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1、书书书 应用与环境生物学报 2006， 12 （1） ： 59 63 Chin J Appl Environ Biol = ISSN 100343567 2006-02-25 利用微核试验和彗星电泳试验 评价黄河兰州段水质致遗传毒性作用* 龙 静 张迎梅* 朱丽娜 黄德军 宋 刚 （兰州大学生命科学学院 兰州 730000） 摘 要 利用微核和彗星电泳试验对黄河兰州段鲤鱼 （Cyprinus carpio） 红细胞大小及其 DNA 损伤 （微核、 核异常、 单链 断裂和遇碱不稳定点、 双链断裂） 进行了研究， 并以刘家峡水库为对照. 结果显示， 黄河兰州段采得的鲤鱼其红细胞微 核率显著增加 （
2、P 0. 05） ， 这表 明兰州段黄河水质有明显的致遗传毒性作用. 同时两种检测结果显示， 不同的遗传毒性检测手段具有不同的检测终点 和机制， 建议在监测环境污染致遗传毒性作用时考虑检测方法的统一和标准化， 从而得到更可靠、 全面的结果. 图 4 表 3 参 15 关键词 红细胞；遗传毒性；鲤鱼；黄河；兰州 CLC X824 Evaluating Genotoxicity of Water Quality in Lanzhou Section of the Yellow River Using Micronucleus Test and Comet Assay* LONG Jing，ZHAN
3、G Yingmei*，ZHU Lina，HUANG Dejun & SONG Gang （School of Life Sciences，Lanzhou University，Lanzhou 730000，China） Abstract DNA damages（micronucleus，nuclear anomalies，DNA single-strand breakage and/ or alkali-labile lesions，DNA double-strand breakage）and size of erythrocytes in Cyprinus carpio in the Lan
4、zhou section of the Yellow River（LSYR）were determined by micronucleus test and comet assay， with Reservoir Liujiaxia （RL）as a CK site. The results showed that the per- centage of erythrocytes micronucleus was significantly higher （P 0. 05） . Therefore，the water in LSYR had high genotoxicity. Compari
5、ng the results from the two assays，it could be found that different test endpoints and different mechanisms were involved in different genotoxicity tests，so the unifi- cation and criteria of test systems should be considered for a reliable and comprehensive detection of genotoxicity of environmen- t
6、al pollution. Fig 4，Tab 3，Ref 15 Keywords erythrocyte；genotoxicity；carp；Yellow River；Lanzhou CLC X824 黄河贯穿兰州市区， 由于相当数量的生活污水和部分企业 废水未经处理或处理未达标便直接排入黄河， 造成黄河水质严 重恶化. 同时湟水等主要支流沿途接纳了大量废污水， 加重了 黄河水质的污染程度 1. 因此， 为实施水资源保护， 及时掌握 水环境质量的动态变化， 监测、 评价该段黄河水质有着十分重 要的意义. 以往我国水质监测主要以 “水” 作为研究对象进行分析， 而利用生物监测方法评价水质污染多
