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1、第 24 卷 第 1 期 辐 射 研 究 与 辐 射 工 艺 学 报 Vol.24, No.1 2006 年 2 月 J. Radiat. Res. Radiat. Process. February 2006 第一作者：陈季武，男，1956 年 12 月出生，2003 年于华东师范大学获博士学位，硕士生导师，副教授 收稿日期：初稿 2005-04-13，修回 2005-08-16 一种新的产生和检测过氧亚硝基的化学发光体系 陈季武 胡 斌 苏 裕 秦海燕 曹嘉琪 （华东师范大学生命科学学院 上海 200062） 摘要 研究产生和消除过氧亚硝基（Peroxynitrite anion，ONOO
2、 ）是自由基生物学和医学的一项紧迫任务。 为此， 建立了一种新的产生和检测 ONOO 的化学发光体系， 并评估了检测的最佳条件。 该方法为： 10mmol/L 羟胺与 0.5mol/L NaOH、1mmol/L、乙二胺四乙酸二钠（Disodium ethylenediamine tetraacetate, EDTA）反应 产生 ONOO ，随后用 MnO 2粉末过滤反应液以除去 H2O2，然后在测量管内加入 100L 抗氧化剂和 860L 0.1mol/L 的碳酸盐缓冲液（pH10） ，再加入 40L 过滤后的 ONOO 反应液、混匀、延迟 10s，测 10s 化学发 光强度。以抗氧化剂茶多酚
3、、抗坏血酸、芦丁和黄芩苷作清除 ONOO 的实验。结果表明，本体系是一种灵敏 价廉、可靠易行的筛选 ONOO 清除剂的新方法。 关键词 过氧亚硝基，化学发光，抗氧化剂 中图分类号 Q63，Q632，Q505 过氧亚硝基（Peroxynitrite anion，ONOO ）是 一氧化氮（Nitric oxide，NO）与超氧阴离子 （Superoxide anion，O2）相互反应的产物1,2。在 病理条件下，体内既产生 NO，同时又产生 O2， 两者以弥散速度反应生成 ONOO 。在碱性条件下 ONOO 较为稳定，可以由生成部位扩散较远距离 而到达靶位，造成较大范围的损伤3,4，是导致细胞 和
4、组织损伤的强力氧化剂。研究表明，ONOO 与 一系列疾病如炎症、缺血重灌损伤、败血症休克和 神经退行性紊乱的发病机理密切相关1,3,4。因此筛 选 ONOO 清除剂具有重要意义。但是迄今为止， 关于 ONOO 清除剂的研究报道甚少5,6。 目前，已有几种检测 ONOO 的方法报道5， 有分光光度法，但其不够灵敏；也有 NaN3与 O3反 应产生 ONOO 方法，但 NaN 3和 O3有毒性；还有 SIN1 产生 ONOO方法，但 SIN1 价贵且国内无 货源6。本工作在参考文献的基础上，建立了羟胺 自氧化产生 ONOO 的化学发光体系，用以检测和 筛选 ONOO 清除剂的研究。实验表明，该法灵
5、敏、 价廉，可靠易行。 1 材料和方法 1.1 试剂 羟胺、NaOH 和乙二胺四乙酸二钠（Disodium ethylenediamine tetraacetate, EDTA） 等试剂均系国产 分析纯。所有试剂均由超纯水配置。 1.2 抗氧化剂 茶多酚（Tea polyphenol，TP）系浙江大学茶学系 产品，纯度为 95%，抗坏血酸购自上海化学试剂公 司，纯度为 99%，芦丁由中科院上海药物所朱大元 教授惠赠，纯度为 98%；黄芩苷由上海中药一厂提 供，纯度为 97%。 1.3 仪器 SHG1 型生物化学发光测量仪 （上海技术监督 局实验工厂） ；磁力搅拌器（上海曹行无线电元件 厂） 。
6、 1.4 方法 1.4.1 合成 ONOO 通过羟胺在碱性介质中自氧 化来合成 ONOO 2：在有氧条件下激烈搅拌含 0.01mol/L 羟胺、0.5mol/L NaOH 和 0.001mol/L EDTA 的混合液约 3h，然后用 MnO2粉末过滤混合 液除去 H2O2，过滤后的混合液可立即用于实验，也 可于18下贮存。在紫外可见分光光度计 302nm 处检测 ONOO 浓度。 1.4.2 检测 在测量管中加入 100L 不同浓度的 待测样品（对照组以碳酸盐缓冲液代替）及 860L 0.1mol/L 碳酸盐缓冲液（pH10） ，再加入 40L ONOO 反应液， 延迟 10s， 连续测其 1
7、0s 发光强度， 取发光峰值，计算发光抑制率。 1.4.3 检测原理 羟胺在碱性介质中自氧化产生 12 辐 射 研 究 与 辐 射 工 艺 学 报 第 24 卷 ONOO2，ONOO 单电子氧化碳酸盐产生重碳酸 盐自由基（HCO3） ，HCO3复合（Recombination） 直接产生 2 分子激发三线态 CO2 (CO2) *2，(CO2)*2 回到基态时发射最大峰为 443nm 的光7。所以清除 ONOO 越多，发光越弱，即 ONOO 量与发光成 比例。因此，观察发光强度便可判定抗氧化剂清除 ONOO的能力。 NH2O + O 2 H2O2 + NO (1) NO + O 2 ONOO
8、(2) ONOO + HCO 3 + H+ HCO 3 + NO2 + OH (3) 2 HCO3 （CO2） * 2 + H2O2 (4) （CO2） * 2 CO2 + hv （max =443nm） (5) 2 结果与分析 2.1 羟胺与 NaOH 对产生 ONOO 的影响 2.1.1 羟胺的影响 固定 NaOH 为 0.5mol/L 和 EDTA 为 1mmol/L，加不同浓度羟胺，反应 3h， 用紫外分光光度计对其进行光谱扫描表明其发光峰 位于 302nm 处，于 302nm 处测其产生 ONOO 的 量。结果表明，随着羟胺浓度增大，ONOO 增多， 10mmol/L 时达到高峰，再
9、加大羟胺浓度，ONOO 反而减少（见表 1） 。 Table 1 Effect of the hydroxylamine on ONOO (n=3) Hydroxylamine / mmol L1 6 8 10 12 14 O.D. value 1.76780.0453 1.83010.0312 2.14670.0471 1.53980.0460 1.41820.0358 2.1.2 NaOH 的影响 固定羟胺为 10mmol/L 和 EDTA 为 1mmol/L，加不同浓度 NaOH，反应 3h， 用紫外分光光度计于302nm处测其产生ONOO 的 量。 结果表明， NaOH 浓度为 0.5
