人源受体HGPCRC工程细胞株的建立及其应用.pdf

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1、人源受体 hGPCRc 工程细胞株的建立及其应用 袁广胜2， 刘永学1 （1. 北京放射医学研究所药理室， 北京 100850； 2. 四川农业大学玉米研究所， 四川 雅安 625014） 收稿日期： 2004 -12 -16， 修回日期： 2005 -02 -18 基金项目： 国家自然科学基金资助项目 （No 30171096） ， 全军 “十五” 医药卫生资助项目 （No 01MB056） ； 作者简介： 袁广胜 （1978 - ） ， 男， 硕士生， Tel： 010-66932252， E-mail： yuangs-032163. com； 刘永学 （1966 - ） ， 男， 副研究

2、员， 研究方向： 受体药理学， 通讯作者， Tel： 010-66932252， E-mail： 中国图书分类号： R 341. 3； R 348. 2； R 392. 11； R 394. 2； R 977. 6 文献标识码： A 文章编号： 1001 -1978 （2005） 07 -0818 -05 摘要： 目的 建立孤儿 G 蛋白偶联受体 （Orphan G protein- coupled receptors， oGPCRs） 配基筛选体系并应用于化合物的 筛选。方法 利用 RT-PCR 从人结肠组织获得 oGPCR 成员 hGPCRc 的氨基酸编码序列， 在利用相关软件对 hGP

3、CRc 的 结构特点进行分析的基础上， 构建 hGPCRc 之表达载体 pcD- NA3. 1 （ + ） -hGPCRc， 转染 CHO-K1细胞获得 CHO-hGPCRc 工程细胞株， 将不同化合物作用于细胞株， 用 Fluo-3 为分子 探针检测细胞内钙离子浓度变化， 以分析化合物中是否为该 受体的特异性配基。结果 生物信息学分析得到： hGPCRc 定位于人染色体 13q32. 2， 对应的氨基酸序列组成了 7 个跨 膜区段的结构域， 在进化树上与人源 P2Y1受体最亲近， 应属 于人类 GPCR 成员； 成功得到 CHO-hGPCRc 工程细胞株； 所 检测化合物作用于细胞株并没有引

4、起胞内钙离子的波动， 很 可能没有活化 hGPCRc。结论 hGPCRc 是一个与已知人 P2Y1最近的成员， 但基于 CHO-hGPCRc 工程细胞株的第二 信使筛选结果表明， hGPCRc 并不被 P2Y1的已知配基活化， 因此很可能属于不同于 P2Y1的嘌呤类受体新亚型。 关键词： 孤儿 G 蛋白偶联受体； hGPCRc； 钙； CHO-K1细胞系； 工程细胞株 G 蛋白偶联受体 （G protein-coupled receptors， GPCRs） 一直在新药研发中占有极其重要的地位 1。 oGPCRs 是指其序列已知但配基和功能均不明了的 GPCR 成员， 其作为最重要的潜在药物靶

5、点， 对于创 新药物研究意义重大， 因而近年 oGPCRs 的研究倍 受关注 2。深入研究 oGPCRs 的瓶颈问题就是寻找 其内源性配基， 即 “去孤儿化” 。目前， 基于 oGPCRs 表达工程细胞株第二信使的检测手段是最常用的配 基筛选策略之一。根据已有文献及相关基因数据库 提供的信息， 我们首先从人体结肠组织克隆一个 GPCR 成员的完整编码区， 大小为 1014 bp （Gene- Bank 登录号为 AB083598） ， 命名为 hGPCRc， 不同软 件对该基因编码产物的初步分析表明，hGPCRc 编 码产物为一个含 7 个跨膜区段的蛋白分子， 与已知 人 P2Y1同源性最高，

