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1、was measured using Western blot. The sensitivity of cells to doxorubicin was measured using MTT assay. Results The sorcin level was significantly higher in K562/ A02 cells than in K562 cells . Transfection of K562/ A02 cells with ASODN targeted to sorcin re- duced the level of sorcin expression and
2、increased the sensitivity of K562/ A02 cell to doxorubicin. Conclu- sion Sorcin，an important gene involved in MDR in leukemia cells，may be a potential target for MDR modulators investigation in the future. Key words： leukemia；multidrug resistance；sorcin； antisense oligonucleotide；transfection 三肽化合物酪
3、丝缬肽对人肝癌 BEL-7402 细胞增殖抑制作用的实验研究 贾 静1， 朱智彤1， 陆 融2， 赵 茜1， 李国力1， 金孟珏3， 李会强1， 姚 智1 （1.天津医科大学免疫教研室， 天津 300070； 2.深圳康哲药业有限公司， 深圳 518029； 3.天津医科大学实验动物部， 天津 300070） 中国图书分类号： R 329. 26， R 730. 5， R 979. 1 文献标识码： A 文章编号： 1001 -1978 （2005） 12 -1433 -05 摘要： 目的 观察三肽化合物酪丝缬肽 （tyroservaltide， YSV） 对体外培养人肝癌 BEL-7402
4、细胞增殖的抑制作用。方法 建立人肝癌 BEL-7402 及 Chang 氏肝细胞体外培养体系， 用 BrdU 法、 MTT 法及 LDH 法， 观察 YSV 对体外培养的 BEL- 7402 细胞、 Chang 氏肝细胞 DNA 分裂指数、 MTT 代谢率、 LDH 释放量的影响， 用琼脂糖凝胶电泳观察药物对体外培 养 BEL-7402 细胞 DNA 片段化的影响。结果 YSV 对 BEL- 7402 细胞作用 48 h、 72 h 时药物浓度为1 mgL -1和0. 1 mg L -1组与阴性对照组比较： 能显著抑制肿瘤细胞 DNA 的 合成 （P 0. 05， 见 Tab 7 9） 。 T
5、ab 6 The effects of YSV on metabolism activation of normal hepatic cell and hepatocarcinoma BEL-7402 cells（n =4， 72 h） Dose BEL-7402 OD Inhibitory rate/ % Changs liver OD Inhibitory rate/ % YSV 100 mgL -1 0.190 0.017-1.123 0.048- 10 mgL -1l 0.195 0.013-1.179 0.045- 1 mgL -1 0.162 0.011*16.941.110 0.
6、065- 0.1 mgL -1 0.157 0.015*19.121.015 0.056- 0.01 mgL -1 0.189 0.016-1.114 0.016- Control0.195 0.018-1.075 0.085- *P 0. 05 vs control group，One-Way ANOVA，Student Newman- Keuls（SNK） Tab 7 The effects of YSV on cytotoxicity reaction of normal hepatic cell and hepatocarcinoma BEL-7402 cells（n =4， 24 h
7、） Dose BEL-7402 OD Inhibitory rate/ % Changs liver OD Inhibitory rate/ % YSV 100 mgL -1 0.472 0.016-0.387 0.035- 10 mgL -1 0.474 0.023-0.490 0.066- 1 mgL -1 0.481 0.028-0.382 0.031- 0.1 mgL -1 0.483 0.023-0.415 0.043- 0.01 mgL -1 0.494 0.071-0.369 0.025- Control0.423 0.067-0.378 0.026- Tab 8 The eff
