《一氧化氮合酶抑制剂抑制吗啡依赖及戒断大鼠脊髓神经元ERK的表达.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《一氧化氮合酶抑制剂抑制吗啡依赖及戒断大鼠脊髓神经元ERK的表达.pdf（5页珍藏版）》请在三一文库上搜索。
1、一氧化氮合酶抑制剂抑制吗啡依赖及戒断 大鼠脊髓神经元 ERK 的表达 刘海林1， 2， 曹君利2， 曾因明2， 戴培静1， 郑国龙1 （1. 南京医科大学附属淮安市第一人民医院， 江苏 淮安 223300； 2. 江苏省麻醉学重点实验室， 江苏 徐州 221002） 中国图书分类号： R-332； R 322. 8； R 322. 81； R 345. 44； R 345. 57； R 394. 2； R 749. 61； R 914. 3； R 977. 3 文献标识码： A 文章编号： 1001 -1978 （2005） 11 -1308 -05 摘要： 目的 探讨鞘内分别注射非选择性一氧
2、化氮合酶 （NOS） 抑制剂 L-NAME、 选择性神经元型一氧化氮合酶 （nNOS） 抑制剂 7-硝基吲哚 （7-NI） 对吗啡戒断大鼠戒断症状 和痛敏行为以及脊髓神经元 p-ERK 表达的影响。方法 采 用吗啡依赖及戒断模型， 分为正常对照组、 依赖组、 戒断组、 L-NAME 组 （L-NAME） 、 7-NI 组 （7-NI） ， 分别作行为学评分 （n =8） 、 免疫组织化学 （n =6） 和免疫印迹检测 （n = 4） 。结果 实验结果表明， 鞘内注射 L-NAME、 7-NI 可明显减轻吗 啡依赖大鼠戒断症状， 戒断组戒断症状评分为 28. 6 4. 89， L-NAME 组、
3、 7-NI 组分别为 22. 1 4. 52 （P 0. 05） 、 16. 2 3. 99 （P 0. 01） ； 戒断组促诱发痛评分 （touch evoked agitation scores， TEA score） 为 13. 5 2. 55， L-NAME 组、 7-NI 组分别为 9. 8 3. 11 （P 0. 05） 、 7. 5 2. 56 （P 0. 01） 。鞘内注射 L-NAME、 7-NI 可明显减少胸腰段脊髓背角 Fos 阳性神经元 的数目，L-NAME 组、 7-NI 组分别为 293 47、 267 52， 均低 于戒断组 （380 71， P 0. 05， P
4、 0. 01） 。L-NAME、 7-NI 组 p-ERK 阳性神经元的数目分别为 46. 8 11. 58、 40. 5 8. 55， 均低于戒断组 （66. 6 11. 6， P 0. 05， P 0. 01） ， 两给 药组脊髓 p-ERK 蛋白的表达也减少。 Western blot 显示： 收稿日期： 2005 -06 -28， 修回日期： 2005 -08 -29 基金项目： 国家自然科学基金资助项目 （No 30200267） 、 江苏省教委 自然科学基金资助项目 （No 01KJD320036） 、 江苏省淮安 市 2005 年科技发展计划 （No HAS05029） 作者简介
5、： 刘海林 （1972 - ） ， 男， 硕士生， E-mail： liuhailin-1971 163. com 曹君利 （1968 - ） ， 男， 博士， 研究方向： 药物依赖， 通讯作 者 鞘内注射 NOS 明显抑制吗啡戒断大鼠脊髓 p-ERK 蛋白表达 增加。结论 脊髓水平 NO 参与吗啡依赖和戒断反应， ERK 信号通路可能介导 NO 的上述作用。 关键词：吗啡依赖及戒断； 脊髓； 一氧化氮合酶； 细胞外信号 调节激酶 药物依赖性可分为精神依赖性 （psychological dependence） 和躯体依赖性 （physical dependence） ； 精神依赖性是药物成瘾
6、的主要原因。由于这一观点 的存在使得对于躯体依赖性的研究缺乏应有的重 视。躯体依赖性是指反复使用具有依赖性潜能药物 所造成的一种适应状态， 用药者一旦停药或使用药 物受体拮抗剂， 将发生一系列生理功能紊乱，并出 现戒断综合征 （withdrawal syndrome） 。 丝裂原活化蛋白激酶 （mitogen-activated protein kinases，MAPKs） 是一组细胞内广泛存在的丝/ 苏氨 酸蛋白激酶， 细胞外信号调节激酶 （extracellular sig- nal-regulated kinase， ERK） 是主要的 MAPK 通路之 一。由其介导的胞内信号转导、 在
7、细胞分化、 生长发 育、 神经元可塑性及多种生理病理过程中发挥重要 作用。在多种疼痛模型中发现 ERK 信号通路参与 脊髓水平伤害性信息调制和中枢敏感化的形 成 1， 2。研究表明 ERK 信号通路在吗啡依赖过程中 发挥重要作用， ERK 的激活可触发 -阿片受体磷酸 化和脱敏感化 3。NO 是一种具有高反应性的自由 基，参与了机体多种生理和病理过程。NOS 是 NO 合成的关键酶， 根据其存在方式及作用特点分为内 of NO3 - . The levels and activity of interleukin-1 （IL- 1）and tumor necrosis factor- （TNF