6、 因此推测其与 Gq偶联的可能 性最大。Gq介导的效应表现为增加细胞内钙离子 浓度， 后者作为第二信使进一步完成相应的生理功 能和生化反应过程 3。鉴于此， 本研究构建了 pcD- NA3. 1 （ + ） -hGPCRc 表达载体， 转染 CHO-K1细胞 获得 CHO-hGPCRc 工程细胞株， 建立了基于细胞内 钙离子变化的配基筛选体系， 并对包括 P2Y1受体 部分已知配基在内的十余个化合物进行了检测。 1 材料与方法 1. 1 材料 1.1. 1 标本来源 人结肠组织系患者手术切除物。 新鲜静脉血来自健康志愿者。 1.1. 2 质粒、 菌株及细胞 含有通用引物测序质粒 载体 pGEM

7、-T Vectors 购自 Promega 公司； 大肠杆菌 E. coliDH5 菌株、 哺乳动物表达载体 pcDNA3. 1 （ + ） 和 CHO-K1细胞均由本研究室保存。 1. 1. 3 试剂及仪器 Taq 酶及反转录试剂盒 （TaKaRa 公司） ； BamH I、 EcoR I、 T4 DNA 连接酶、 核酸片断纯化试剂盒 （Promega 公司） ； X-gal 和 IPTG 购自北京欣经科生物技术公司； 全血基因组提取试 剂盒购自北京天为时代科技有限公司； 小牛血清、 DMEM 培养基、 G418（Gibco 公司） ； TRIzol 试剂及 Li- pofectamine

8、2000 转染试剂 （Invitrogen 公司） ； Fluo- 3/ AM 为美国分子探针公司产品； 腺嘌呤、 腺苷、 ATP、 鸟嘌呤、 鸟苷、 dNTP 等化合物 （Sigma 公司） 。 Radiance 2100 型激光扫描共聚焦显微镜 （LSCM， 美 国 BIO-RAD 公司） 。 1. 2 方法 1. 2. 1 引物设计及合成 参照的 hGPCRc 有关序 列， 利用软件 Primer5. 0 设计并合成一对 PCR 扩增 引 物：5-CGGGATCCATGAATGAGCCACTAGAC-3 （划线序列为 BamH I 酶切位点） ， 5-CGGGAATTCT- CAAGGG

9、TTGTTTGAG-3 （划线序列为 EcoR 酶切 位点） ； 同时设计并合成一对鼠源内参基因 GAPDH 的 引 物： 5-CCATGGAGAAGGCTGGGG-3， 5- 818中国药理学通报 Chinese Pharmacological Bulletin 2005 Jul； 21 （7） ： 818 22 CAAAGTTGTCATGGATGACC-3。 1. 2. 2 hGPCRc 全长 cDNA 的扩增及测序 按照 RNA 提取试剂盒说明书的步骤， 提取人结肠组织总 RNA， 利用反转录试剂盒进行 RT-PCR， 其反应参数 为： 30 保温 10 min， 42 60 min，

10、99 5 min， 5 5 min 合成第 1 条 cDNA 链， 再以该链为模板进行 PCR 扩增， 获得 hGPCRc 的完整编码双链， 扩增参数 为： 95 预变性 5 min 后， 按 94 45s， 52 45s， 72 1 min 的条件进行 30 个循环， 最后 72延伸 8 min。另外， 按照全血基因组提取试剂盒说明书的步 骤， 提取人血基因组 DNA， 用相同的引物以基因组 DNA 作为模板进行 PCR 扩增， 其扩增参数同 RT- PCR。扩增产物经片断纯化试剂盒纯化， 得到的两 纯化片断分别与 pGEM-T Vectors 用 T4 连接酶连 接， 再将连接产物转化大肠

11、杆菌 DH5 感受态， 并将 此菌液铺入含 LB 培养皿中 （LB 培养皿事先要加入 X-gal 和 IPTG） ， 挑选出阳性克隆， 经鉴定后由上海 联合基因公司进行测序。 1. 2. 3 hGPCRc 的序列分析 利用蛋白质跨膜螺 旋预测服务器 TMpred server 软件对 hGPCRc 的氨基 酸序列进行结构域分析。用蛋白质序列多重对齐软 件 （ClustalW/ X） 进行聚类分析后， 分子进化树用 TreeView 软件绘制。运用生物信息学中的电子基因 定位技术对 hGPCRc 基因进行染色体定位。 1. 2. 4 表达载体 pcDNA3. 1 （ + ） -hGPCRc 的构

