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1、 3 8 全脑缺血一再灌注对海马C A l 区G A D 6 5 表达的影响及意义 许林峰1 马文裴3 刘静2 冯忠堂D 昆明医学院1 ) 神经科学研究所2 ) 第二附属医院神经外科3 ) 生理教研室昆明 6 5 0 0 3 1 【摘要】目的探讨全脑缺血一再灌注对成年大鼠海马C A l 区G A D 6 5 表达的影响及意义。方法成年雄性S D 大鼠2 4 只， 随机分为3 组：假手术组( S H ) 、缺血一再灌注3 d 组( I R _ 3 ) 及缺血一再灌注7 d 组( I R - 7 ) ，每组8 只。采用四动脉阻断法制作全脑缺 血一再灌注模型，应用免疫组织化学方法检测海马C A l
2、区谷氨酸脱羧酶( g l u t a m i ca c i dd e c a r b o x y l a s e ，G A D ) 同工酶G A D 6 5 的表达 变化。结果与假手术组相比，I R - 3 组G A D 6 5 的表达明显增多，I R - 7 组恢复正常。结论G A B A 能中间神经元对缺血相对耐受； 全脑缺血一再灌注3 dG A D 6 5 的表达增多可能是一种代偿性的机制，以减轻脑缺血后的高兴奋性。 【关键词】脑缺血；再灌注；谷氨酸脱羧酶；海马；大鼠 【中图分类号】R 一3 3 2 【文献标识码】A 【文章编号】1 6 7 3 5 1 1 0 ( 2 0 0 8 ) 0
3、 6 0 0 3 8 0 2 E f f e c ta n ds i g n i f i c a n c eo fg l o b a li s c h e m i a - r e p e r f u s i o no nt h ee x p r e s s i o no fG A D 6 5i nh i p p o c a m p a lC A lr e g i o n X u L i n f e n 9 1 ，M aW e n p e i ”，L i uJ i n g ”，e ta 1 1 ) I n s t i t u t ef o rR e s e a r c ho nN e u r o
4、 s c i e n c e2 ) D e p a r t m e n to fN e u r o s u r g e r y ，S e c o n d A i l i a t e dH o s p i t a l3 ) D e p a r t m e n to fP h y s i o l o g y ，K u n m i n gM e d i c a lC o l l e g e 。K u n m i n g6 5 0 0 31 ，C h i n a A b s t r a c t 0 b j e c t i v e T oo b s e r v et h ee f f e c to fg
5、 l o b a li s c h e m i a - r e p e r f u s i o no nt h ee x p r e s s i o no fG A D 6 5i nt h eh i p p o c a m p a lC A I r e g i o no fa d u l tr a t s M e t h o d s 2 4m a l eS Dr a t sw e r er a n d o m l yd i v i d e di n t ot h r e eg r o u p s ：s h a m - o p e r a t i o ng r o u p ( S H ，挖= 8
6、 ) ，i s c h e m i a - r e p e r f u s i o nt h r e ed a y s ( I R - 3 ，行= 8 ) a n ds e v e nd a y sg r o u p ( I R - 7 ，雄一8 ) G l o b a li s c h e m i ce p i s o d ew a sa c h i e v e db y4 - v e s s e lo c c l u s i o n I m m u n o h i s t o c h e m i c a lm e t h o dw a sa p p l i e dt Oo b s e r
7、v et h ee x p r e s s i o no fG A D 6 5i nh i p p o c a m p a lC A Ir e g i o n R e s u l t s A ti s c h e m i a - r e p e r f u s i o nt h i r dd a y 。t h ei m m u n o r e a c t i v i t i e so ft h eG A D6 5w e r em a r k e d l ye l e v a t e di nt h eC A lr e g i o nc o m p a r e dw i t hs h a mo
8、p e r a t e d g r o u p 。b u tt h ei m m u n o r e a c t i v i t i e sr e c o v e r e dt Ot h es h a ml e v e la ti s c h e m i a - r e p e r f u s i o ns e v e n t hd a y C o n c l u s i o nG A B A e r g i ei n t e r n e u - t o n sr e l a t i v e l yr e s i s t a n tt Oi s c h e m i a - r e p e r