7、以低等生物群落结构变 化或生物蓄积作为指示物 2， 而以高等脊椎动物的遗传毒性 作为指示物的研究报道甚少 3 4. 鱼类是水环境中的高级消费 者， 同时也是污染物质的 “蓄积库” ， 对水环境敏感， 作为水环 境污染的指示物已经得到认可. 本研究以鲤鱼为研究对象， 收稿日期： 2004-09-24 接受日期： 2005-01-07 *教育部科学技术重点项目资助 （No. 02080） Supported by the Sci & Tech Key Research Project of MOE，China *通讯作者 Corresponding author（E-mail：ymzhang lz
8、u. edu. cn） 利用碱性、 中性彗星电泳技术检测红细胞核 DNA 单链断裂、 遇 碱不稳定点及双链断裂损伤， 利用微核试验检测红细胞微核和 核异常情况， 为更科学合理地评价黄河兰州段环境质量和环境 污染的遗传毒理作用提供参考依据. 1 材料与方法 1. 1 研究样点 选择刘家峡水库 （RL） 和黄河兰州段 （LSYR） （雁滩大桥 附近） 作为采样点 （图1） . 从两个采样点共捕获鲤鱼21 尾 （2 3 龄） 作为实验材料， 其中 10 尾采自 RL， 平均体长 （25. 5 1. 6）cm； 11 尾采自 LSYR， 平均体长 （26. 8 3. 3）cm. RL （N）3545，
9、 （E）1033E 位于黄河兰州段上游 偏西南 75 km 处. 库区水质透明度大于 100， 基本上不受任何 工业污染， 在本项目中作为对照点. LSYR 采样点附近有不少 废水排放管道， 大量工业废水及生活污水从此注入黄河， 这一 带河水发黑， 并有恶臭味， 污染严重. 图 1 采样点示意图 Fig.1 Map for sampling sites 1. 2 微核及核异常测定 取鲤鱼尾动脉血液 1 2 滴， 均匀铺在干净载玻片上， 风干 后， 甲醇固定15 min， 1 “ 19 Giemsa（pH 6. 98） 染色15 min； 流 水冲洗； 自然晾干后镜检 （每尾鱼样做 3 张平行片
10、子） . 在带有 数码采集头 （Motic B5 Professional Series） 的显微镜下， 每张片 子随机拍摄 10 个视野， 记录每个视野内的细胞总数、 含微核的 细胞数及红细胞核异常情况. 用配套软件 （Motic Images Ad- vanced 3. 0） 测定细胞及细胞核的长径和短径， 每张片子测量 20 个细胞. 计算微核率、 核异常率及细胞、 细胞核大小等指标的平均 数和标准偏差， 单因素方差分析法 （ANOVA） 检验两样点间的 差异性. 1. 3 DNA 链损伤测定 新鲜尾动脉血样用 EDTA 钠盐抗凝后， 3 000 r/ min 4 下 离心 5 min，
11、 弃上清液. 加等量 PBS， 同等条件下再离心， 弃上清 液. 然后将细胞悬浮于 PBS 中置冰箱 4 保存备用. 1. 3. 1 DNA 单链断裂和遇碱不稳定点测定 采用碱性彗 星电泳技术进行测定 5. 调节每张载玻片的细胞数为 103 104个； 在含高离子浓度去污剂裂解液中裂解 2 h； 碱性条件下 解旋 20 min， 电泳 30 min（300 mA， 25 V） ； 0. 4 mol L -1 Tris （pH 7. 5） 中和. 以上操作均在低温、 弱光下进行. Nikon TMD-EF 荧光显微镜下进行观察 （Nikon， 日本） . 每 张玻片记录 100 个细胞， 按照尾
12、长、 头长将损伤程度分为 0， 1， 2， 3， 4 级 （从无损伤到完全损伤） ， 100 个细胞的损伤程度可能 从 0（所有细胞都无损伤） 到 400（所有细胞都完全损伤） . 采 用任意单位 （arbitary unit，AU） 表示 DNA 损伤程度 13， AU 值 越大， 表示损伤越严重， 计算公式为： AU = # i =4 i =0Ni i 式中， Ni为 i 损伤级的细胞数， i 为损伤级. 计算细胞核 DNA 损 伤比例和程度， ANOVA 检验两样点间的差异性. 1. 3. 2 双链断裂测定 采用中性彗星电泳技术进行测 定 6. 在新配的中性裂解液 （含 2 mol L-
13、1 NaCl， 30 mmol L -1 EDTA， 1%肌氨酸钠， 10 mmol L -1 Tris， 用前加1% Triton X-100 和 10% DMSO， pH 8. 2） 中 4 裂解 2 h； 0. 5% TBE（2 mmol L -1 EDTA， 90 mmol L -1 Tris， 90 mmol L -1硼酸， pH 8. 2 8. 5） 浸没3 次， 每次1 h 以上； 0. 5%TBE 电泳缓冲液中20 min， 电泳 30 min （25 V， 300 mA） ； 观察及统计， 方法如 1. 3. 1 所述. 2 结果与讨论 2. 1 鲤鱼红细胞微核和核异常 2.