12、建 和重组子鉴定 PCR 产物测序无误后， 与载体 pcD- NA 3. 1 （ + ） 各自进行 BamHI 和 EcoRI 双酶切， 将酶 切产物连接重组， 根据重组质粒大小、 酶切产物电泳 结果和 PCR 扩增结果对阳性重组子予以鉴定。 1. 2. 5 CHO 细胞系的培养、 转染及阳性克隆的筛 选 CHO-K1细胞在含体积分数为 15% 胎牛血清的 DMEM 培养液中培养， 分别以空载体 pcDNA3. 1 （ + ） 和重组表达载体 pcDNA3. 1 （ + ） -hGPCRc 转染 细胞， 前者作为对照。转染前 1 d， 接种 CHO-K1细 胞于 6 孔板， 使细胞密度在转染时

13、达贴壁层的 90%。具体转染步骤按 Lipofectamine 2000 转染试 剂的说明书进行。转染后 24h， 胰酶消化细胞并传 代。传代 2 d， 细胞培养体系加入浓度 800 mgL -1 的 G418进行筛选， 持续 10 14 d， 活存细胞为阳性克 隆， 用于相应细胞株的扩增和进一步鉴定。对于空 载体和表达载体的细胞株分别命名为 CHO-pcDNA 和 CHO-hGPCRc。 1.2. 6 RT-PCR 扩增转染细胞内 hGPCRc 之 mRNA 的表达情况 阳性克隆传代至少 20 代后， 以 TRIzol 试剂一步法提取细胞总 RNA。按照 RT-PCR 试剂盒 说明书操作，

14、分别扩增 hGPCRc 和内参照鼠源 GAP- DH 片断。将 RT-PCR 产物进行琼脂糖凝胶电泳， 对 目的基因进行分析鉴定。 1. 2. 7 激光扫描共聚焦显微镜测定 CHO-hG- PCRc 细胞株内钙离子浓度 4， 5经 G 418筛选获得的 CHO-hGPCRc 细胞株， 以 1. 0 107个L -1的浓度 接种于 24 孔培养板中， 完全贴壁后以 Hepes 液洗涤 细胞 2 次， 在 37， 避光条件下用 Fluo-3/ AM （10 molL -1） 荷载 45 min； 再以 Hepes 液洗涤细胞 2 次， 洗去残余染料。然后， 每孔加入 400 l Hepes 液，

15、在共聚焦显微镜下确认荧光荷载良好的细胞， 并 扫描 20 s。用微量加样器将预先配制好的腺嘌呤、 腺苷、 ATP、 鸟嘌呤、 鸟苷、 dNTP 等化合物沿光线加 入孔内， 终浓度均为1 000 molL -1； 阴性和阳性 对照组分别加入等体积的 Hepes 液和 CaCl2溶液。 加样后继续记录 Ca2 +信号的时间曲线。荧光强度 经校正后可计算细胞内钙离子浓度的绝对值， 二者 成正相关， 故本实验用荧光强度的变化来反映 Ca2 + i 的相对变化， 以判断被检化合物作用后细 胞内钙离子浓度的升降趋势。 2 结果 2. 1 hGPCRc 编码基因的 PCR 扩增产物及序列测 定 将 hGPC

16、Rc 克隆到 pGEM-T Vectors 中进行测 序， 测序结果显示， 本实验所得 RT-PCR 产物和 PCR 产物均为 1014 bp， 同已登录序列一致， 表明所得两 种 PCR 产物为同一产物， 说明 hGPCRc 没有内含 子， 该结果符合大多数 GPCRs 基因没有内含子的规 律 1。 2. 2 hGPCRc 的主要生物信息学分析 对 hG- PCRc 的氨基酸序列分析结果显示 （Fig 1） ， 该产物 具有 7 个明显的跨膜区域和胞内、 外区段， 符合 GPCR 较典型的跨膜蛋白结构域特征， 同时也表明 所克隆 hGPCRc 基因编码一完整的 GPCR 蛋白； 聚 类分析结

