞单层上生长增殖， 并能产生 C P E ， 使感染细胞圆缩、 坏死
4、并形成空斑， 血清中的特异性抗体能够抑制病毒在细胞单层上生长， 血清抗体中和病毒的能力可以通过 其阻止C P E产生的程度加以测定。本中和试验是应用固定病毒量稀释血清的方法， 在D E L或D E K细 胞单层上进行中和试验， 用于鸭血清抗体的测定或病原的鉴定。 4仪器设备 4. 2 : . ; 4. 5 高压蒸气灭菌器。 可调移液器。 二氧化碳恒温培养箱。 倒置显微镜。 除菌过滤器。 S N/ T 1 4 1 8 -2 0 0 4 5材料准备 5 . 1 鸭病毒性肝炎 1 型病毒。 5 . 2 抗鸭病毒性肝炎工型病毒的阴、 阳性血清， 使用前均以5 6 灭能 3 0 mi n 后备用。 5
5、. 3 受检血清按常规方法采血并分离血清， 使用前均以5 6 灭能 3 0 m i n后备用。 5 . 4 溶液的配制: 见附录 A, 5 . 5 细胞培养板: 选用无菌的孔径为 5 c m平底带盖塑料培养皿， 或 9 6 孔平底带盖塑料培养板。 5 . 6 其他仪器: 如剪刀、 镊子、 平皿、 烧杯、 三角瓶、 刻度离心管、 注射器、 吸头等以1 1 2 k P a高压灭菌 3 0 m i n , 烘干后备用。 5 . 7 D E 工 _ 细胞单层的准备: 参见第 B . 1 章 5 . 8 D E K细胞悬液的准备: 参见第 B . 2章。 6 血清中和空斑减数试验 6 . 1 病毒毒价测
6、定及配备 取 D HV 一 工 用维持液将病毒液作 1 0 倍系列稀释， 每个稀释度接种三个培养皿， 按 7 . 2 . 4和7 . 2 . 5 的方法进行试验。取每个稀释度的三个培养皿的空斑平均数， 用 R e e d - Mu e n c h 法计算病毒的 P F U量， 使用前配制成含2 0 0 P F U / 0 . 1 mL的病毒悬液备用。 6 . 2 操作步骤 6 . 2 . 1 血清稀释及中和感作: 分别取阳性血清、 阴性血清、 受检血清样品， 用维持液作两倍系列稀释， 每 个稀释度加人等量病毒悬液， 然后置3 7 中和感作6 0 m i n ， 每个稀释度接种三个培养皿。 6
7、. 2 . 2 细胞对照: 设三个培养皿的正常细胞对照， 加入维持液。 6 . 2 . 3 病毒对照: 设三个培养皿的病毒对照， 将上述使用的病毒悬液稀释为 1 0 0 P F U/ 0 . 1 mL e 6 . 2 . 4 取已长满D E L细胞单层的细胞培养皿， 吸去培养液， 用维持液清洗两次， 将上述稀释及感作好 的混合液移人细胞培养皿内， 每个培养皿。 . 1 mL ， 加盖后轻轻摇， 使液体均匀分布于D E L细胞单层表 面， 然后置室温( 2 0 0C-2 2 0C) 感作 3 0 mi n . 6 . 2 . 5 每培养皿加人琼脂维持液 3 m L， 加盖后， 置 3 7 0 C
8、, 3 % - 5 %二氧化碳培养箱培养4 8 h ， 取出后 用偏光源( 或低倍倒置显微镜) 直接观察空斑的形成情况， 或用 1 0 %的福尔马林固定后用 1 %的结晶紫 染色观察空斑， 并记录形成空斑的数量。 6 . 3 结果判定 6 . 3 . 1 当细胞对照正常， 阳性血清效价与原滴定的效价相差 1 个滴度以内， 病毒对照的三个培养皿的 平均空斑数误差在 1 0 P F U以内时整个试验有效。 6 . 3 . 2 出现 5 0 %空斑减数的血清最高稀释倍数为该血清的抗体滴度。 微量血清 中和试验 7 . 1 病毒毒价( T C I D s a测定及配备 取D HV 一 工细胞适应毒用稀