14、 1. 1 微 核 正常红细胞 （图 2-A） 椭圆形， 核椭圆形或圆 形， 多位于细胞中央. Giemsa 染色后， 细胞核为紫红色， 细胞质 为较浅的橙黄色. 微核染色特点与主核相似， 直径约为主核的 1/10 1/3， 在细胞质中的位置有些靠近细胞核， 有些离细胞核 较远， 有些在细胞质的最外围 （图 2-B E） . 两个样点微核及核 异常情况见表 1. 表 1 两个样点鲤鱼红细胞微核及核异常 Table 1 Micronucleus and nuclear anomalies of erythrocytes of carps from two sampling sites 样点 Si
15、tes 微核百分率 Micronucleus percentage （P/ %） 核异常百分率 Nuclear anomalies percentage （P/ %） 主要核异常形式 Nuclear anomalies RL0.275 0.1322.721 1.165 微核 （Micronuclei） ，不规则外凸 （Blebbed） ，内凹 （Not- ched） ，四边形 （Quadrangular） ，圆锥形 （Conical） ，均等 缢裂 （Equal constricted） ，空泡化 （ Vacuolated） ，无核 （Vanished） LSYR0.467 0.184*2.4
16、47 0.527 微核 （Micronuclei） ，不规则外凸 （Blebbed） ，内凹 （Not- ched） ，四边形 （Quadrangular） ，圆锥形 （Conical） ，不等 缢裂 （ Unequal constricted） ，多微核 （ Multi - micronu- clei） ，核破碎 （Fragmented） RL：刘家峡水库 Reservoir Liujiaxia；LSYR：黄河兰州段 Lanzhou section of the Yellow River. 下同 The same below. *Compared with RL，P 0.05 表 1 表明，
17、 LSYR 样点红细胞微核率显著高于 RL（F1， 19= 7. 397， P 0. 05） . 微核主要由诱变物质作用所致， 与染色体损 伤和畸变密切相关 7， 由此可以推测， 黄河兰州段水环境中具 有高浓度诱变物， 并具有较强的诱变性. 观察发现， RL 红细胞出现微核数通常为 1 个， 而 LSYR 却 一到几个不等. Mallick 8报道了生活在以工业污染为主的印度 Hooghly-Matlah 河的鱼， 其红细胞微核都是单个出现， 而 Rah- man 9却发现， 生活在以工业废水和化学污染物为主的水体中 鱼红细胞核周围可伴随一到多个微核， 因而多微核现象很可能 与污染程度及污染物
18、成分有关. 2.1. 2 核异常 图 2 显示， 有些核形状与正常核差异较大， 主要有外凸 （图 2-J L） 、 内凹 （图 2-F I） 、 空泡化 （图 2-M 06 应 用 与 环 境 生 物 学 报 Chin J Appl Environ Biol 12 卷 O） 、 核缢裂 （图 2-P R） ， 或其它一些奇异形状 （图 2-U X） . 核形状异常， 有些是因为红细胞自然老化或凋亡， 有些则可能 是环境因子干扰所致. 两个样点中， 内凹、 外凸、 圆锥形、 缢裂类 型比例均较高. 另外， 只在 LSYR 鱼样中发现不等缢裂、 多微 核、 核破碎现象. 图 2 不同形式的红细胞核
19、异常图 （ 2 100） Fig.2 Photomicrographs of erythrocytes with anomalous nuclei（ 2 100） A：正常 Normal nucleus；B E：微核 Micronuclei；F I：核内凹 Notched；J L：不规则外凸 Blebbed；M O：空泡化 Vacuolated；P R：核缢裂 Constricted；T：核碎裂 Fragmented；S，U X：其它 Others 由表 1 可以看到， RL 样品红细胞核异常率高于 LSYR （F1， 19= 2. 004， P = 0. 173） . Malick 8研究
