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1、论著文章编号： !“# $%# .?679478 3AB56，10234/：CDEA: ?BA; .9A; 7 G/6B 检测 抗血清与 ) 个穿孔素侯选活性区域重组融合蛋白的免疫反应 性。将活性重组穿孔素体外作用 KLM0!NO !* * * 文献标识码 S * * 穿孔素或孔形成蛋白 （6.0I62478 6B.47，.0 I647） 是 =-T 细胞和 UV 细胞重要的效应分子，在体 内有着广泛的生物学作用 !， 。穿孔素基因缺陷可 导致严重的感染 !“ 材料“ 雄性新西兰大白兔 ) X #“ 方法 !; !* 免疫血清的制备及效价测定*将 !“ “8 的 K! 融合 蛋白 SN 溶液与
2、等体积的福氏完全佐剂混合后，于大白兔背 部多点皮下注射。!+ 9 后加强免疫 ! 次，改用福氏不完全佐 剂配制，融合蛋白用量同前。!“ 9 后，再加强免疫! 次，即以 )“ “8 融合蛋白经不完全佐剂等体积乳化后背部多点皮下注 射，再以 )“ “8 融合蛋白直接耳緣静脉注入。分别在大白兔 初次免疫前、每次加强免疫前及末次免疫后 # 9，由耳缘静脉 取血，分离血清，用免疫双扩法测定免疫血清的效价 !Q !( 时，心脏放血并分离血清。抗血清的效价测定，采用免疫双 扩法检测。 !; ; *抗血清的特异性鉴定*将穿孔素各侯选活性区域融 合蛋白进行 NFN0H1 后，经电转移转移至 U= 膜上。加 )“
3、 8_ T 封闭液 （脱脂奶粉 -SN 溶液） 于 +封闭过夜后，依次 滴加 !Q %“ 的抗血清、正常兔血清 （阴性对照） 室温孵育 ! 5， 用 -SN 缓冲液洗 U= 膜 （) 247 a ; ， 收集细胞， 涂片、 晾干， 经3# # 7?；按 A9?B?C?82 D9EC 广谱试剂盒步骤进行其余反应；*FG 显色，苏木素复染， 依次经盐酸分化、自来水冲洗、梯度酒精脱水、二甲苯透明 及中性树胶封片后观察结果。 !“ 结果 !# $“抗重组穿孔素血清的效价及特异性“经琼脂糖免疫双 扩法检测显示抗血清的效价为 != 15。HICJIK L98J 鉴定表明， 抗血清与穿孔素侯选活性区域重组融
4、合蛋白包括 ,4! （*CLF. ME99 9I O 1$:） 、 ,43 （P/.!#:.(） 、,4+ （*CLF.#:.Q） 均可产生免疫结合反 应 （图 !） 。 图 !R 抗重组穿孔素血清特异性的 HICJIK L98J 分析 ! O+：依次为 ,4! O ,4+S !# !“ 活性重组穿孔素作用部位分析“ 免疫组化染色显示，未 经活性重组穿孔素融合蛋白作用的 ,)-.!/011 感染的 23 细 胞染色呈阴性，而经活性重组穿孔素融合蛋白作用后，染色 呈阳性，染色阳性的部位在靶细胞的胞质和细胞膜 （图 5） 。 图5R 活性重组穿孔素作用部位的免疫组化染色检测 （ “3#） F：穿孔
5、素作用前 ,)-.!/011 感染的 23 细胞；G：穿孔素作用后 ,)-.!/011 感染的 23 细胞S %“ 讨论 为满足所获得的抗体可以与选择性表达穿孔素 各区域的融合蛋白都能特异性结合，我们所用免疫 蛋白为重组全长穿孔素。融合蛋白的分子伴侣 *CLF 是二硫键形成的主要催化酶 3，而穿孔素蛋白有着 丰富的二硫键，*CLF 可使穿孔素蛋白结构正确折 叠。并且去掉分子伴侣后，严重影响重组蛋白的得 率，故而免疫原为没有去除分子伴侣 *CLF 的融合蛋 白。 选择适当的免疫方案是获得特异性抗体的前 提 +。本研究中免疫所用融合蛋白分子质量较大， 较易获得抗体。佐剂的添加可提高目的蛋白的免疫
6、原性，所用弗氏佐剂是较强的免疫增强佐剂。但该 佐剂使用时须注意与蛋白充分混合，长久静置后佐 剂的水相和油相不应分离。背部多点皮下注射可以 充分激活淋巴管丰富的多个淋巴结区，以最大限度 提高抗体效价。免疫双扩结果显示，所获得的抗体 滴度高，HICJIK L98J 结果显示该抗体可以与 + 个穿 孔素侯选活性区域重组融合蛋白特异性结合。 穿孔素是免疫细胞杀伤病毒感染细胞的重要效 应分子，其作用方式主要是与靶细胞膜上的磷酸 胆碱结合，插入细胞膜，聚合，形成不同孔径的疏水 性跨膜通道，该孔径利于颗粒酶、Q0 等杀伤细胞因 子进入靶细胞，从而协同杀灭病变的靶细胞。本研 究中将活性重组穿孔素作用 ,)-.
7、!/011 感染 23 细 胞后，通过免疫组化观察穿孔素在靶细胞的定位情 况。结果证实活性的重组穿孔素作用后分布在胞质、 胞膜。该结果为进一步研究穿孔素的功能和生物治 疗应用奠定了研究基础。制备的多克隆抗体，经初 步验证其效价高，反应性好，为重组穿孔素体外研究 提供了有力的工具。 参考文献： !G:KKT 2，G9I:UV9IT W(S (TJ8J8U?U 9T7D;8UTJIC：:99 K8:6C J8 6I:J; X S !“# $%?8KI68? 5S K:D:? XF，/7TJ; 2XS0EUJ?8:9 C?)/Q!# YN1N 细胞与分子免疫学杂志 （(;? X (I99 289 )77E89） 5#， 55 （+）