8、-）secreted by M were measured using enzyme linked immunoassay （ELISA）and biological activity assay. Results Lb- Gp4 and LbGp4-OL （10 100）mgL -1 increased the contents of neutral red dye phagocytized by resting M and the CRBC phagocytosis index of starch activated M was also elevated. The levels of N
9、O， IL-1 and TNF- produced by resting M were promoted after incubation of resting M with LbGp4 or LbGp4-OL. The biological activity of IL-1 and TNF- were aug- mented toward L929 cell and mouse thymocyte as target cells respectively. Conclusions LbGp4 and LbGp4- OL enhanced the phagocytic and secretor
10、y functions of M， which suggested that M is also the main immune effective target cell of LbGp4 and LbGp4-OL. Key words： lycium barbarum polysaccharides；glyco- conjugate；glycan；macrophage；target cell 8031中国药理学通报 Chinese Pharmacological Bulletin 2005 Nov； 21 （11） ： 1308 12 皮型、 神经元型和诱导型三种类型。NO/ cGMP 信
11、 号转导通路在吗啡依赖和戒断中发挥重要作用 4， 最近有报道细胞内 NO/ cGMP/ PKG 信号通路可能 参与调节 ERK 的活性， 最终导致了基因表达的改 变 5。 吗啡依赖大鼠纳络酮催促戒断前鞘内分别注射 L-NAME、 7-NI， 观察大鼠戒断反应变化； 采用免疫组 织化学检测 Fos 表达以反应吗啡依赖和戒断过程中 脊髓神经元敏感化的程度； 用免疫组织化学和 Western blot 方法检测脊髓神经元 p-ERK 的表达； 探 讨一氧化氮合酶抑制剂对脊髓 ERK 表达的调节作 用。 1 材料和方法 1.1 实验动物及试剂 + Sprague-Dawley 大鼠， 体 重 200
12、250 g， 由徐州医学院实验动物中心提供。 吗啡系沈阳第一制药厂产品 （批号 020903） ； 纳洛 酮、 L-NAME、 7-NI 系 Sigma 公司产品； c-fos 抗体、 p- ERK 抗体购于美国 Santa Cruz 生物技术公司。免疫 组化试剂盒由北京中杉生物技术公司提供。 1. 2 鞘内注射 6 鞘内给药采用直接注射给药 法： 取 L5 -6腰椎间隙， 局部剪毛， 2%利多卡因0. 3 ml 局麻后 7. 5 号针头破皮， 使用 25 l 微量注射器刺 入蛛网膜下腔， 出现典型鼠尾侧向甩动和抖动视为 穿刺成功。所有动物药物注射总量均为 10 l。对 照组分别注射生理盐水，
13、 各用药组大鼠腹腔注射纳 洛酮 4 mgkg -1激发吗啡戒断症状。 1.3 动物模型和实验分组 大鼠先被分为 2 组， 分 别皮下注射吗啡和生理盐水， 吗啡首日每次 10 mg kg -1， 每日两次， 隔日每次增加10 mgkg-1， 至第 6 天末次注射 50 mgkg -1， 建立吗啡依赖模型； 生 理盐水组注射同体积的生理盐水。末次注射后4 h， 两组中的部分大鼠被留下作为正常对照组和吗啡依 赖组， 其余大鼠腹腔注射纳洛酮 4 mgkg -1建立吗 啡戒断模型， 在纳洛酮激发戒断前30 min， 鞘内分别 注射 L-NAME 400g、 7-NI 400 g （溶于 10 l 的 C
14、remophor 中） ， 对照组动物鞘内注射等容 Cremo- phor， 因此， 吗啡戒断模型大鼠又被分为 3 组， 即吗 啡戒断组、 L-NAME 组、 7-NI 组。 1. 4 戒断症状评分 在纳洛酮激发戒断后的 1 h 内根据湿狗样抖动、 异常姿势、 激惹症状、 咬牙、 植物 神经系统症状、 体重降低等进行戒断症状评分。 1. 5 吗啡戒断致痛觉异常 （allodynia） 评分 7 用 一根玻璃棒轻轻接触大鼠肋腹部， 根据大鼠对这种 非伤害性轻触刺激引起的反应对吗啡戒断致痛觉异 常进行评分。0 分： 对轻触刺激无反应； 1 分： 轻触刺 激后发出中度嘶叫并试图逃避接触； 2 分：
15、轻触刺激 后发出重度嘶叫并撕咬玻璃棒。戒断后 1 h 内每 5 min 评分 1 次。 1. 6 免疫组织化学 吗啡戒断后 1 h， 腹腔注射戊 巴比妥钠麻醉， 经升主动脉先灌注 100 ml 冰冷的生 理盐水， 再灌注 400 ml 4%冰冷多聚甲醛溶液 （溶于 0. 1 molL -1 PB，pH 7. 4） 。取脊髓 L4 L5后固定 3 h 后， 转入 30% 的蔗糖溶液 （溶于 0. 1 molL -1 PB） ， 4 过夜。连续冰冻切片 （40 m） ， 在 0. 3% Triton X-100 PBS 液中浸 30 min， 然后分别依次加入 Fos 一抗 （1: 400） 或