20、Hooghly-Matlah 河 3 个不同污染程度河段的 7 种鱼样， 对比其微核率和核异常率， 也发现污染越严重， 红细胞微核率比值越高， 而核异常比值表 现为相反的趋势， 与本研究结果一致. 结合上述研究结果， 我们 推测， 有些异常核可能是微核的前体， 细胞抵抗外界污染物毒 性时， 不规则核更容易形变产生微核或多微核甚至导致核碎 裂， 从而导致核异常比值减小， 微核率增加. 2. 1. 3 红细胞大小比较 从图 3 中可以看到， 两样点 Lc、 Ln、 Wn、 Lc/ Ln、 Ln/ Wn 无显著性差异 （Lc： F1， 13=4. 17E-06， P = 0. 998； Ln： F1
21、， 13= 0. 171， P = 0. 686； Wn： F1， 13= 0. 730， P = 0. 408； Lc/ Ln： F1， 13=0. 495， P = 0. 494； Ln/ Wn： F1， 13= 0. 174， P =0. 683） ， Wc 在两样点存在显著差异 （F1， 13= 5. 460， P 0. 05） ， Lc/ Wc 和 Wc/ Wn 在两样点存在极显著差异 （Lc/ Wc： F1， 13=27. 651， P 0. 01； Wc/ Wn： F1， 13= 12. 592， P 0. 01） ， 数 据分析表明， 污染较严重的 LSYR 鱼样红细胞要比相对
22、无污染 的 RL 小. 红细胞是血液中有形部分最主要的成分， 一般认为 红细胞的大小与运动能力呈负相关 10， 因此 LSYR 样品红细 胞较小可能是鲤鱼对污染环境的适应性表现. 2. 2 红细胞核 DNA 单、 双链断裂损伤 中性彗星电泳用于检测双链断裂情况， 而碱性彗星电泳用 于检测单链断裂和遇碱不稳定点 11. 核 DNA 解旋后， 在电泳 电场作用下， DNA 断裂片段离开细胞核向阳极迁移， 形成彗尾 状 （图 4-B D） ， DNA 片段越小， 在电泳时迁移的速度越快， 离 “核心” 的位置越远. 两样点各损伤级细胞数， 损伤比例及损伤 程度等见表 2 与表 3. 16 1 期龙
23、静等：利用微核试验和彗星电泳试验评价黄河兰州段水质致遗传毒性作用 图 3 红细胞及细胞核大小 （A） 和相关比值 （B） 分析 Fig.3 Comparative analysis of erythrocytes and nuclei size（A）and corresponding ratio（B） *P 0.05，* P 0.01 与 RL 比较 Compared with RL；Ln：细胞核长径 Length of nucleus；Wn：细胞核短径 Width of nucleus； Lc：细胞长径 Length of cell；Wc：细胞短径 Width of cell 图 4 鲤鱼红
24、细胞彗星电泳荧光显微图 （ 2 700） Fig.4 Fluorescence photographs of comets electrophoresis of carp erythrocytes（ 2 700） + 和 - 表示电泳时正负极； A 为正常细胞， B D 为受损伤细胞形成的 “彗星” + and - indicating the anode and cathode； Fig- ure（A）for normal cell and figures（B D）for comets formed by damaged cells 表 2 两样点鲤鱼核 DNA 单链断裂和遇碱不稳定点损伤比
