依达拉奉注射液对兔心肌缺血再灌注损伤的保护作用.pdf

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1、6 依达拉奉注射液对兔心肌 缺血再灌注损伤的保护作用 席海龙8 ，郑泽琪6 ，施国祥。 ( 南昌大学a 研究生院医学部2 0 0 6 级；b 第一附属医院心血管内科； c 研究生院医学部2 0 0 7 级，南昌3 3 0 0 0 6 ) 摘要：目的观察依达拉奉注射液对兔心肌缺血再灌注损伤的保护作用，并探讨其作用机制。方法将4 8 只新 西兰大白兔随机分为3 组：假手术组、缺血再灌注组、依达拉奉治疗组，每组1 6 只。建立兔急性心肌缺血再灌注损 伤模型。假手术组使用生理盐水5m g k g ，经股静脉滴注；缺血再灌注组使用生理盐水5r a g k g ，经股静脉滴注；依 达拉奉治疗组使用依达拉奉

2、注射液5m g k g 加入5 葡萄糖注射液2 0m L 中，经股静脉滴注，代替生理盐水。术 中观察心电图变化，测定各组缺血前5r a i n 、缺血后4 5m i n 、再灌注后6 0 、1 2 0r a i n 血清心肌肌钙蛋白I ( c T n I ) 、丙 二醛( M D A ) 的含餐和肌酸激酶同工酶M B ( C K M B ) 、超氧化物歧化酶( S O D ) 的活性；再灌注结束后缺血再灌注组， 依达拉奉治疗组各取8 只兔心脏进行E v a n s 蓝一氯化三苯基四氮唑( T T C ) 染色后。采用称重法测定心肌梗死范围；各 组另8 只兔心肌组织经H E 染色后通过光学显微镜

3、观察病理变化，透射电境观察心肌组织超微结构的变化。结果 与缺血再灌注组比较，依达拉奉治疗组C K M B 的活性及c T n I 、M D A 的含萤均明显降低( 均P o 1m V ，或 R 波波幅增高和左心室苍白作为判定缺血成功的标 准；松开左冠状动脉前降支血管结扎线后，抬高的 S T 段下降和( 或) T 波回落 5 0 以上作为再灌注 成功的标准口 。实验白兔的排除条件：结扎L A D 失败或发现未再灌注者；各种原因导致的心力衰 竭者。 1 4 3 检测方法 血清C K M B 、c T nI 、M D A 、S O D 测定：采用酶 动力学法，在全自动生化分析仪上测定C K M B

4、的 活性，固相酶联免疫吸附试验( E L I S A ) 法检测 c T n I 的含量，采用硫代巴比妥酸法检测M D A 的含 量，采用黄嘌呤氧化酶法检测S O D 的活性，操作均 按试剂盒说明书进行。 1 4 4 心肌梗死范围测定 缺血再灌注组、依达拉奉治疗组于再灌注后 1 2 0m i n 随机选取8 只兔，再次结扎左冠状动脉前 降支，于主动脉口注入2 E v a n s 蓝3 4m L ，待心 脏充分染色后，剪下心脏，4 生理盐水清洗，可见 非缺血心肌呈蓝色，缺血心肌不染色，将心脏置 于- - 2 0 冰箱1h ，分离缺血心肌与非缺血心肌，将 缺血区心室肌以平行于房室沟的方向切成厚2m

5、 m 左右的薄片置于1 氯化三苯基四氮唑( T T C ) 磷 酸缓冲液( p H 7 4 ) 中3 7 恒温水浴1 5m i n 。非梗 死区染为红色，梗死区不染色，将染色区( 非梗死区) 与未染色区( 梗死区) 分离并分别称重，二者之和为 缺血心肌的重量，梗死心肌占缺血心肌的重量百分 比即为梗死范围【4 J 。 1 4 5光学显微镜观察心肌组织病理变化 各组再灌注后1 2 0m i n 剪下另8 只兔心脏，取 缺血区中央部位心内膜心肌( 假手术组取相应部位 心肌) ，予1 0 甲醛固定后，石蜡包埋，常规组织学 处理，H E 染色后，制作心肌切片标本，通过光学显 微镜观察心肌组织形态学的变化