16、p-ERK （1 : 200） 一抗 4孵育 48 h； 生物素标记羊抗兔 IgG （二抗， 1 : 200） 或生物 素标记羊抗鼠 （二抗， 1 : 100） ， 和 AB 复合液 （1 : 200， 37， 1 h）37孵育 1 h； PBS 洗去未结合的二 抗， 加入辣根酶标记链霉卵白素 （1 : 100） ， 37 孵 育 2 h； 最后用 2% DAB/0. 03% H2O2（室温 5 20 min， 呈色） 各步骤间均用 0. 01 molL -1 PBS 冲洗 3 次， 常规裱片、 脱水、 透明、 封片， 光镜观察、 计数并照 相。 Fig 1 Intrathecal admin
17、istration of L-NAME and 7-NI decreases the scores of morphine withdrawal symptom （*x s，n =8） *P 0. 05，*P 0. 01 vs morphine withdrawal group 1. 7 Western blot 法 吗啡戒断后 1 h，腹腔注射 戊巴比妥钠麻醉， 快速取出胸腰段脊髓放入液氮中 保存备用。提取胞浆和胞核蛋白， 按 Bradford 法测 定样本蛋白浓度后加入 1/3 体积的 4 倍样本缓冲液 （250 mmol L -1 Tris-HCl， pH 6. 8， containin
18、g 0. 01% Coomassie brilliant blue-G， 8% sodium dode- cyl sulfate， 200 mmolL -1 Sucrose，and 300 mmol L -1 Dithiothreitol） ， 95 变性 5 min。取 30 g 蛋白 样本在 10%的 SDS 聚丙烯酰胺凝胶上电泳， 然后电 转至硝酸纤维素膜上， 硝酸纤维素膜在 3% 牛血 清封闭3h后与鼠抗p-ERK一抗 （1 : 3 000）4孵育 9031中国药理学通报 Chinese Pharmacological Bulletin 2005 Nov； 21 （11） Fig 2
19、Intrathecal administration of L-NAME and 7-NI decreases the scores of touch evoked nociceptive response in morphine withdrawal rats（*x s，n =8） *P 0. 05，*P 0. 01 vs morphine withdrawal group Fig 3 Intrathecal administration of L-NAME and 7-NI inhibits Fos protein expression in the spinal cord of nalo
20、xone-precipitated withdrawal rats （*x s， n =6） *P 0. 05，*P 0. 01 vs morphine withdrawal group 过夜， TBST 冲洗， 3 15 min， 加入碱性磷酸酶标记 的马抗鼠二抗 （1 : 10 000） ， 室温振荡孵育 1. 5 h， TBST 冲洗， 3 15 min， 用 NBT/ BCIP 检测反应条 带， 半定量分析。 1. 8 统计学分析 所有数据用*x s 表示， 组内及 组间相比用单因素方差分析或 t 检验， 进行统计学 处理。 2 结果 2. 1 行为学观察结果 正常和吗啡依赖大鼠没有
21、戒断反应和痛觉异常。鞘内分别注射 L-NAME、 7- NI 能抑制纳洛酮催促戒断症状评分和痛觉异常 （P 0. 05） 。 2.2 吗啡依赖和戒断大鼠脊髓 Fos 蛋白表达变化 正常和吗啡依赖大鼠脊髓神经元仅有极少量 Fos 蛋白表达， 纳洛酮催促戒断增加脊髓神经元 Fos 蛋 白表达， Fos 蛋白在双侧脊髓全层均大量分布。鞘 内分别注射 L-NAME、 7-NI 能减少吗啡戒断大鼠脊 髓 Fos 蛋白表达 （P 0. 05） 。 2. 3 吗啡依赖和戒断大鼠脊髓 p-ERK 表达变化 正常大鼠脊髓神经元仅有极少量 ERK 蛋白表达， 吗 啡依赖大鼠和纳洛酮催促戒断明显增加脊髓神经元 ER
22、K 蛋白表达， ERK 蛋白分布在双侧脊髓、 层。 鞘内分别注射 L-NAME、 7-NI 能减少吗啡戒断大鼠 脊髓 ERK 蛋白表达 （P 0. 05， Fig 4） 。Western blot 检测胞浆和胞核 p-ERK 水平表明， 吗啡依赖大鼠和 纳洛酮催促戒断 p-ERK 蛋白水平表达较高， 鞘内分 别注射 L-NAME、 7-NI 能减少吗啡戒断大鼠脊髓 ERK 蛋白表达 （P 0. 05， Fig 5） 。 Fig 4 Intrathecal administration of L-NAME and 7-NI inhibits p-ERK protein expression in
23、 the spinal cord of naloxone- precipitated withdrawal rats （*x s， n =6） *P 0. 05，*P 0. 01 vs morphine withdrawal group 3 讨论 本实验结果显示： 鞘内预先应用 NOS 抑制剂 0131中国药理学通报 Chinese Pharmacological Bulletin 2005 Nov； 21 （11） Fig 5 The changes of cytosol and nuclear p-ERK expression in spinal cord in morphine depe