25、较 Table 2 DNA single-strand breaks and/ or alkali-labile lesions of carps from two sampling sites 样点 Sites 各损伤级细胞数 Cell number of each damage grade 01234 损伤百分比 （P/ %） Damage percentage 损伤程度 （AU） DNA damage scores RL90.65.21.52.00. 89. 417. 2 LSYR89.64.61.71.72. 410. 422. 7 表 3 两样点鲤鱼核 DNA 双链断裂比较 Tabl
26、e 3 DNA double-strand breaks of carps from two sampling sites 样点 Sites 各损伤级细胞数 Cell number of each damage grade 01234 损伤百分比 （P/ %） Damage percentage 损伤程度 （AU） DNA damage scores RL93.16.00.90.00. 06. 97. 8 LSYR93.55.80.50.10. 16. 57. 5 由表 2 得知， LSYR 样点 DNA 单链断裂和遇碱不稳定点损 伤比例和程度加重， 但差异不显著 （损伤比例： F1， 15=
27、0. 797， P =0. 386； 损伤程度： F1， 15=2. 515， P =0. 134） . 表 3 反映了 DNA 双链断裂情况， 两样点差异不显著 （损伤比例： F1， 18=0. 298， P =0. 592； 损伤程度： F1， 18=0. 168， P =0. 687） . 至今， 虽彗星电泳广泛用于评价某化合物诱导 DNA 损伤 情况， 但只有少数用于环境监测， 其研究结果都表明， 彗星电泳 用于检测 DNA 损伤灵敏、 快速、 经济， 检测到的 DNA 损伤可作 为鱼类和其它水生生物遗传毒性标记， 能客观地反映环境污染 状况 12 14. 本项研究结果表明， 彗星电泳
28、比微核试验有更高的 检出率， 但并没有检测到污染程度不同的两样点间存在显著性 差异， 与 McFarland 15的研究结果一致. 两种方法检测到的结 果差异显著性不同， 表明污染对机体的遗传毒性可能存在着水 平上的差异， 不同遗传毒性检测手段检测到的 DNA 损伤反应 了污染物在不同水平上的遗传毒性效应. 同时彗星电泳技术作 为一种遗传毒性方法用于环境监测， 其敏感性、 特异性、 机制等 还需进一步积累资料加以分析. 实际上， 微核试验和彗星试验 具有不同的检测终点和机制， 微核试验检测到的损伤至少经历 了一个有丝分裂周期， 从染色体水平上进行检测， 而彗星电泳 方法则从分子水平上检测 DN
29、A 可修复损伤、 碱不稳定点、 双链 断裂等. 所以有必要从多方面考虑， 将不同的遗传毒性检测方 法， 如微核试验和彗星电泳结合起来， 才能更好地监测污染物 对机体产生的遗传毒性作用. 3 结 论 3. 1 黄河兰州段水体污染使鲤鱼红细胞微核率显著增加， 说 26 应 用 与 环 境 生 物 学 报 Chin J Appl Environ Biol 12 卷 明该段水体中具有高浓度诱变物， 并具有较强的诱变性， 应当 引起重视. 3. 2 黄河兰州段水污染诱导了不同形式的核异常， 主要表现 为内凹、 外凸、 圆锥形、 不等缢裂、 核破碎等. 这些异常核中有些 可能是微核的前体， 在细胞抵抗外界
30、污染物毒性时， 它们更容 易形变产生微核或多微核， 甚至导致核碎裂. 3.3 黄河兰州段水污染使 DNA 链损伤比例和程度增加， 而且 环境污染诱导的 DNA 单链断裂和遇碱不稳定点损伤要比双链 断裂损伤比例高. 3. 4 微核试验和彗星电泳技术检测结果表明， 有必要将不同 的遗传毒性检测方法综合比较， 才能更科学、 全面地评价水污 染致遗传毒性作用. References 1 Zhang JH（张俊华） ，Ju TZ（巨天珍） ，Ren ZW（任正武） ，Tian YJ （田玉军） ，Suo AN（索安宁） ，Wen F（温飞） . An analysis of water pollutio
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