17、果显示 hGPCRc 在进化树上与人源 P2Y1 受体最亲近， 二者的同源性为 36%， 因此推测， hG- PCRc 可能属于嘌呤类受体大家族； 另外， 将 hG- PCRc 序列与基因组数据库进行同源性检索比对， 结 果提示该基因定位于人 13q32. 2。 2. 3 hGPCRc 表达载体的构建和鉴定 琼脂糖凝 胶电泳结果显示， 重组载体 pcDNA 3. 1 （ + ） -hG- PCRc 和空白对照 pcDNA 3. 1 （ + ） 载体经 BamHI/ EcoRI 双酶切反应和以重组载体为模板的 PCR 扩增 反应均得到大小一致的单一特异片段 （Fig 2） 。说 明重组载体 pc

18、DNA3. 1 （ + ） -hGPCRc 定向克隆成 功。 918中国药理学通报 Chinese Pharmacological Bulletin 2005 Jul； 21 （7） MNEPLDYLANASDFPDYAAAFGNCTDENIPLKMHYLPVIYGIIFLVGFPGNAVVISTYIFKMRPWKSSTIIMLNLACTDLLYLTSLPELIHYYASGEN- WIFGDFMCKFIR FSFHFNLYSSILFLTGFSIFRYCVII HPMSCFSIKHTRC AVVACAVVWIISLVAVIPM TFLITSTNRTNRSACLDLTSSDELNTIK WYN L

19、ILTATTFCLPLVIVTLCYTTIIHTLTHGLQTDSCLKQKARRLTILLLLAFYVCFLPFHILRVIRIESRLLSISCSIENQIHEAYIVSRPLAALNTFGN LLLYVVV SDNFQQAVCSTVRCKVSGNLEQAKKISYS Fig 1 Amino acids sequence of hGPCRc The putative transmembrane domains are marked by boxes Fig 2 Identification of recombinant vector pcDNA3. 1 （ + ） -hGPCRc 1： D

20、NA Marker； 2： pcDNA 3. 1 （ + ） -hGPCRc/ BamH I + EcoR I； 3： pcDNA 3. 1 （ + ） / BamH I + EcoR I；4： PCR analysis of pcDNA 3. 1 （ + ） -hGPCRc 2. 4 CHO 细胞系的转染及阳性克隆的筛选 经脂 质体介导， 将空载体 pcDNA3. 1 （ + ） 和重组载体 pcDNA3. 1 （ + ） -hGPCRc 分别转染 CHO 细胞系。转 染细胞继续培养， 并以 G418（800 mgL -1） 筛选 10 14 d 后， 得到了多个抗性细胞克隆。挑取抗性克 隆

21、， 继续加压扩增培养， 得到含空载体的转染细胞和 CHO-hGPCRc 工程细胞株。 2. 5 CHO-hGPCRc 细胞株稳定表达 hGPCRc 的 鉴定 为了检测所得细胞珠稳定表达 hGPCRc 的情 况， 将分传至少 20 代的细胞珠作为检测对象进行 RT-PCR。结果显示， 表达载体转染细胞 hGPCRc 的 mRNA 表达较明显， 而空载体转染细胞则未检测到 相应表达产物 （Fig 3） 。 2. 6 各化合物对胞内钙浓度的影响 激光扫描共 聚焦显微镜的扫描结果见 Fig 4。前 20 s 是荧光强 度基准值， 之后为各化合物的荧光强度变化。加药 前 20s， 即静息状态下， 荧光强

22、度表现稳定， 在荧光 强度 - 时间曲线上表现为一平直的基线； 依次加入 腺嘌 呤、 腺 苷、 AMP、 ADP、 ATP、 鸟 嘌 呤、鸟 苷、 dGMP、 黄嘌呤、 次黄嘌呤、 激动素以及 dNTP 12 种化 合物后， 细胞内荧光强度均无明显改变， 而阳性对照 组 加入CaCl2后荧光强度明显升高。 提示， 该12种 Fig 3 RT-PCR amplification of hGPCRc from the engineered CHO-hGPCRc and CHO-pcDNA cells 1： DNA Marker； 2 and 4： RT-PCR amplification of h