10、mol/L 时， ONOO 最多，升高或降低 NaOH 浓度后，ONOO 均减少 （见表 2） 。 Table 2 Effect of the NaOH on ONOO (n=3) NaOH / m mol L1 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 O.D. value 0.26230.0094 1.19430.0287 2.14010.0443 0.48020.0135 0.40170.0140 2.1.3 不 同 反 应 时 间 的 影 响 固 定 羟 胺 为 10mmol/L、NaOH 浓度为 0.5mol/L 和 EDTA 为 1mmol/L，在 15下反应不同时间，结果 3h 时
11、 ONOO 最多（见表 3） 。 Table 3 Effect of the different reaction time on ONOO (n=3) Reaction time/h 2 2.5 3 3.5 4 O.D. value 1.61250.0658 1.86930.0729 2.15370.0603 2.13440.0791 2.12870.0671 2.2 不同反应成分对本体系化学发光强度的影响 2.2.1 不同缓冲液对化学发光强度的影响 在测量 管中分别加入 960L，0.1mol/L 的不同缓冲液 （pH10） ， 再加入 40L， ONOO 反应液启动发光。 结果显示，碳酸
12、盐缓冲液化学发光强且发光强度衰 减慢（见表 4） 。 Table 4 Effect of different buffers on CL intensity (n=3) Times of measuring Carbonate buffer Phosphate buffer Tris buffer First time 4715185187 36089712991 8751472 Second time 45901314239 22804311146 5992372 CL intensity (Counts of per 10 seconds) Third time 42519717858 1
13、8198111283 4559239 第 1 期 陈季武等：一种新的产生和检测过氧亚硝基的化学发光体系 13 2.2.2 不同 pH 的碳酸盐缓冲液对化学发光强度 的影响 在测量管中分别加入 960L 不同 pH 的 0.1mol/L 的碳酸盐缓冲液，再加入 40L ONOO 反应液启动发光。结果显示，pH10 的碳酸盐缓冲 液化学发光强度最强（见表 5） 。 Table 5 Effect of different pH of carbonate buffer on CL intensity (n=3) pH value 9 9.5 10 10.5 11 CL intensity (Count
14、s of per10 seconds) 2273404273 3568598495 4710985694 21557 883 3549149 2.2.3 ONOO 反应液对化学发光强度的影响 在 测量管中加入一定体积的 0.1mol/L 的碳酸盐缓冲 液（pH10） ，再分别加入不同体积的 ONOO 反应 液启动发光，使终体积均为 1mL。 结果显示，加 入 40L，ONOO 反应液时化学发光强度最强（见 表 6） 。 Table 6 Effect of the different concentration of ONOO (n=3) ONOOsolution /L 0 20 30 40 4
15、5 50 CL intensity(Counts of per 10 seconds) 903412168 2452166804 4558029804 4709105180 4493128082 4143127982 2.2.4 温度对化学发光强度的影响 在不同的测 量温度下，在测量管中分别加入 960L，0.1mol/L 的碳酸盐缓冲液（pH10） ，再加入 40L，ONOO 反应液启动发光。结果显示，温度对化学发光的强 度有着明显的影响，25时化学发光强度最强（见 表 7） 。 Table 7 Effect of the temperature on CL intensity (n=3)
16、Temperature / 0 10 20 25 30 37 40 CL intensity(Counts of per10 seconds) 2993937485 3131637203 3801617223 4732987099 4349958265 39091210163 3291828874 2.3 重现性 检测对照管的化学发光强度，批内变异系数 (Coefficient of variability， CV) CV%= 2.7% （n=10） ， 批间变异系数 CV%= 4.9% （n=5） ，重现性好。 2.4 抗氧化剂清除 ONOO的作用 用本化学发光体系检测了茶多酚、抗坏血酸、
17、芦丁和黄芩苷等抗氧化剂对 ONOO 的清除作用， 结果见表 8。 Table 8 Effect of antioxidants scavenging ONOO (n=3) Antioxidants Concentration/ mol L1 CL intensity(Counts of per10 seconds) Intensity rate /% Control 0 4729834259 0 Tea polyphenol 5106 1007452116 78.7 2105 12298235 97.4 5105 23710 99.9 Ascorbic acid 5106 4725105671
