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1、第3 0 卷第6 期 2 0 0 8 年1 2 月 大连医科大学学报 J o u r n a lo fD a f i a nM e d i c a lU n i v e r s i t y V 0 1 3 0N o 6 D e c 2 0 0 8 冷冻保存E p o n 8 12 包埋剂在电镜样品制备中的应用 吕广艳，魏晓晴，曲淑贤，高船舟，高 颖 ( 大连医科大学辽宁省医学细胞分子生物学重点实验室，辽宁大连1 1 6 0 4 4 ) 摘要： 目的 探讨冷冻保存E p o n 8 1 2 包埋剂及其再利用的方法。 方法 将电镜样品制备中剩余包埋剂在特定条 件下冷冻保存需要时解冻，进行常规浸透包
2、埋。比较包埋荆冷冻前后超薄切片的切割性能。 结果 用冷冻后复 温的包埋剂制备的包埋块，超薄切片时切割性能良好，两种包埋剂制备的样品各项观察指标无明显差异。 结论 冷冻保存E p o n 8 1 2 包埋剂及其再利用的方法是可行的。 关键词：包埋剂；透射电镜；样品制备；超薄切片 中图分类号：R 一3 3 1 文献标志码：B 文章编号：1 6 7 1 7 2 9 5 ( 2 0 0 8 ) 0 6 0 5 8 6 0 2 在透射电镜常规样品制备过程中，包埋剂是必不可少的 化学试剂之一。通常E p o n 8 1 2 环氧树脂是比较常用的包埋 剂。但由于E p o n 8 1 2 环氧树脂包埋剂价格
3、昂贵，增加了电 镜检测的成本。作者在日常1 ：作中将剩余包埋剂冷冻保存， 需要时解冻，进行常规浸透包埋，取得满意效果，现总结如下。 1 材料和方法 1 1 仪器与材料 E p o n 8 1 2 包埋剂( S i g m a 公司) 、L e i c aU C 6 超薄切片机 ( 奥地利L e i c a 公司) 、J E M 一2 0 0 0 E X 透射电镜( 日本电子) 、 人肾活检组织( C R C 病理中心提供) 、冰箱、温箱、干净带盖 的青霉素小瓶、封口膜、塑料杯、注射器等。 1 2 E p o n 8 1 2 包埋剂的配制 采用L u f t l 9 6 1 配方配制。J ，A
4、液：E p o n 8 1 2 环氧树脂 6 2m L 、D D S A ( 十二烷基琥珀酸酐) 1 0m L ，B 液：E p o n 8 1 2 环 氧树脂1 0m L 、M N A ( 甲基内次甲基四氢邻苯二甲酸酐) 8 9 m L ，本地区夏季适宜配制比例A ：B 为2 ：8 ，其他季节按3 ：7 比例配制，D M P 一3 0 ( 加速剂) 加总量的1 5 。 1 3 包埋剂的保存 临床用过的青霉素小瓶若干，加肥皂水煮沸1 5r a i n 去 掉瓶签，然后用清水冲洗干净，再用洗液浸泡1 2h ，取出后用 清水冲洗干净，置于6 0 温箱中烤干备用。每次制样包埋 剩余的包埋剂，灌注于备
5、好的青霉素小瓶内，以距瓶口1c m 为宜。盖上瓶盖，然后用封u 膜封好，贴上标签，注明日期和 配制比例等，置于冰箱一2 0 冷冻室保存。 1 4 使用方法 需要时，取出冷冻的包埋剂，置于6 0 温箱中，1 0r a i n 即可解冻。夏季室温较高时，也可放置于室温下解冻，约2 0 m i n 即可变成液态，取适量进行包埋聚合。室温解冻时，由 于瓶体温度较室温低，瓶外壁常凝结成许多小水滴，打开瓶 盖前应拭干水滴，以免包埋剂中的酸酐( D D S A 、M N A ) 吸潮 而失效。 1 5 两种包埋剂制备样品对比实验 人肾活检组织经2 5 戊二醛和1 锇酸双同定，系 列酒精脱水后，分成两份，其中
6、一份按常规现用现配包埋剂 浸透包埋，另一份用冷冻后复温的包埋剂浸透包埋。聚合后 超薄切片，醋酸双氧铀和柠檬酸铅染色，透射电镜观察，比较 两种包埋剂制备样品各项观察指标的差异。 2结果 用冷冻后复温的包埋剂制备的包埋块和现配制包埋剂 制备的包埋块，在超薄切片时切割性能完全相同，软硬度适 宜，切片无震颤、无空洞，染色效果理想。电镜下观察，两种 包埋剂制备的标本，细胞的超微结构无明显差异。肾小球及 肾小管超微结构保存良好，肾小球滤过屏障三层结构明确。 如图l 、2 所示。 3 讨论 E p o n 8 1 2 环氧树脂是目前电镜制样中普遍采用的一种 优良包埋剂，它具有许多优点，如切割性能良好，超薄切
7、片易 收稿日期：2 0 0 8 0 6 1 4 ；修回日期：2 0 0 8 一1 1 一1 0 作者简介：吕广艳( 1 9 6 3 一) ，女，辽宁丹东人，实验师。 通讯作者：高颖，女，教授。E m a i l ：g a o y i n 9 8 2 2 h o t m a i l t o m 万方数据 第6 期 吕广艳，等：冷冻保存E p o n 8 1 2 包埋剂在电镜样品制备中的应用 5 8 7 图l现配制包埋剂包埋的 肾小球超微结构( 8 0 0 0 ) 图2 冷冻后复温的包埋剂包埋的 肾小球超微结构( 1 0 0 0 0 ) 形成切片带，耐电子束轰击等。缺点是易吸潮，对操作环境 要求高