6、。 1 4 6透射显微镜观察心肌超微结构 再灌注后1 2 0r a i n 在另8 只兔心脏缺血区中央 部位取1m m lm m 1m m 心肌标本( 假手术组 取相应部位心肌) ，用2 5 戊二醛处理，1 饿酸固 定6 0m i n ，脱水、渗透、包埋，然后进行切片，用透射 电镜观察心肌细胞膜、细胞质、肌原纤维、线粒体等 超微结构的变化。 1 5 统计学处理 采用S P S S l 0 0 软件对数据进行分析。计量资 料以j 土s 表示，采用重复测量的方差分析及S N K - q 检验，以P ( O 0 5 为差异有统计学意义。 2结果 2 1 各组不同时间点血清C K - M B 活性的变

7、化 缺血前5m i n 血清C K - M B 活性各组间比较差 异无统计学意义( P 0 0 5 ) 。与缺血前、同时间点 假手术组比较，缺血再灌注组、依达拉奉治疗组缺血 后4 5m i n 、再灌注后6 0 、1 2 0m i n 血清C K M B 活性 均明显升高( 均P ( 0 0 5 ) 。缺血再灌注组缺血后 4 5m i n 血清C K M B 活性与依达拉奉治疗组比较差 异无统计学意义( P 0 0 5 ) 。与缺血再灌注组比 较，依达拉奉治疗组再灌注后6 0 、1 2 0m i n 血清C K M B 活性均降低( 均P 0 0 5 ) 。与缺血前、同时问点假 手术组比较，缺

8、血再灌注组、依达拉奉治疗组缺血后 4 5r a i n 、再灌注后6 0 、1 2 0m i n 血清c T nI 含量均明 显升高( 均P 0 0 5 ) 。与缺血再灌注组比较，依达拉 奉治疗组再灌注后6 0 、1 2 0m i n 血清c T nI 含量均 降低( 均P 0 0 5 ) 。与缺血前、同时间点 假手术组比较，缺血再灌注组、依达拉奉治疗组缺血 后4 5m i n 、再灌注后6 0 、1 2 0m i n 血清M D A 的含量 均明显升高( 均P 0 0 5 ) 。与缺血再灌注组比 较，依达拉奉治疗组再灌注后6 0 、1 2 0m i n 血清 M D A 的含量均降低( 均P

9、 o 0 5 ) ；缺血后4 5m i nB 组、C 组 血清S O D 明显降低( P 0 0 5 ) ；缺血血后4 5m i n 、再灌注 后6 0m i nS o D 的活性均较假手术组降低( 均P 0 0 5 ) ；依达拉奉治疗组再灌注后6 0 、1 2 0m i n 血清 S o D 活性均较缺血再灌注组升高( 均P o 0 5 ) ；依 达拉奉治疗组再灌注后6 0 、1 2 0m i nS O D 的活性均 较缺血后4 5m i n 升高。见表4 。 表4 各组不同时间点S O D 活性的比较( i 士s ，U L ) 与缺血前5r a i n 比较* P 0 0 5 f 与同时间

10、点假手术组比较，# P 0 0 5 与缺血后4 5r a i n 比较。P 0 0 5 ，与缺血再灌注组比较。* * P 0 0 5 2 5 心肌梗死范围 依达拉奉治疗组心肌梗死范围为( 3 5 3 l 4 2 7 ) ，缺血再灌注组为( 5 5 5 3 5 9 1 ) ，2 组比 较差异有统计学意义( P 0 0 5 ) 。 2 6 光学显微镜观察心肌组织形态学的变化 假手术组心肌组织无变性、坏死，心肌间质无明 显水肿( 封二图1 A ) ；缺血再灌注组心肌组织变性、 坏死，心肌间质明显水肿、出血( 封二图1 B ) ；依达拉 奉治疗组心肌组织变性、坏死明显减轻，心肌间质有 水肿、出血( 封