18、 0 2105 1868285044 60.5 5105 236583 99.5 Rutin 5106 931782329 80.3 2105 4731128 99.0 5105 47318 99.9 Baicalin 5106 42899612440 9.3 2105 1825715942 61.4 5105 487172095 89.7 14 辐 射 研 究 与 辐 射 工 艺 学 报 第 24 卷 由表 8 可见，4 种抗氧化剂都能有效地清除 ONOO ， 并呈量效关系， 但清除的能力不同， 其中， 芦丁和茶多酚作用相当，清除能力最强，抗坏血酸 和黄芩苷的清除作用相对弱一些。 综上实验表
19、明，产生 ONOO 的最佳反应条件 为：羟胺为 10mmol/L、NaOH 浓度为 0.5mol/L 和 EDTA 为 1mmol/L 时，反应产生 ONOO ，然后 MnO2粉末过滤反应液以除去 H2O2，过滤后的 ONOO 反应液置于冰中。本化学发光体系的最佳 反应条件为：测量管内先加 100L 清除剂和 860L 0.1mol/L 的碳酸盐缓冲液（pH10） ，然后加 40L ONOO 反应液，混匀，延迟 10s，测 10s 发光积分 强度。以抗氧化剂茶多酚、抗坏血酸、芦丁和黄 芩苷作清除 ONOO的实验，证明本体系是切实 可行的。而且，本体系纯属化学反应体系，所涉 及的试剂均价廉且易得
20、，体系又灵敏，颇有应用 价值。 参考文献 1 Szabo C. Toxicol Lett, 2003, 140-141(Complete): 105- 112 2 YANG X F, GUO X Q, ZHAO Y B. Talanta, 2002, 57(5): 883-890 3 Peter C, Dedona, Steven R, et al. Arch Biochem Biophys. 2004, 423(1): 12-22 4 Patel R P, Mcandrew J, Sellak H, et al. Biochem Biophys Acta, 1999, 1411(2-3):
21、385-400 5 范小兵, 沙大军, 梁小凤, 等. 生物化学与生物物理学 进展, 2001, 28(2): 251-255 FAN Xiaobing, SHA Ddjun, LIANG Xiaofeng, et al. Prog Biochem Biophys, 2001, 28(2): 251-255 6 梁小凤, 胡天喜, 赵亚平, 等. 辐射研究与辐射工艺学 报, 2003, 21(3): 207-209. LIANG Xiaofeng, HU Tianxi, ZHAO Yaping, et al. J Ra- diat Res Radiat Process, 2003, 21(3)
22、: 207-209 7 LU C, LIN J M. Catal Today, 2004, 90(3-4): 343347 A novel chemiluminescence system for producing and measuring peroxynitrite anions CHEN Jiwu HU Bin SU Yu QIN Haiyan CAO Jiaqi (School of Life Science, East China Normal University Shanghai 200062) ABSTRACT The study for generating and sca
23、venging peroxynitrite anions (ONOO) is an urgent task in free radi- cal biology and medicine. Therefore, a novel chemiluminescence system for producing and measuring ONOO has been established. The optimal conditions for detecting ONOO were evaluated. The method can be described as fol- lows. A mixtu
24、re solution containing 10mmol/L hydroxylamine, 0.5mol/L NaOH and 1mmol/L EDTA was stirred vigorously in aerobic conditions for about 3h to form ONOO. Certain amount of MnO2 powder was added to the mixture solution to eliminate H2O2 generated in the reaction. Then 100L antioxidant and 860L 0.1mol/L c
25、arbon- ate buffer (pH10) were added into a test tube. By adding 40L filtrated ONOO solution into the tube, chemilumines- cence (CL) reaction was initiated. Ten seconds after the solution was uniformly mixed, CL intensity of the reaction solution could be determined in a measurement of 10 seconds. Th
26、e method was tested with tea polyphenol, ascorbic acid, rutin and baicalin, whish are known to have effects of scavenging ONOO. The tests show that the system is sensitive, lowcost, credible and easy method for screening ONOO. KEYWORDS Peroxynitrite anion, Chemiluminescence, Antioxidants CTC Q63, Q632, Q505