8、。本实验室使用该包埋剂2 0 多年，实际工作中作者 发现，包埋剂的用量和许多因素有关，如小瓶的大小、包埋块 的多少、浸透时的用量等，无法准确控制包埋剂用量。每做 1 例标本，用L K B 公司特制的包埋模板，按包埋5 块计算，浸 透和包埋最多需要4m L 包埋剂，每次制样数量在1 3 0 个 不等，有的标本不足5 块，所以每次制样时包埋剂都会有所 剩余。经过多年的实践，作者探讨出包埋剂的冷冻保存及冷 冻后复温的再利用，用该方法制备了近百例电镜标本，与常 规现用现配包埋剂包埋的标本比较，超薄切片及染色效果均 无明显差异，尤其适用于临床病理快速诊断及不需要浸透直 接包埋的非生物标本样品制备。此方法
9、不仅缩短了制样时 间，提高工作效率，而且降低了成本，满足了l 临床诊断和科研 的需要，值得推广使用。但在实验中要注意如下几点：配 制包埋剂时，所有的器皿都要保持干燥，室内湿度保持在3 0 以下，湿度大时应在干燥箱内进行。冷冻后包埋剂可长 期保存，但反复冻融不能超过2 次，否则包埋剂会变得黏稠， 不宜浸透到组织内部，影响超薄切片质量。E p o n 8 1 2 、 M N A 、D D S A 最好是同一厂家，成套采购。暂时不用的试剂 应放置于4o C 冰箱或干燥器中保存。配制时要沿一个方 向充分搅拌，不要形成气泡，静置3 0r a i n 后使用。因清洗 困难，配制时，最好用一次性塑料杯、注射
10、器等器皿。 参考文献： 1 洪涛生物医学超微结构与电子显微镜技术 M 北 京：科学出版社，1 9 8 4 1 1 l 一1 1 2 2 杨勇骥实用生物医学电子显微镜技术 M 上海：第 二军医大学出版社，2 0 0 3 7 5 7 6 3 凌诒萍，俞彰细胞超微结构与电镜技术一分子细胞生 物学基础 M 第2 版上海：复旦大学出版社，2 0 0 4 1 2 4 1 2 5 ( 上接第5 8 5 页) n e u r i t i sw i t l lb i l a t e r a ld i a p h r a g m a t i cp a r a l y s i sf o n o w i n g h
11、e r p e sz o s t e r ：ac a s er e p o r t J JC l i nN e u r o m u s c u lD i s ， 2 0 0 8 ，9 ，4 0 2 4 0 6 2 E l e f t e r i a d e sJ ，S i n g hM ，T a n gP ，e ta 1 U n i l a t e r a l d i a - p h r a g mp a r a l y s i s ：e t i o l o g y ，i m p a c t ，a n dn a t u r a lh i s t o r y J C a r d i o v a
12、s cS u r g ( T o r i n o ) ，2 0 0 8 ，4 9 ：2 8 9 2 9 5 3 M e r i n o R a m i r e zM A ，J u a nG ，R a m 6 nM ，e ta 1 D i a p h r a g - m a t i cp a r a l y s i sf o l l o w i n gm i n o rc e r v i c a lt r a u m a J M u s c l e N e r v e J 2 0 0 7 ，3 6 ：2 6 7 2 7 0 4 李锡莹膈肌疾病见：陈灏珠实用内科学 M 第1 2 版北京：人民卫生出
13、版社，2 0 0 5 1 7 7 8 1 7 8 0 5 B r o w nK A ，H o f f s t e i nV ，R o b e r tJ B e d s i d ed i a g n o s i so fb i l a t - e r a ld i a p h r a g m a t i cp a r a l y s i si nt h ev e n t i l a t o rd e p e n d e n tp a - t i e n ta f t e ro p e nh e a r ts u r g e r y J A n a e s t hA n a l y ，1 9 8
14、5 ，6 4 ： 1 2 0 8 1 2 1 0 6 S c h i l dK ，N e u s c hC ，S c h t I j n h o f e rB V e n t i l a t o r i n d u c e d d i a p h r a g m a t i cd y s f u n c t i o n J P n e u m o l o g i e ，2 0 0 8 ，6 2 ：3 3 3 9 7 G r a h a mD R ，K a p l a nD ，E v a n sC C ，e ta 1 D i a p h r a g m a t i cp H c a t i o nf o ru n i l a t e r a ld i a p h r a g m a t i cp a r a l i s i s ：a1 0 一y e a re x p e r i e n c e J A n nT h o r a cS u r g ，1 9 9 0 ，4 9 ：2 4 8 2 5 1 万方数据