24、ndence and naloxone-precipitated withdrawal rats （*x s， n =4） The representative western blot band for p-ERK. Quantitative data indicating cytosol and nuclear p-ERK expression. The p-ERK expression in control group is expressed as 100%. *P 0. 05 vs withdrawal group 能抑制吗啡戒断发应和纳洛酮催促戒断引起的痛觉 过敏， 与行为学结果一
25、致， 这与以前的报道相一 致 8， 9。 鞘内预先应用 NOS 抑制剂能抑制戒断 大鼠脊髓 Fos 表达。 吗啡戒断状态下脊髓神经 元 p-ERK 表达明显增高， 鞘内预先应用 NOS 抑制剂 能抑制 p-ERK 表达的增高。 c-fos 是存在于神经细胞核内的一种即刻早期 基因，Fos 表达可作为某种刺激引起相关神经元活 动的标志。以往的实验已经证实， 长期应用吗啡引 起的镇痛耐受和依赖大鼠脊髓神经元 Fos 蛋白表达 无明显改变， 纳洛酮催促戒断后， 其在相应脊髓节段 的表达量较正常大鼠明显增加， 且表达量与大鼠痛 行为和戒断反应程度明显相关， 提示吗啡耐受和依 赖状态下， 脊髓神经元处于
26、潜在敏感化， 伤害性刺激 和纳洛酮催促戒断使这种潜在敏感化得以呈现， 表 现为强烈的敏感化状态， 这也是行为痛过敏和戒断 反应的细胞学基础 10， 11。 ERK 在吗啡依赖中的作用以往的研究主要集 中在脊髓上水平， ERK 在阿片耐受及依赖过程中的 作用已被实验所证实， 长期应用吗啡大鼠的蓝斑核、 尾/ 壳状核、 腹侧背盖区、 背根神经节 p-ERK 的活性 明显增高 12， 13。本实验结合行为学和 Fos 蛋白表达 证实， 脊髓神经元 ERK 参与介导吗啡依赖的形成和 戒断反应。ERK 激活后发生核移位， 磷酸化转录因 子 c-Myc、 c-fos、 Elk-1 和 CREB 等。鞘内注
27、射 L- NAME 或 7-NI 抑制 Fos 的表达， 研究发现 c-fos mR- NA 的表达可能是通过 Elk-1 通路来激活， ERK 转位 到核内磷酸化 EIK-1， 激活 c-fos 使得 Fos 表达增 高 14。 新近研究发现在不同的动物模型上 NO 参与调 控 ERK 信号通路的激活过程， 其作用机制可能是 NO 可能通过 PKG 激活 MEK， 从而引起 ERK 的表达 增高 5。NO 也可以通过激活 Ras/ Raf/ MEK 途径 来激活 MEK， 调节 ERK 的表达 15。 NO 还可以 通过作用于 MAPK 磷酸化酶-1 （MAPK phosphatase- 1
28、， MKP-1） ， MKP-1 是双特异性磷酸化酶， 具有使 MAPK 残基酪氨酸和苏氨酸脱磷酸化的特性， 调节 ERK 的活性 26， 27。本实验应用免疫组织化学和 Western blot 法显示吗啡依赖大鼠戒断反应脊髓的 ERK 表达增高， 而鞘内注射 L-NAME 或7-NI 的戒断 大鼠脊髓的 ERK 表达减少， 此结果和行为学的变化 相一致， 提示 NO 可能参与 ERK 信号通路的调节。 参考文献： 1 Wang H， Dai Y， Fukuoka T et al. Enhancement of stimulation-in- duced ERK activation in
29、the spinal dorsal horn and gracile nucleus neurons in rats with peripheral nerve injury J . Eur J Neurosci， 2004， 19： 884 -90. 2 Aley KO， Martin A， McMahon T et al. Nociceptor sensitization by extracellular signal-regulated kinases J .J Neurosci， 2001， 21 （17） ： 6933 -9. 3 Schmidt H， Schulz S， Klutz
30、ny M et al. Involvement of mitogen-ac- tivated protein kinase in agonist-induced phosphorylation of the mu-opioid receptor in HEK 293 cells J . J Neurochem， 2000， 74 （1） ： 414 -22. 4 Jhamandas JH， Harris KH， Petrov T. Activation of nitric oxide syn- thesizing neurons during precipitated morphine wit
31、hdrawal J . Neuroreport， 1996， 7： 2843 -6. 5 Deora AA，Hajjar DP，Lander HM. Recruitment and activation of Raf-1 kinase by nitric oxide-activated Ras J .Biochemistry， 2000， 39 （32） ： 9901 -8. 6 宋必卫， 徐叔云， 马传庚 et al. 镇痛药物实验方法 M / / 徐叔 云， 卞如濂， 陈 修主编， 药理实验方法学， 第 3 版， 北京： 人民 卫生出版社， 2002， 893. 1131中国药理学通报 C