11、二图1 C ) 。 2 7 透射电镜观察心肌的超微结构 假手术组心肌纤维排列连续规则，Z 线清楚，线 粒体结构完整、清晰，嵴排列整齐，嵴间隙明显( 封二 图2 A ) ；缺血再灌注组心肌纤维排列紊乱，部分肌纤 维溶解、断裂，Z 线不清，线粒体严重肿胀，空泡样变 性( 封二图2 B ) ；依达拉奉治疗组心肌纤维排列轻度 紊乱，Z 线清楚，线粒体轻度肿胀，少数空泡样变性 ( 封二图2 C ) 。 3 讨论 生理状态下心肌内存在一定量的O F R ，然而当 万方数据 1 0 婆亘匡堂堕兰堡兰壁壁竺生蔓兰竺堂苎苎塑 垒! 丝垒! 竺丝竺垫! 丝塑竺! 生垫! 曼型兰壁竺竺：! 竺! ! 竺：型竺苎 组

12、织细胞缺血、缺氧时O F R 清除系统功能降低，生 成系统活性增强；当组织恢复血液和氧供时，便产生 大量的O F R ，以各种方式造成细胞急性或慢性损 伤L 5 】。O F R 在再灌注开始前几分钟内生成过多是 缺血再灌注损伤发病机制的重要环节。因此，把握 再灌注开始几分钟内的时间窗、有效清除再灌注时 生成的大量O F R 、减轻O F R 的细胞毒性损伤对于 再灌注心肌保护具有重要意义 6 。本实验心肌缺血 再灌注过程中产生的O F R 是造成心肌损伤的主要 因素。C K M B 是一种存在于心肌细胞内的蛋白 酶，c T nI 是存在于心肌肌原纤维中细肌丝上的收缩 调节蛋白，当细胞损伤或坏死

13、时，C K - M B 、c T n I 便可从 细胞内释放到血液中，因此测定血清C K - M B 、c T nI 可作为反映心肌坏死程度的一个指标，可以比较准 确反映细胞受损的程度。O F R 介导的细胞膜脂质 过氧化反应是心肌再灌注损伤的一种重要诱发因 素J 。M D A 是脂质过氧化反应的最终产物，测定 M D A 的含量可反映组织中F R 含量和脂质过氧化 程度；同时心肌缺血再灌注时产生过多的O F R ，大 量S O D 的消耗导致体内的S O D 活性下降。因此 S o D 的高低可以间接反映机体清除O F R 的能力。 心肌保护中应用O F R 清除剂或抗氧化剂可以明显 降低组

14、织O F R 浓度，促进心功能恢复。 本实验建立了兔急性心肌缺血再灌注模型，心 电图、心肌酶学、E v a n s 蓝一T T C 染色均显示模型构 建成功。本实验中发现依达拉奉注射液能明显降低 心肌缺血再灌注损伤兔血清M D A 含量，升高S o D 活性，表明其既保护内源性F R 清除剂S o D 活力， 又减轻心肌细胞膜脂质过氧化的损伤，从而增强了 心肌细胞的抗F R 损伤能力，保护了缺血再灌注心 肌。这提示抑制F R 氧化应激损伤是依达拉奉注射 液保护缺血再灌注组心肌损伤的重要机制。依达拉 奉注射液作为一种新型的F R 清除剂，具有F R 清 除和抑制脂质过氧化的作用，它还叮以明显阻止

15、心 肌硫代巴比妥酸反应物的增加及磷酸肌酸Z 一磷酸 腺苷的下降。阻止异丙肾上腺素引起的心肌内解耦 联蛋白一m R N A 及蛋白表达的增加，从而改善心脏 的能量代谢邛 。依达拉奉注射液清除再灌注时产生 的O F R ，进而抑制线粒体脂质过氧化作用，这可能 是在线粒体水平的抗凋亡机制。此外除传统的抑制 花生四烯酸脂氧合酶途径外，对羟自由基( O H ) 的 有效清除可能是其产生强效心肌保护作用并区别于 其他F R 清除剂的优势所在 9 。本研究结果显示， 依达拉奉注射液作为一种可清除多种活性氧的强效 F R 清除剂在缺血心肌再灌注开始前静脉给予进行 心肌保护简易可行、安全、有效。因此，临床上进行

16、 急诊介入血运重建抢救急性冠脉综合征患者时，可 考虑在开通冠状动脉前行冠脉内注射依达拉奉注射 液以抑制再灌注早期严重的氧化应激，减轻缺血再 灌注损伤，进一步改善患者的预后。 综上所述，依达拉奉注射液作为一种新型的 F R 清除剂，除了临床上已用于急性脑梗死治疗外， 在动物心肌缺血再灌注模型中也显示出了有效的治 疗作用；相信随着对其机制研究的进一步深入，它将 会在临床上呈现出良好的应用前景。 参考文献： 1 3F e r d i n a n d yP 。S c h u l zR ，B a x t e rGF I n t e r a c t i o no fC a r d i o v a s c

