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1、第 29 卷 第 1 期 核 技 术 Vol. 29, No.1 2006 年 1 月 NUCLEAR TECHNIQUES January 2006 国家自然基金资助 (项目批准号 30100044) 项目 第一作者：林岩松，女，1968 年出生，1996 年于上海医科大学华山医院获博士学位，核医学专业，19982000 年进入中国医学科学院、核医学 国家重点实验室临床医学博士后流动站做博士后工作，出站后在协和医院工作至今。现为副主任医师，中国医学科学院硕士生导师 收稿日期：2004-06-10，修回日期：2004-11-10 吗啡戒断大鼠脑多巴胺转运蛋白及 D2 受体的研究 林岩松 1 丁
2、时禹2 陈正平2 王博诚1 张满达2 王世真1 1（北京协和医院核医学科 北京 100730） 2（江苏省原子医学研究所核医学国家重点实验室 无锡 214063） 摘要 采用多巴胺转运蛋白（DAT）示踪剂 125I-甲基-3-（4-碘苯基）托烷-2-羧酸酯（-CIT）及 D2 受体示 踪剂 125I左旋-3-碘-2-羟基-6-甲氧基-N(1-乙基-2-吡咯烷)甲基苯酰胺（IBZM）探讨吗啡戒断前、后大鼠脑 突触前、 后多巴胺 （DA） 系统的变化。 吗啡戒断 1、 2、 3 天组大鼠 （各 10 只） 分别于连续给予吗啡 （20 mg/kg） 8 天后停止给予吗啡 1、2、3 天再进行实验；吗
3、啡（20 mg/kg）组及生理盐水对照组大鼠各 12 只；对照组大 鼠只给予腹腔注射 0.3 mL 生理盐水，共计 8 天。将吗啡组、戒断 1、2、3 天组及生理盐水对照组大鼠各进一 步随机平均分为两组，分别用于 125I-IBZM、125I-CIT 脑内分布研究。结果： （1）吗啡戒断组大鼠自戒断第 2 天开始出现明显的腹泻症状，同时还伴有叩齿及寒战等症状出现。 （2）在 20 mg/kg 吗啡及戒断组的 125I-CIT 脑内分布中，吗啡组在纹状体（ST） 、伏隔核（NAC）的分布明显高于戒断 1、2、3 天组和对照组（P0.05） 。 （3）125I-IBZM 在吗啡依赖及戒断组的脑内分
4、布显示：吗啡组在 ST、NAC 的分布明显低于戒断 1、2、3 天组和对照组（P0.05） 。由此可得出结论：吗啡戒断组大鼠出现了明显的戒断症状。 在吗啡依赖中 ST、NAC 及 HIP 等的 DAT 出现了上调，D2 受体则出现一种下调的低敏状态，吗啡戒断使这种 增高 DA 能的活动及 DAT 回落并趋于正常范围，并使 NAC 及 ST 下调的 D2 受体逐渐回升。 关键词 药物依赖，吗啡，多巴胺转运蛋白，D2 受体，125I-B-CIT，125I-IBZM 中图分类号 R749 吗啡及其化学合成衍生物海洛因的滥用已成为 全球关心的医学和社会问题。目前认为，多巴胺 （DA）系统的适应性改变与
5、成瘾的全过程关系最 大，可能是渴求用药的原因。在以往的研究中，我 们发现吗啡组大鼠产生了明显的地点偏爱倾向，在 吗啡依赖中纹状体（ST） 、伏隔核（NAC）及海马 （HIP）等的 DAT 出现了上调，D2 受体则出现一 种下调的低敏状态，同时脑内的毒蕈碱型乙酰胆碱 （M-Ach）能系统也发生了相应变化。HIP、额叶 （FC）等区域的 M 受体的轻度增高，可能与吗啡 依赖及觅药行为的学习记忆的强化过程有关1,2。 本 研究在前一部分研究的基础上，进一步探讨吗啡戒 断前、后中枢 DA 系统的变化，现报告如下。 1 材料和方法 1.1 试剂及仪器 左旋-3-碘-2-羟基-6-甲氧基-N(1-乙基-2
6、-吡咯 烷)甲基苯酰胺(IBZM(S)(-)及左旋-2-羟基-6-甲氧 基-N(1-乙基-2-吡咯烷)甲基苯酰胺(BZM(S)(-)： 核 医学国家重点实验室提供；甲基-3-4-碘苯基托烷 -2-羧酸酯（-CIT） ：由核医学国家重点实验室提 供；Na125I（无载体、无还原剂）中国原子能研究院 同位素所；HPLC（5000 Liquid Chromatography Varian 公司） ；-计数器（C5002 Auto-Gamma Counting Systems，Packard 仪器公司） ；电子天平 （Analytic AC 210S， Sartorius 公司） ； 盐酸吗啡 （沈