32、hinese Pharmacological Bulletin 2005 Nov； 21 （11） 7 Yaksh TL，Harty GJ，Onofrio BM. High dose of spinal morphine produce a nonopiate receptor-mediated hyperesthesia：clinical and theoretic implications J . Anesthesiology， 1986， 64 （5） ： 590 -7. 8 Vaupel DB， Kimes AS， London ED. Nitric oxide synthase in
33、 hibi- tors： preclinical studies of potential use for treatment of opiate ad- diction J . Neuropsychopharmacology， 1995， 13： 315 -22. 9 Vaupel DB， Kimes AS， London ED. Further in vivo studied on at- tenuating morphine withdrawal； isoform selective nitric oxide syn- thase inhibitors differ in efficac
34、y J . Eur J Pharmacol， 1997， 324 （1） ： 11 -20. 10Cao JL， Zeng YM，Zhang LC，Duan SM. Increased expression of formalin-induced Fos and NADPH-d positive neurons in the spinal cord of morphine-tolerant rat. Acta Physiologica Sinica， 2000， 529 （3） ： 235 -8. 11Rohde DS，Detweiler DJ，Bashaum AI. Formalin-evo
35、ked fos ex- pressing is enhanced in morphine- tolerant rats J . Brain Res， 1997， 766 （1-2） ： 93 -100. 12Ortiz J， Harris HW， Guitart X， Terwilliger RZ. Extracellular signal- regulated protein kinases（ERKs）and ERK kinase （ MEK）in brain： regional distribution and regulation by chronic morphine J . J Ne
36、urosci， 1995， 15： 1285 -97. 13Berhow MT，Hiroi N， Nestler EJ. Regulation of ERK （extracelluar signal regulated kinase） ， part of the neurotrophin signal transduc- tion cascade， in the rat mesolimbic dopamine system by chronic ex- posure to morphine or cocaine J . J Neurosci， 1996， 16： 4707 - 15. 14Ko
37、vacs KJ. c-fos as a transcription factor： a stressful （re） view fro- ma functional map J . Neurochem Int， 1998， 33： 287 -97. 15Zaragoza C， Soria E， Lopez E et al. Activation of the mitogen acti- vated protein kinase extracellular signal-regulated kinase 1 and 2 by the nitric oxide-cGMP-cGMP-dependen
38、t protein kinase axis reg- ulates the expression of matrix metalloproteinase 13 in vascular en- dothelial cells J . Mol Pharmacol， 2002， 62 （4） ： 927 -35. 16Camps M， Nichols A， Arkinstall S. Dual specificity phosphatases： a gene family for control of MAP kinase function J . FASEB J， 2000， 14 （1） ： 6
39、 -16. 17Mishra OP，Zubrow AB，Ashraf QM. Nitric oxide-mediated acti- vation of extracellular signal-regulated kinase （ERK）and c-jun N- terminal kinase（JNK）during hypoxia in cerebral cortical nuclei of newborn piglets J . Neuroscience， 2004， 123 （1） ： 179 -86. Nitric oxide synthase inhibitors suppressi