23、GPCRc gene from CHO-hGPCRc and CHO-pcDNA cells； 3 and 5： RT-PCR amplifica- tion of GAPDH gene from the corresponding cells Fig 4 Compounds-inducedCa2 + iresponses in CHO-hGPCRc cells 化合物很可能都不是 hGPCRc 的特异性配基。 3 讨论 GPCR 是迄今最重要的新药研究靶点， 据统计， 以 GPCR 为 靶 点 的 新 药 数 量 约 占 药 物 市 场 的 028中国药理学通报 Chinese Pharma

24、cological Bulletin 2005 Jul； 21 （7） 40%6。GPCR 的共同特征是与 G 蛋白偶联， 通过 后者的介导实现各自的生理调节作用。根据 G 蛋 白 亚基的种类， 又可将 GPCR 分为主要与 Gs、 Gi、 Gq/11和 G12/13偶联的不同类别 7。大量关于 GPCR 信号转导通路的研究表明， 上述 4 类不同 G 蛋白 亚基分别影响不同的第二信使系统。其中， Gq/11被 活化后主要使细胞内钙离子浓度升高。根据分析推 测， hGPCRc 很可能与 Gq偶联。所以， 本研究首先 建立 hGPCRc 稳定表达的工程细胞株， 再分别以不 同的化合物作用于细胞株

25、， 通过检测胞内钙离子浓 度的变化分析 hGPCRc 是否被所检测化合物活化。 要建立基于工程细胞株的良好配基筛选体系， 靶细胞和检测信号的合理选择是两个关键因 素 8， 9。CHO-K 1作为常用的外源基因稳定表达的 真核细胞， 已充分显示出其优越性， 因此， 本研究选 择 CHO-K1作为 hGPCRc 表达的靶细胞。本研究结 果显示， hGPCRc 已在所得工程细胞株 CHO-hG- PCRc 中稳定表达 （Fig 3） 。Fluo-3 是新一代钙荧光 探针， 它与活细胞孵育一定时间后可透过细胞膜进 入胞内与游离钙结合， 通过检测细胞内的荧光强度 即可反映细胞内的钙离子浓度， 激光扫描共

26、聚焦显 微镜 （LSCM） 可在亚细胞水平上处理活的标本， 具 有较高的敏感性， 是目前细胞内钙离子荧光强度的 先进检测仪器。本研究的结果充分证明了该检测体 系的灵敏性和可靠性 （Fig 4） 。 对于任一 oGPCR 而言， 其配基确认通常需要对 化合物进行较大范围的筛选， 但也并非无规律可循。 一般应首先分析存在哪些与该 oGPCR 相近的已知 GPCR 成员， 然后再从已知 GPCR 成员的配基出发， 对该 oGPCR 成员进行检测。我们初步分析结果表 明， hGPCRc 与人 P2Y1最接近， 因此本研究选择了 包括 P2Y1配基在内的 10 余种化合物作用于 CHO- hGPCRc，

27、 但遗憾的是没有一种能够激活 hGPCRc， 进 一步证明了 hGPCRc 目前为一孤儿受体的推断。 当然， hGPCRc 本身也可能存在与我们初步分 析结果不相符的两个例外： 一是 hGPCRc 表达后因 翻译修饰不当而失去结合活性。我们曾成功以 CHO-K1为靶细胞建立人乙酰胆碱受体 M1亚型 （hM1R） 表达的工程细胞株， 当配基作用于该工程细 胞株后， 可通过检测胞内钙离子的荧光强度变化来 反映受体是否被激活， 获得了稳定可靠的结果 10， 而且其它类似的报道也很多， 因此这种例外的可能 性不大。二是 hGPCRc 可能并不与 Gq偶联， 因而活 化后亦并不以引起胞内钙离子浓度的变化