9、f u s i o ni n j u r y ，a n dt h ei n c r e a s i n ge x p r e s s i o no fG A D 6 53 da f t e ri s c h e m i a - r e p e r f u s i o nc a nb e ac o m p e n s a t o r ym e c h a n i s mt Or e d u c et h eh y p e r e x c i t a b i l i t ya s s o c i a t e dw i t hi s c h e m i a - r e p e r f u s i o
10、 n K e yw o r d s B r a i ni s c h e m i a ；R e p e r f u s i o n ；G A D 6 5 ；H i p p o c a m p u s ；R a t y 一氨基丁酸( 7 一a m i n o b u t y r i ca c i d ，G A B A ) 是哺乳 类动物中枢神经系统中最重要的一种抑制性氨基酸递 质 1 ，G A B A 能的抑制作用在调控谷氨酸能突触的活 动中起重要作用。因此，G A B A 能系统的异常可导致 神经元的高兴奋性，从而导致再灌注损伤。因而研究 脑缺血后G A B A 功能的变化，对脑缺血的治疗有重
11、要 的指导意义。本研究通过建立全脑缺血一再灌注动物 模型，探讨成年大鼠海马C A l 区G A D 6 5 的表达变化 及意义。 1 材料和方法 1 1 实验动物及分组 2 4 只雄性S D 大鼠，体质量 2 0 0 2 5 0 9 ( 昆明医学院实验动物中心提供) ，随机分为 3 组：假手术组( S H ，z = 8 ) ，缺血再灌注3 d 组( I R 一3 ，z = 8 ) 和缺血再灌注7 d 组( I R 一7 ，行一8 ) 。 1 2 全脑缺血一再灌注模型制备采用四血管阻断法 制作全脑缺血一再灌注动物模型。以0 4 戊巴比妥 钠( 4 0m g k g ) 腹腔注射麻醉后，从后颈部正
12、中纵形切 开皮肤，分离椎旁肌，暴露第一颈椎翼状孔，电灼烧凝 固双侧椎动脉，造成永久性关闭。再从颈前正中纵形 切开皮肤，分离双侧颈总动脉，分别用丝线绕过双侧颈 总动脉，将丝线的另一端置于皮肤切口外，不完全缝合 皮肤切口以备次日用。2 4 h 后用留置丝线将双侧颈总 动脉由皮肤切口牵出，用动脉夹夹闭双侧颈总动脉 1 0 m i n 后再通。保持肛温3 7 。模型成功标准：l m i n 内昏迷，双侧瞳孔放大，翻正反射消失。假手术组仅暴 露双侧颈总动脉和翼小孔，不作缺血处理。 1 3 标本取材及制作脑组织切片假手术组在再灌 注后2 4 h ，实验组在再灌注后相应时间点经0 4 戊巴 比妥钠( 4 0
13、m g k g ) 腹腔注射麻醉后，先后用0 9 生 理盐水及4 多聚甲醛1 5 0 m l 常规灌注固定，断头取 脑放人4 多聚甲醛，4 0 冰箱内过夜，乙醇梯度脱 水，二甲苯透明，石蜡包埋及切片。 1 4 免疫组化染色采用A B C 法进行免疫组化染 色，胞浆呈棕褐色为G A D 6 5 阳性反应神经元。 G A D 6 5 多克隆抗体购于武汉博士德生物工程有限公 司。 1 5G A D 6 5 光密度值测定采用H P I A S - 1 0 0 0 高清 晰彩色病理图像分析系统，测定每张切片G A D 6 5 免 疫组织化学染色的光密度值，每张切片于海马C A l 区 随机选取5 个视野
14、分别进行测定，取其均数。 1 6 统计学分析应用S P S S1 0 0 版软件进行统计 分析，资料以均数标准差( z 土s ) 表示，进行单因素方 万方数据 差分析。 s l h 自w l t 3 l G D _ 6 5 图1全脑缺血一再灌注对海马C A l 区 G A D 6 5 表达的影晌( 光密度值) 2 结果 与假手术组( s h a m ，7 l = 8 ，1 0 8 9 3 0 ) 相比： G A D 6 5 的光密度值在缺血再灌注后3 d ( I R 一3 ，l 一8 ， 1 1 9 6 3 7 ，P 0 0 5 ) 差异无统计学意义( 见 图1 ) 。 3 讨论 海马C A
15、l 区锥体细胞是对脑缺血最为敏感的细 胞之二。在海马C A l 区，锥体细胞受多重G A B A 能 神经元支配，突触前G A B A 能中间神经元与突触后的 锥体细胞形成多个抑制性突触联系。G A B A 由G A B A 能中间神经元释放人突触间隙后，通过与G A B A 受体相结合，介导抑制性突触后电流( I P S C ) 的产生， 对谷氨酸等兴奋性氨基酸的“兴奋毒”作用具有直接的 对抗作用 2 。在成年动物，G A B A 发挥保护作用主要 通过激活G A B A A 受体，增加C 1 一的内流，从而导致突 触后膜的超极化来实现。 G A B A 在G A B A 能中间神经元内由谷
16、氨酸在谷 氨酸脱羧酶的催化下脱羧生成。G A D 有两种同工酶， G A D 6 5 和G A D 6 7 ，分子量分别为6 5 K D 、6 7 K D ，均以 磷酸吡多醛( V i t B 。) 作为辅酶。新生儿可因为缺少 V i t B 6 ，G A B A 合成减少而发生癫痫 3 。其中，G A D 6 5 位于神经末梢，与突触囊膜相结合，调控突触部位的 G A B A 合成与释放 4 - 5 ，因而在G A B A 能突触传递中 起着关键的作用r 6 1 。 本实验发现，缺血再灌注3 dG A D 6 5 的表达明显增多， 再灌注7 d 恢复正常。在脑内，合成G A B A 的前体物