9、释液将病毒液进行 1 0 倍系列稀释， 加入 9 6 孔培养板内， 每孔 5 0 t L, 每 个稀释 度接种八个培养孔， 然后每孔加人1 0 0 川一 的D E K细 胞悬液， 然后每孔补 加稀释 液5 0 p L 。 加 盖后， 置 3 7 C, 3 % - 5 %二氧化碳培养箱培养 9 6 h ， 取出观察并记录C P E ， 按R e e d - Mu e n c h方法计算出 病毒的丁 C I D ;， 使用前配制成含 2 0 0 T C I D ; ., i 5 0 p L的病毒悬液备用 7 . 2 操作步骤 7 . 2 . 1 血清稀释及中和感作: 分别取阳性血清、 阴性血清、
10、受检血清样品， 用稀释液作两倍系列稀释， 从 稀释度 1: 4开始每个稀释度加人等量病毒悬液， 稀释度 1， 2 的加人等量的稀释液用作血清对照， 然后 置 3 7 中和感作6 0 m i n 2 S N/ T 1 41 8 -2 0 0 4 7 . 2 . 2 将感作好的血清混合液加人 9 6 孔板内( 第 1 - 1 1 孔) ， 每孔 1 0 0 k L ， 每个稀释度需做 4 个孔， 第 1 2 孔加人 1 0 0 I L的稀释液用作正常细胞对照 然后每孔再加人1 0 0 K L的D E K细胞悬液。 7 . 2 . 3 病毒对照设立: 将病毒稀释为1 0 0 0 T C I D s
11、o / 5 0 p L , 1 0 0 T C I D s o / 5 0 p L , 1 0 T C I D ; o / 5 0 p L , 1 T C I D s o / 5 0 p L ， 每个稀释度做 4 孔， 每孔加人 5 0 fi L。 再加人 1 0 0 K L的D E K细胞悬液， 每孔补加稀释 液 5 0 f L , 7 . 2 . 4 置 3 7 0C, 3 %-5 %二氧化碳培养箱培养 9 6 h ， 取出后在低倍倒置显微镜观察并记录C P E ， 或用 1 0 写福尔马 林固 定和1 %的 结晶紫染色后观 察。 7 . 3 结果判定 7 . 3 . 1 当细胞对照和血清
12、对照正常， 阴性血清各孔出现 C P E , 阳性血清效价与原滴定的效价相差 1 个 滴度以内， 病毒对照的回归滴度与原测定滴度相差不超过 1 0 1 0 时， 整个试验有效。 : .: : 能够完全抑制病毒产生 C P E的血清最高稀释倍数为该血清的抗体中和效价。 血清抗体效价在 1 : 1 6以上( 含1: 1 6 ) 判为阳性 S N/ T 1 41 8 -2 0 0 4 附录A ( 规范性附录) 试剂配制 A. 1 水 本标准所使用的水为三重蒸馏水。 A . 2 H a n k s 平衡盐溶液 氯化钠8 . 0 g , 葡萄糖1 . 0 g , 抓化钾。 . 4 g , 磷酸氢二 钠。
13、1 2 g ， 磷酸二氢钾。 . 0 6 g , 酚红。 . 0 2 g , 抓 化钙( 含2 个水) 0 . 1 8 g 硫酸镁( 含7 个水) 0 . 2 g ， 加水至 1 0 0 0 m L , 1 1 7 高压灭菌 1 5 m i n ， 冷却后放 4 保存备用， 使用前用3 . 5 %的碳酸氢钠调整 p H值至 7 . 2 A . 3 H a n k s 无钙、 镁平衡盐溶液 氯化钠8 . 0 g , 葡萄糖 1 . 0 g , 氯化钾 。 . 4 g , 磷酸氢二钠 。 . 1 2 g , 磷酸二氢钾0 . 0 6 g , 酚红 。 . 0 2 g ， 加 水至1 0 0 0 m