28、为主， 若 如此， 则需建立互为补充的其它第二信使或非第二 信使检测手段。只有这样， 才能够使 hGPCRc 去孤 儿化的步伐进一步加快。这一结果分析对于其它 oGPCRs 的研究也具有一定的借鉴意义。 参考文献： 1 Shigeki T，Shiro K，Shigeki M et al. Identification of G protein- coupled receptor genes from the human genome sequence J . FEBS Lett， 2002， 520 （1-3） ： 97 -101. 2 刘永学， 余少平. 孤儿 G 蛋白偶联受体及其作为新药靶

29、点的 重要意义 J . 中国药理学通报， 2003， 19 （6） ： 601 -4. 3 Caulfield MP，Birdsall NJ. International union of pharmacology. XVII. Classification of muscarinic acetylcholine receptors J . Pharmacol Rev， 1998， 50 （2） ： 279 -90. 4 Yokoyama T， Kato N， Yamada N. Development of a high-through- put bioassay to screen mel

30、atonin receptor agonists using human me- latonin receptor expressing CHO cells J . Neurosci Lett，2003， 344 （3） ： 45 -8. 5 Hemstapat K，Smith MT，Monteith GR. Measurement of intracel- lular Ca2 +in cultured rat embryonic hippocampal neurons using a fluorescence microplate reader： potential application

31、to biomolecu- lar screening J . J Pharmacol and Toxicol Meth， 2004， 49 （10） ： 81 -7. 6 Wise A，Gearing K，Rees S. Target validation of G-protein cou- pled receptors J . Drug Discovery Today， 2002， 7 （4） ： 235 -46. 7 Neves SR，Ram PT，Iyengar R. G protein pathways J . Science， 2002， 296 （5573） ： 1636 -9.

32、 8 Stadel JM，Wilson S，Bergsma DJ. Orphan G protein-coupled re- ceptors：a neglected opportunity for pioneer drug discovery J . Trends Pharmacol Sci， 1997， 18 （11） ： 430 -7. 9 Dowell SJ. Understanding GPCRs-from orphan receptors to novel drugs J . Drug Discovery Today， 2001， 6 （9） ： 884 -6. 10余少平， 熊永炎

33、， 王 琼 et al. CHO-hM1R 工程细胞的建立及 乙酰胆碱对细胞内钙离子浓度的影响 J . 中国药理与毒理 学杂志， 2004， 18 （1） ： 17 -21. Establishment and application of the engineered cells expressing a human G-protein-coupled receptor c YUAN Guang-sheng2，LIU Yong-xue1 （1. Dept of Pharmacology，Beijing Institute of Radiation Medicine，Beijing 10085

34、0， China； 2. Institute of Maize，Sichuan Agricultural University，Yaan 625014， China） Abstract： Aim To establish a screening system of or-phan G protein-coupled receptors（oGPCRs）for their 128中国药理学通报 Chinese Pharmacological Bulletin 2005 Jul； 21 （7） ligands based on monitoring Ca2 + i in engineered cel

35、ls. Methods The whole ORF of a member of hu- man oGPCR，designated human G-protein-coupled re- ceptor c（hGPCRc） ，was amplified by RT-PCR from human colon tissue and its structure was analyzed with softwares. CHO-K1cells were transfected with the re- combinant pcDNA 3. 1 （ + ） -hGPCRc to obtain engi-

36、neered CHO-hGPCRc cells.As fluorescence probe， Fluo-3 was used in assaying theCa2 + i changes in- duced by different compounds in the CHO- hGPCRc cells. Results Bioinformatic analysis showed that hG- PCRc was localized at 13q32. 2，and its corresponding amino acids formed seven-transmembrane domains

37、and was close to human P2Y1receptor. It was indicated that hGPCRc was a new member of human GPCR. CHO- hGPCRc cells expressing hGPCRc were obtained successfully but no one was able to activate hGPCRc a- mong the tested compounds indicated by theCa2 + i changes. Conclusion Although hGPCRc was even th

38、ough close to human P2Y1receptor，it can not be ac- tivated by the known compounds which activate the P2Y1receptor. hGPCRc might be a new member of pu- rine receptor family but dose not belong to P2Y1sub- family. Key words： orphan G protein-coupled receptors； hG- PCRc；calcium； CHO-K1cell line； engine