17、 质谷氨酸的含量丰富，因此，G A D 的活性可调节 G A B A 的合成速度和G A B A 的含量，其分布与G A B A 能神经元又大多一致，所以，G A D 是G A B A 能神 经元极好的标志酶 3 。常通过测定脑组织G A D 活性 或G A D 阳性神经元的数量、形态来反映中枢神经系 统G A B A 能神经元的功能状态 7 。因此，本实验结果 一方面支持G A B A 能中间神经元更能对抗脑缺血的 损害 8 ，而缺血再灌注3 d 时，G A B A 能中间神经元功 能代偿性的增强，通过G A D 6 5 的表达增多来增加突 触末梢G A B A 的合成和释放来而使抑制性突触
18、功能 增强，降低脑缺血后的高兴奋性，从而减轻锥体细胞的 损伤。因而，此时G A D 6 5 的表达增多是一种代偿性 的机制以对抗缺血后的兴奋性毒性。 参考文献 1 3F r a h mC ，H a u p tC ，w i t t eo w G A B An e u r o n ss u r v i v ef o c a li s - c h e m i ci n j u r y C J N e u r o s c i e n c e ，2 0 0 4 ，1 2 7 1 3 4 1 3 4 6 2 3 M a t s u m o t oN ，K u m a m o t oE ，F u r u e
19、H ，e ta LG A B A - m e d i a t e d i n h i b i t i o no fg l u t a m a t er e l e a s ed u r i n gi s c h e m i ai ns u b s t a n t i ag e l a t - i n o s ao ft h ea d u l tr a t J JN e u r o p h y s i o l ，2 0 0 3 ，8 9 1 2 5 7 - 2 6 4 3 关新民主编医学神经生物学 M 北京：人民卫生出版社， 2 0 0 2 ：1 2 5 4 K a n gT C ，P a r
20、kS K ，H w a n gI K S p a t i a la n dt e m p o r a la l t e r a t i o n s i nt h eG A B As h u n ti nt h eg e r b i lh i p p o c a m p u sf o l l o w i n gt r a n s i e n t i s c h e m i a J B r a i nR e s ，2 0 0 2 ，9 4 4 ：1 0 - 1 8 5 N a m c h u kM ，L i n d s a yL ，T u r c kC W ，e ta 1 P h o s p h
21、o r y l a t i o no f s e r i n er e s i d u e s3 ，6 ，1 0 ，a n d1 3d i s t i n g u i s h e sm e m b r a n ea n c h o r e d f r o ms o l u b l eg l u t a m i ca c i dd e c a r b o x y l a s e6 5a n di sr e s t r i c t e dt o g l u t a m i ca c i dd e c a r b o x y l a s e6 5 a l p h a J JB i o lC h e
22、m ，1 9 9 7 ，2 7 2l 1 5 4 8 - 1 5 5 7 6 K a u f m a nD L ，H o u s e rC R ，T o b i nA J T w of o r m so ft h eg a m m a - a m i n o b u t y r i ca c i ds y n t h e t i ce n z y m eg l u t a m a t ed e c a r b o x y l a s eh a v e d i s t i n c ti n t r a n e u r o n a Id i s t r i b u t i o n sa n dc
23、o f a c t o ri n t e r a c t i o n s J J N e u r o c h e m ，1 9 9 1 ，5 6 ：7 2 0 7 2 3 7 B e n s o nD L ，H u n t s m a nM M ，J o n e sE G A c t i v i t y - d e p e n d e n tc h a n - g e si nG A Da n dp r e p r o t a c h y k i ni nm R N Ai nv i s u a lc O r t e xo fa d u l t m o n k e y s J C e r e b
24、 c o r t e x 。1 9 9 4 ，4 ：4 0 5 1 8 K o b a y a s h iM ，W e nX ，B u c k m a s t e rP sR e d u c e di n h i b i t i o na n di n - c r c a s e do u t p u to tl a y e rI In e u r o n si nt h em e d i a le n t o r h i n a lc o r t e x i nam o d e lo ft e m p o r a ll o b ee p i l e p s y J JN e u r o s c i 。2 0 0 3 ，2 3 ： 8 4 7 1 8 4 7 9 ( 收稿2 0 0 8 - 0 4 1 0 ) 微血管减压与面神经梳理治疗面肌痉挛 郭东才”孙来广1 闫长祥2 1 ) 河南新乡市中心医院神经外科新乡4 5 3 0 0 02 ) 北京三博脑科医院神经外科北京 1 0 0 0 3 8 【摘要】目的探讨治疗面肌痉挛的有效方溉方法对4 2 例面肌痉挛病人行微血管减压加面神经梳理术。结果术后痉 柚 西 德 驰 ， I l l l 备；c 口 万方数据