8、ects of YSV on cytotoxicity reaction of normal hepatic cell and hepatocarcinoma BEL-7402 cells（n =4， 48 h） Dose BEL-7402 OD Inhibitory rate/ % Changs liver OD Inhibitory rate/ % YSV 100 mgL -1 0.547 0.022-0.675 0.027- 10 mgL -1 0.818 0.025*17.440.698 0.041- 1 mgL -1 1.027 0.036*39.020.657 0.014- 0.1
9、 mgL -1 0.897 0.012*25.610.715 0.026*11.61 0.01 mgL -1 0.532 0.013-0.584 0.061- Control0.649 0.095-0.640 0.037- *P 0. 05 vs control group，One-Way ANOVA，Student Newman- Keuls（SNK） 2. 4 YSV 诱导体外培养 BEL-7402 肝癌细胞 DNA 片段化 由 Fig 2 可观察到 10、 1、 0. 1 mgL -1YSV 能诱导体外培养 BEL-7402 肝癌细胞 DNA 片段化成 低分子量 DNA （LMW DNA
10、） ， 经1%琼脂糖电泳后显 示为 DNA Ladder， 而沉淀中为未出现片段化的大分 子量 DNA （HMW DNA） ， 不能经 1% 琼脂糖电泳分 5341中国药理学通报 Chinese Pharmacological Bulletin 2005 Dec； 21 （12） 离。 Tab 9 The effects of YSV on cytotoxicity reaction of normal hepatic cell and hepatocarcinoma BEL-7402 cells（n =4， 72 h） Dose BEL-7402 OD Inhibitory rate/ %
11、Changs liver OD Inhibitory rate/ % YSV 100 mgL -1 0.828 0.040-0.799 0.040- 10 mgL -1 1.036 0.038*14.380.871 020- 1 mgL -1 1.346 0.047*36.130.857 0.049- 0.1 mgL -1 1.214 0.013*26.830.796 0.050- 0.01 mgL -1 0.725 0.041-0.783 0.049- Control0.831 0.076-0.805 0.028- *P 0. 05 vs control group，*P 0. 01 vs
12、salinecontrol group， One-Way ANOVA，Student Newman-Keuls（SNK） Fig 2 DNA ladder induced by 10 mgL -1， 1 mgL-1， 0. 1 mg L -1CMS024-02 and positive control TNF-， contrasted with nega- tive control in the LMW DNA contained suspension Lane 1： Negative control-LMW DNA contained in the suspension； Lane 2： 1
13、0 mgL -1-LMW DNA contained in the suspension； Lane 3： 1 mgL -1-LMW DNA contained in the suspension； Lane 4：0. 1 mg L -1 LMW DNA contained in the suspension； Lane 5： TNF-LMW DNA contained in the suspension； Lane 6： Marker； Lane 7： Negative control- HMW DNA contained in the precipitant 3 讨论 本研究从细胞活力及增
14、殖等方面观察了 YSV 对体外培养肿瘤细胞生长情况的影响。细胞活力大 多通过检测两个特征参数来反映， 即细胞代谢活力 和细胞膜的完整性。代谢旺盛的细胞可以将四唑盐 （如 MTT， XTT， WST-1） 代谢为紫色的产物， 用代谢 产物的 OD 值可以定量反映细胞的代谢活力 2。在 细胞毒研究中， 濒死细胞内的某些分子 （如乳酸脱 氢酶 LDH 或预先标记的 51Cr ） 经细胞膜裂隙释 放出来， 通过检测释放产物的量来反映细胞的活 力 3， 4。与细胞活力分析相比， 细胞增殖可以检测 分裂活跃的细胞， 而处于静止期的活细胞不能被检 测到。它可以用增殖细胞的数量或其所占的比例表 示， 也可以用
15、反映细胞生长的相关指标表示。最常 用的细胞增殖指标是 DNA 合成， 它是复制的特异性 标志。标记的 DNA 前体 （如 3H -胸腺嘧啶或5-溴- 2-脱氧尿嘧啶 BrdU 5）与检测细胞共同孵育， 在 细胞复制期 （S 期） 与 DNA 相互结合， 再通过检测与 DNA 结合的标记的前体来反映细胞增殖分裂情况。 因此检测细胞代谢能力的 MTT 法、 检测杀伤活 性的 LDH 法和反映细胞 DNA 复制的 BrdU 法从不 同方面反映体外细胞生长特性， 3 个指标联合使用 可以提示不同抗癌药物的作用机制。如放线菌素 D （actinomycin D， Act-D） ， 属于细胞静止药， 主要