39、ered cells 大鼠心肌缺血再灌注时心肌细胞核 1， 4， 5 三磷酸肌醇受体结合特性改变的研究 张 红1， 周 红1， 司良毅2， 张乐之1， 何华美1 （第三军医大学 1. 第一附属医院老年科， 2. 药理学教研室，重庆 400038） 中国图书分类号： R-332； R 322. 11； R 329. 25； R 392. 11； R 542. 202 文献标识码： A 文章编号： 1001 -1978 （2005） 07 -0822 -05 摘要： 目的 观察大鼠心肌缺血再灌注时心肌细胞核 1， 4， 5 三磷酸肌醇受体 （IP3R） 的结合特性改变， 进一步探索心肌 缺血再灌注

40、时细胞凋亡的病理机制。方法 TUNEL 技术检 测心肌细胞核凋亡率。蔗糖密度梯度离心法提纯心肌细胞 核， 放射配体分析法检测心肌细胞核膜上 IP3R 的结合特性 变化。结果 缺血再灌注损伤 （IRI） 组大鼠心肌细胞凋 亡率高于对照组 （P 0. 01） 。大鼠心肌缺血再灌注损伤 时， 心肌细胞核 IP3R 的最大结合容量 Bmax较假手术组增加 2. 6 倍； 而其亲和力 Kd值无明显变化。 IRI 组心肌细胞核 IP3R 经激活的 PKC 磷酸化后结合特性增强 1. 54 倍，对照 组核 IP3R 经 PKC 磷酸化后结合特性无明显改变。 Ca2 + 对 IRI 组及假手术组心肌细胞核 I

41、P3R 的调节均呈双 相性， 胞浆钙超载状态下 （ Ca2 + 为 5 molL -1时） 较正常 胞浆钙浓度下 （ Ca2 + 为 100 nmolL -1时） ， 两组核 IP 3R 收稿日期： 2004 -12 -28， 修回日期： 2005 -01 -30 基金项目： 国家自然科学基金资助项目 （No 30100070） 作者简介： 张 红 （1976 - ） ， 女， 博士生， Tel： 023-68772766， E-mail： zhhong26 yahoo. com. cn； 何华美 （1968 - ） ， 博士， 副教授， 现在美国哈佛大学医学 院 B. W 医院心血管部生理化

42、学 NWR 实验室， 通讯作者， E-mail： hmhe rics. bwh. harvard. edu 结合特性均增强，Ca2 + 为 100 molL -1时， 两组核 IP 3R 结合特性降低。结论 大鼠心肌心肌缺血再灌注损伤病理 情况下心肌细胞核 IP3R 结合特性增强， 致核内钙浓度 （ Ca2 + n） 增高， 这可能是心肌缺血再灌注损伤中心肌细胞 凋亡的主要病理机制之一。 关键词： 缺血再灌注； 细胞核； 1， 4， 5 三磷酸肌醇受体； 细胞 凋亡 细胞内钙稳态失调是细胞凋亡程序启动及执行 的重要调控因素， 尤其核钙浓度增高在细胞凋亡的 启动及发展机制中发挥关键性作用 1。最

43、近实验 发现， 缺血心肌恢复灌注时， 伴随着 Ca2 + c 的升 高，Ca2 + n 呈持续性增高 2， 而且在再灌注早期 及晚期均存在细胞凋亡的发生 3， 因此学者们提出 心肌缺血再灌注时心肌细胞核钙超载与细胞凋亡密 切相关、 可能是启动及执行细胞凋亡程序的的重要 因素。IP3R 作为核钙主动转运系统中的主要受 体 4， 5， 是一种配体门控式的 Ca2 + 释放通道， 主要功 能是调控钙离子跨核膜运动， 以调控核钙浓度变化， 进而调节细胞核内各种生理功能。因此， 观察心肌 缺血再灌注时心肌细胞核 IP3R 结合特性变化及其 在 PKC 激活和胞浆钙超载病理情况下结合特性的 228中国药理学通报 Chinese Pharmacological Bulletin 2005 Jul； 21 （7） ： 822 6