14、 L , 1 1 7 高压灭 菌1 5 m i n ， 冷 却后放4 保存备用， 使用前用3 . 5 % 的碳酸氢 钠调整p H值 至 7 . 2 . A . 4 胰酶消化液 用 H a n k s 无钙、 镁平衡盐溶液配成 。 . 1 2 5 0 a 溶液， 经过滤除菌后分装， 存放一2 0 备用。 A ， 5 抗菌素溶液 选用庆大霉素， 按每毫升含 1 万单位用水配制， 放 4 保存备用。 A . 6 细胞培养液 为购买的成品ME M培养基， 按说明配制， 放 4 保存备用， 使用时按 1 0 %的F C S , 2 mm o l / L谷 ( 氨) 酞 胺、 。 . 1 7 %的碳酸 氢
15、钠和1 %的 抗菌素 溶液加人配成细胞培养液。 A . 7 维持液 为购买的成品ME M培养基， 按说明配制， 放 4 保存备用， 使用时加人 1 %的抗菌素溶液。 A . 8 琼脂维持液 为购 买的 成品M E M培养基， 按说明两倍量配制成2 X的M E M培养液， 使用时按4 % 加人鸡血清 和 找0 . 2 %加人F C S ， 然后再与等量的2 % 琼脂溶液混合， 并使混合液温度保持在4 5 左右备用。 A . 9 稀释液 为购买的成品B ME ( E a g l e s B a s a l Me d i u m) 培养基， 按说明配制， 放4 保存备用， 使用时加人1 % 的抗菌素
16、溶液。 A . 1 0 细胞生长液 为购买的成品 B ME ( E a g l e s B a s a l Me d i u m) 培养基， 按说明配制， 放 4 保存备用， 使用时按 1 0 % 的胰蛋白膝磷酸盐培养液( T r y t o s e p h o s p h a t e b r o t h ) , 2 m mo l / L谷( 氨) 酞胺, 0 . 1 7 %的碳酸氢钠, 1 % 的抗菌素溶液和 4 %的鸡血清加入配成细胞生长液。 4 S N / T 1 4 1 8 -2 0 0 4 附录B ( 资料性 附录) 原代细胞制备 B. 1 DE L细胞单层准备 选用来自健康种鸭群的
17、1 4 d -1 7 d的鸭胚， 用碘酒和酒精消毒蛋壳表面， 打开气室， 以灭菌镊子取 出鸭胚， 放在灭菌平皿内， 剖腹取出肝脏( 去除胆囊) 。 放于烧杯内用 Ha n k s 平衡盐溶液冲洗三次， 用灭 菌剪刀剪碎， 再用 Ha n k s 平衡盐溶液冲洗三次( 加人溶液后让组织块 自然下沉， 再将溶液倒出) ， 尽可 能去除血液; 然后加入5 倍1 0 倍于组织碎块的量的胰酶消化液， 置3 7 水浴消化2 0 mi n ， 吸去胰酶消 化液， 加人细胞培养液洗涤两次， 然后加入细胞培养液， 轻轻吹打， 使其完全分散( 使肉眼不能看到组织 碎块为止) 。移人刻度离心管， 以5 0 0 r
18、/ mi n 离心 1 m i n ， 取细胞泥， 按每毫升含 1 . 5 X1 0 个细胞的比 例用细胞培养液稀释， 然后加人培养皿， 每个培养皿 5 m L ， 加盖后置含5 %二氧化碳的 3 7 1C培养箱培 养。4 8 h -7 2 h长成细胞单层备用。 B . 2 D E K细胞悬液的配备 选用来自健康种鸭群的2 2 d -2 5 d的鸭胚， 用碘酒和酒精消毒蛋壳表面， 打开气室， 以灭菌镊子取 出鸭胚， 放在灭菌平皿内， 剖腹取出肾脏， 放于烧杯内用 Ha n k 。平衡盐溶液冲洗三次， 用灭菌剪刀剪 碎， 再用 Ha n k s 平衡盐溶液冲洗三次( 加人溶液后让组织块自然下沉， 再将溶液倒出) ， 尽可能去除血 液; 然后加人 5 倍1 0倍于组织碎块的量的胰酶消化液， 置3 7 水浴消化 2 0 m i n ， 吸去胰酶消化液， 加 人细胞生长液洗涤两次， 然后加人细胞生长液， 轻轻吹打， 使其完全分散( 使肉眼不能看到组织碎块为 止) 。移人刻度离心管， 以5 0 0 r / mi n 离心 1 0 m i n ， 取细胞泥， 按每毫升含3 X1 0 “ 个细胞的比例用细胞 生长液稀释 ， 配成细胞悬液备用 。