7、阳市第一制药厂） 。 56 核 技 术 第 29 卷 1.2 吗啡依赖模型及其地点偏爱测试 采用两隔室模型训练大鼠对吗啡产生条件性位 置（地点）偏爱，造成大鼠地点偏爱模型3，具体 步骤如下：给药前将大鼠置于有 C1、C2 两隔室笼 箱内， 两隔室间有一小门可自由进出 （C2 室光线稍 暗，两室其它条件相同） ，将大鼠放至 C1 室，利用 鼠类喜暗特性，当大鼠自 C1 室 偶然自由进入 C2 室时立即给予腹腔注射 20mg/kg 盐酸吗啡， 共给药 8 天。 即将 C2 作为吗啡的条件性地点偏爱的配对刺 激物，建立吗啡的奖赏效应与 C2 之间的一种关系， 通过测定大鼠自C1进入C2的时间来观察其
8、对吗啡 的渴求或依赖行为变化。 1.3 实验动物及分组 （1）大鼠的吗啡依赖及戒断 45 月龄成年 SD 大鼠（203264g） ，雌雄均 有，采用两隔室模型训练大鼠对吗啡产生条件性位 置（地点）偏爱，具体步骤如下：给药前将大鼠置 于有 C1、 C2 两隔室的笼箱内， 当大白鼠自 C1 室 偶 然自由进入 C2 室时立即给予吗啡组腹腔注射 20mg/kg 的盐酸吗啡；吗啡戒断 1、2、3 天组大鼠 分别于连续给予吗啡（20mg/kg） 8 天后停止给予 吗啡 1、2、3 天再进行实验；对照组大鼠只给予腹 腔注射 0.3mL 生理盐水，共计 8d。注射吗啡均于 上午 912 时进行，地点偏爱测试
9、同前。 （2）动物分组 戒断 1、2、3 天组各 10 只，吗啡（20mg/kg） 组及生理盐水对照组大鼠各 12 只； 将上述各组大鼠 进一步随机平均分为两组，分别用于 125I-IBZM、 125I-CIT 脑内分布研究。 1.4 125I-CIT 的标记 取反应前体甲基-3-(4-三丁基锡苯基)托烷-2- 羧酸酯 10g/10L 乙醇溶液加入涂布氯甘脲 （Iodogen）20g 反应管内，加入 0.5mol/L HCl 缓 冲液 100L，投入适量 Na125I，室温反应 15min 后 吸出反应液终止反应，加 700L 饱和碳酸氢钠调 pH 至 7.0， 经二氯甲烷萃取， 氮气吹干后加
10、入 0.1mL 乙醇，再加入蒸馏水至实验所需体积。标记率及放 射化学纯度测定：HPLC（流动相为甲醇：水：三 乙胺 = 75： 25： 0.2， C18 反相柱， 流速： 1.0mL/min） 、 TLC（展开系统为乙醇：三氯甲烷：氨水 = 1：9： 0.2，硅胶纸） ；125I-IBZM 的标记参照 Kung 等4的 方法， 上述两种标记物放射化学纯度均在 92%以上, 比活度2.22PBq/mol。 1.5 脑内放射性分布研究 大 鼠 固 定 后 经 尾 静 脉 注 入 125I-IBZM 、 125I-CIT 27.7MBq/kg 0.3mL 生理盐水溶液，2h 后快速将大鼠断头取脑，分
11、割出相应纹状体（ST） 、 伏隔核 （NAC） 、 海马 （HIP） 、 额叶 （FC） 、 顶叶 （PC） 、 小脑（CB）等脑区，称湿重后，用 -计数器测定 125I-CIT、125I-IBZM 的脑区内放射性，通过与在 同等条件下配制的标准源的百分之一计数的比值得 到每克脑组织组织所占的百分注射剂量率（%ID/g， 简称摄取率） ， 并计算相应脑组织与 CB 的摄取率比 值-1，即特异性摄取率。 1.6 统计学分析 所有数据以“均数标准差”表示，多组比较 采用 ANOVA 统计分析，继之两组间比较采用均数 的 t 检验。 2 结果 2.1 行为改变 注射吗啡25min后吗啡组大鼠均表现出
12、运动 活动增加； 吗啡组自 C1 进入 C2 的时间随着注射吗 啡天数的增加逐渐缩短； 吗啡组大鼠自第 24 天起 进入C2室的时间逐渐缩短， 从第1天的 （1.680.57） min 降至第 8 天的（0.380.16）min；表明吗啡组经 过训练及吗啡地点配对刺激，对 C2 产生明显的地 点偏爱倾向。吗啡戒断组大鼠自戒断第 2 天开始出 现明显的腹泻症状，同时还伴有叩齿及寒战等症状 出现，并回避诱发戒断吗啡的 C2 室。 2.2 125I-CIT 在吗啡依赖及戒断组的脑内分布 在 20mg/kg 吗啡及戒断组的 125I-CIT 脑内分 布中，我们看到吗啡组在 ST、NAC 的分布明显高