17、u l a rR i s kF a c t o r sw i t hM y o c a r d i a lI s c h e m i a R e p e H u s i o nI n j u r y P r e c o n d i t i o n i n g ，a n dP o s t e o n d i t i o n i n g J P h a r m a c o lR e v 。 2 0 0 7 5 9 ( 4 ) 1 4 1 8 4 5 8 2 H i g a s h iY ，J i t a u i k iD 。C h a y a m aK e ta 1 E d a r a v o n

18、 e ( 3 一m e t h y l 一1 一p h e n - y l 一2 一p y r a z o l i n - 5 一o n e ) 。aN o v e lF r e eR a d i c a lS c a v e n g e r ，f o r T r e a t m e n to fC a r d i o v a s c u l a rD i s e a s e s J R e c e n tP a tC a r d i o v a s eD r u gD i S C O V ，2 0 0 6 ，1 ( 1 ) ：8 5 9 3 3 3 郭莲怡。刘仁光兔心肌缺血再灌注心电图分析

19、刀心电学杂 志。2 0 0 3 2 2 ( 2 ) ：8 4 8 6 4 吕萍萍，朱立，郦阳明缺血后处理对抗大鼠离体心脏缺血再灌 注损伤及其作用机制 J 中国病理生理杂志。2 0 0 8 。2 4 ( 5 ) ： 8 4 9 - 8 5 1 5 3 R u i zC A n e sJA 。L o p e z 【IS ，G o m a l e zR u b i oM 。e ta 1 R e a c t i v e O x y g e nS o e c i e aI n d u c eP r o l i f e r a t i o no fB o v i n eA o r t i cE n d o

20、 t h e l i a l C e l l s J C a r d i o v a s c P h a r m a c o l 。2 0 0 0 3 5 ( 1 ) ：1 0 9 - 1 1 3 6 刘秀华，唐朝枢缺血再灌注损伤的防治从实验室到临床 J 中华心血管病杂志2 0 0 6 3 4 ( 8 ) ：6 7 7 6 7 9 7 H o f f m a nJwJ r G i l b e r tTB 。P o s t o nRS e ta 1 M y o c a r d i a l R e p e d u s i o nI n j u r y ：E t i o l o g y 。M e c

21、 h a n i s m s ，a n dT h e r a p i e s J E x t r aC o r p o rT e c h n o l 。2 0 0 4 ，3 6 ( 4 ) ：3 9 1 - 4 1 1 8 I s h i z a w aM M i z u s h i g eK ，N o m aT ，e ta 1 A nA n t i o x i d a n tT r e a t m e n tP o t e n t i a l l yP r o t e c t sM y o c a r d i a lE n e r g yM e m b o l i s mb yR e g u

22、 l a t i n gU n c o u p l i n gP m t d n2E x p r e s s i o ni naC h r o n i cA d r e n e r g i e S t i m u l a t i o nR a tM o a d J I A f eS c i ，2 0 0 6 。7 8 ( 2 5 ) ：2 9 7 4 2 9 8 2 9 O n o g iH ，M i n a t o g u c h iS C h e nXH e ta 1 E d a r a v o n eR e d u c e s M y o c a r d i a lI n f a r c

23、 tS i z ea n dI m p r o v e sC a r d i a cF u n c t i o na n dR e m o d e l l i n gi nR a b b i t s C J - C l i nE x pP h a r m a c o lP h y s i 0 1 2 0 0 6 ，3 3 ( 1 1 ) ：1 0 3 5 - 1 0 4 1 ( 责任编辑：胡炜华) 万方数据 A 假手术组B 缺I f l L i t 灌注组：C 。依达托奉治疗组 N 2 告组心肌纽0 超徽结构的变化 彩色多普勒超声对中期妊娠胎儿大脑中动脉、脐动脉、静脉导管血流动力学的初探( 正文见第6 3 页) 图】大脑i 1 1 1 s 环 图2 大脑小动脉m 流频谱图3 脐动脉m 流频谱 圈4 静脉导管t f l l 流频谱 万方数据