40、on against expression of ERK in spinal cord of morphine dependent and withdrawal rats LIU Hai-lin1， 2，CAO Jun-li2，ZENG Yin-ming2， DAI Pei-jing1， ZHENG Guo-long1 （1. 1st Hospital of Huai&an，Affiliated Hospital of Nanjing Medical University，Huaian 223300，China； 2. Jiangsu Provincial Key Lab of Anesthe
41、siology， Xuzhou 221002， China） Abstract： Aim This study aimed to explore the effects of intrathecal injection of nitric oxide synthase inhibitors （L-NAME， 7-NI）on morphine withdrawal re- sponse and the the spinal p-ERK expression. Methods Rats were divided into 5 groups：control group，de- pendence gr
42、oup，withdrawal group，L-NAME group （L- NAME， it）and 7-NI group （7-NI， it） . Morphine with- drawal score，touch evoked agitation scores（ TEA scores） ， immunohistochemical and western-blotting technique were used to evaluate morphine withdrawal response and the expression of Fos and p-ERK in the spinal
43、cord，respectively. Results Intrathecal injec- tion of non-specific NOS inhibitor L-NAME，nNOS in- hibitor 7-NI significantly alleviated morphine withdraw- al symptoms.Morphine withdrawal scores in the L- NAME （22. 1 4. 52）and 7-NI groups （16. 2 3. 99） were significantly lower than that of the withdra
44、wal group （28. 6 4. 89） （P 0. 05， P 0. 01） ；TEA score of the withdrawal group was 13. 5 2. 55， which was significantly higher than that of the L-NAME（9. 8 3. 11， P 0. 05）and 7-NI groups （7. 5 2. 56， P 0. 01） . Fos-like positive neurons （Fos-LI）in the spi- nal dorsal horn of the withdrawal group were
45、 380 71， which were higher that of the L-NAME（293 47， P 0. 05）and 7-NI groups（228 49， P 0. 01） . Phos- pho-ERK positive neurons in the spinal dorsal horn of the L-NAME and 7-NI groups were 46. 8 11. 58， 40. 5 8. 55 respectively，which were significantly lower that of the withdrawal group（66. 6 11. 6，
46、 P 0. 05， P 0. 01） . Compared with the withdrawal group，level of p-ERK protein detected by Western blot in spinal cord of the L-NAME and 7-NI groups were significantly lower. Conclusion The spinal NO involves in mor- phine dependence and withdrawal，and its role may be mediated by ERK signal pathway. Key words： morphine；dependence；withdrawal；spi- nal cord；nitric oxide synthase；extracellular signal- regulated kinase （ ERK） 2131中国药理学通报 Chinese Pharmacological Bulletin 2005 Nov； 21 （11）