16、通过 抑制 DNA 转录过程发挥抗肿瘤作用， 对肿瘤细胞的 直接杀伤作用较弱 6。放线菌素 D 通过与细胞 DNA 双链结合特异性影响 DNA 指导下的 RNA 合 成， 使标记的核酸前体物质参入减少， 从而使增殖细 胞停顿于 G1期。因此在药物作用早期进行 BrdU 参入检测即出现变化， 而反映样本中活细胞数量的 MTT 指标和反映杀伤活性的 LDH 检测出现变化较 晚。 本研究选用 MTT、 LDH 和 BrdU 3 个指标观察 YSV 对人肝癌 BEL-7402 细胞株和正常人肝细胞 Chang 氏肝的作用。YSV 抑制人肝癌 BEL-7402 细 胞的增殖， 表现为抑制癌细胞 DNA
17、合成使 BrdU 标 记减少， 实验结果显示 YSV 作用 48 h 时 1 mgL -1 组和 0. 1 mgL -1组能抑制肝癌细胞 DNA 的合成， 作用 72 h 时 10 mgL -1组和 1 mgL-1组亦能抑 制肝癌细胞 DNA 的合成； 另外 YSV 能降低癌细胞 代谢 MTT 的能力。该实验结果显示 YSV 对肝癌细 胞 BEL-7402 作用 48 h 及 72 h 时， 1 mgL -1组和 0. 1 mgL -1组表现出抑制细胞代谢活力的效应。 YSV 还能破坏肿瘤细胞膜的完整性造成培养上清 中 LDH 分泌量增加， 对 BEL-7402 作用 48 h 及 72 h
18、时， 10 mgL -1组、 1 mgL-1组和 0. 1 mgL-1组 表现出增加胞浆内 LDH 的释放。而对正常肝细胞 未见明显抑制作用。结果提示 YSV 通过抑制肿瘤 细胞 DNA 合成降低细胞代谢水平， 并通过细胞毒作 用发挥抗肿瘤作用， 而且这种作用特异性针对肿瘤 细胞， 对正常细胞无影响。 DNA Ladder 7， 8是激活的内源性钙-镁离子依赖 性核酸内切酶选择性降解染色体核小体间的 DNA， 导致细胞 DNA 广泛断裂形成大小不一的 DNA 片 断， 甚至单聚或寡聚核小体， 从而在琼脂糖凝胶电泳 上呈现规则的， 间隔 180-200 碱基对的梯状 DNA 区 6341中国药理
19、学通报 Chinese Pharmacological Bulletin 2005 Dec； 21 （12） 带 （DNA ladder） ， 形成凋亡细胞特有的 DNA 改变。 本研究应用 DNA 电泳， 从生化特征方面研究 YSV 对人肝癌 BEL-7402 细胞凋亡的影响。YSV10 mg L -1、 1 mgL-1、 0. 1 mgL-1能诱导肿瘤细胞 DNA 片段化， 形成低分子量 DNA （LMW DNA） ， 琼脂糖凝 胶电泳显示为 DNA Ladder。 以上结果从不同方面证实了 YSV 通过抑制肿 瘤细胞增殖、 降低细胞代谢和破坏肿瘤细胞细胞膜 的完整性、 诱导肿瘤细胞凋亡、
20、 坏死来发挥抗肿瘤作 用。 参考文献： 1 Aggarwal S，Gollapudi S，Gupta S. Increased TNF-alpha-induced apoptosis in lymphocytes from aged humans： changes in TNF-alpha receptor expression and activation of caspases J . J Immunol， 1999， 162 （4） ： 2154 -61. 2 Wright WE，Shay JW. Cellular senescence as a tumor-protection mec
21、hanism：the essential role of counting J . Curr Opin Genet Dev， 2001， 11 （1） ： 98 -103. 3 汤钊猷， 马曾辰， 薛 琼. 裸鼠人体肝癌移植模型的研究. . 模型的建立及其血清学与形态学特征 J . 上海第一医学院 学报， 1982， 9 （1） ： 21 -6. 4 龙 江， 王华光， 何树庄， 杨宝峰. 原钒酸钠的细胞毒理学实验 研究 J . 中国药理学通报， 2003， 19 （4） ： 451 -4. 5 Porstmann T，Ternynck T，Avrameas S. Quantitation o
22、f 5-bromo- 2-deoxyuridine incorporation into DNA：an enzyme immunoassay for the assessment of the lymphoid cell proliferative response J . J Immunol Methods， 1985， 82 （1） ： 169 -79. 6 Hamilton LD， Fuller W，Reich E. X-ray diffraction and molecular model building studies of the interaction of actinomyc
23、in with nucle- ic acids J . Nature， 1963， 198： 538 -40. 7 Wyllie AH. Glucocorticoid-induced thymocyte apoptosis is associ- ated withendogenous endonuclease activation J . Nature， 1980， 284： 555 -6. 8 牛朝诗， 孙敬武， 卞留贯， 罗其中. TNF- 抑制胶质瘤细胞增殖 和诱导凋亡的研究 J . 中国药理学通报， 2000， 16 （2） ： 205 - 7. Inhibitory mechanis
24、m of tyroservaltide on human BEL-7402 hepatocarcinoma cell proliferation JIA Jing1， ZHU Zhi-tong1， LU Rong2， ZHAO Qian1， LI Guo-li1， JIN Meng-yu3， LI Hui-qiang1， YAO Zhi1 （1. Dept of Immunology，Tianjin Medical University，Tianjin 300070， China； 2. Shenzhen Kangzhe Pharmaceutical CO. LTD，Shenzhen 5180
25、29， China； 3. Dept of Experimental Animal，Tianjin Medical University，Tianjin 300070， China） Abstract： Aim To examine the inhibitory effects of tyroservaltide（YSV）on human hepatocarcinoma BEL- 7402 cells in vitro. Methods An in vitro culture sys- tem of hepatocarcinoma BEL-7402 and Changs liver cells
26、 was established. We evaluated the effects of YSV on cellular metabolic activity and cytotoxicity against cultured BEL-7402 cells by BrdU incorporation，MTT metabolism，and lactate dehydrogenase（ LDH） re- lease. DNA laddering was observed in YSV-treated BEL-7402 cells by agarose electrophoresis. Resul
27、ts After BEL-7402 cells were treated with YSV（1 mg L -1， 0. 1 mg L-1 ）for 48 h or 72 h，significant differences were observed between the control and YSV groups. YSV inhibited DNA synthesis（P 0. 05） ， with a maximum inhibitory rate of 32. 53%（YSV 0. 1 mgL -1 for 72 h） . The effects of YSV on the cell
28、ular metabolic rate differed in the normal hepatic cell line and the hepatoma cell line. There was an increase in the release of LDH after YSV treatment（P 0. 05） ， with a maximal increase of 36. 13%.YSV also in- duced DNA laddering. When Changs liver cells were treated with YSV， the control and YSV
29、groups differed significantly only when YSV 0. 1 mgL -1 was admin- istered for 48 h. Conclusions YSV inhibits the pro- liferation of BEL-7402 cells，but has almost no effect on Chang s liver cells. Key words： tyroservaltide （YSV） ； BrdU； MTT； LDH； DNA ladder；BEL-7402；apoptosis 本刊特别欢迎各种基金论文的 “研究简报” ， 将即 时处理， 即时刊用。 7341中国药理学通报 Chinese Pharmacological Bulletin 2005 Dec； 21 （12）