13、于戒断 1、2、3 天组和对照组（P0.05） ，见图 1。表明吗啡的戒断使 在上述脑区对 125I-CIT 的摄取从吗啡暴露的增高 状态开始回落并趋于正常范围。 2.3 125I-IBZM 在吗啡依赖及戒断组的脑内分布 吗啡组在 ST、 NAC 的分布明显低于戒断 1、 2、 3 天组和对照组（P0.05） ，见图 2。提 示吗啡依赖大鼠脑内 ST、 NAC 下调的 D2 受体随着 戒断吗啡天数的增加逐渐上调。 图 1 吗啡（Mor）依赖及戒断 1，2，3 天大鼠 125I-CIT 脑内分布研究 Fig.1 125I-CIT brain biodistribution among morph
14、ine dependent and 1,2,3 day abstinent rats 图 2 吗啡（Mor）依赖及戒断 1，2，3 天大鼠脑 125I-IBZM 分布研究 Fig.2 125I-IBZM brain biodistribution among morphine dependent and 1,2,3 day abstinent rats 3 讨论 吗啡类成瘾后一旦停药就会出现痛苦的戒断症 状，戒断综合征的表现既有躯体方面又有动机方面 的症状，如恶心、胃肠功能障碍、恶寒发冷、痛苦 的心境等；在大鼠，戒断反应躯体方面的特点为垂 睑、叩齿、寒战、腹泻等， 动机方面有经训练建立 的获取
15、食物的操作行为在戒断期中断、回避诱发戒 断的地点 （地点嫌恶） 。 动物模型是研究阿片类依赖 的有力手段。 在动物反复把用药与特定环境配对后， 会产生对此环境的偏好、主动取向，以寻求体验药 物效应，此即为吗啡依赖或渴求模型。条件性位置 偏爱实验即是一种常用的研究药物强化、依赖效应 的实验方法，即首先通过训练使动物建立药物的奖 赏效应与某一特定环境之间的一种关系，用药后动 物会偏爱停留在曾经给予药物奖赏的环境中。该实 验的优点是需要的设备简单，方法简便快速，实验 过程的差异对实验结果的影响小。该实验是研究条 件反射的直接手段，这种条件反射是影响觅药行为 的主要因素之一5。在本部分实验中，我们看到
16、吗 啡戒断组大鼠表现出腹泻、寒战等症状，并出现回 避 C2 的倾向，这表明大鼠出现了吗啡的戒断症状。 本研究显示， 125I-CIT 脑内分布显示随着戒断 天数的增加吗啡组 ST、 NAC 等脑区对 125I-CIT 摄 取逐渐降低， 趋向于正常对照组水平； 而 125I-IBZM 在 ST、NAC 等脑区分布则随戒断天数的增加逐渐 增高，但尚未回升至正常对照组水平。这提示戒断 可能使吗啡所引起的上调的 NAC 及 ST DA 能活动 减低、DAT 迅速下调，这反映了 DAT 变化的迅速、 直接，而伴随着突触间隙 DA 的减少，下调的 D2 受体出现缓慢上调，这表明受体的变化是一种间接 的复杂
17、调节过程。研究发现在阿片类脱瘾期间支配 DA能神经元的GABA能中间神经元的GABA的释 放增加，进而抑制 DA 能的激活6，这可能是导致 戒断期间 DAT 的相应减少、D2 受体反馈性增加的 一个重要原因。 应该指出的是，我们的研究仅从 DA 系统如 DAT、 D2 受体的角度初步探讨了吗啡依赖大鼠的变 化，而机体使用吗啡后，除阿片肽及 DA 系统外， 脑内多部位（包括前额叶、蓝斑等）的多递质系统 如去甲肾上腺素、 5-HT 及兴奋性氨基酸等也都出现 了不同程度的变化，这些变化包括突触前神经元内 的递质合成酶类、 神经元重摄取或酶解等失活机制、 受体及受体后的信号转导机制以及基因表达等各个
18、方面的相应改变7,8， 各种变化间可能存在着密切的 相互关联，牵一动百，这说明吗啡依赖及戒断是一 种复杂的神经生物学现象，找出其中的关联点是解 决吗啡类成瘾的关键，而这需要多学科合作，从分 子、细胞和整体的不同层次进行系统的研究。 综上，我们认为，吗啡暴露使 ST、NAC 等脑 区 DAT 上调，这可能反映了 DA 能活动增高、DA 释放量增加， 进而造成 ST、 NAC 等脑区 D2 受体的 下调， 吗啡戒断使这种增高 DA 能的活动及 DAT 回 落并趋于正常范围，并使 NAC 及 ST 下调的 D2 受 体逐渐回升。 58 核 技 术 第 29 卷 参考文献 1 林岩松，丁时禹，方平，等
19、. 中华核医学杂志，2001， 21（3） ：151153 LIN Yansong, DING Shiyu, FANG Ping, et al. Chin J Nucl Med, 2001, 21(3): 151153 2 林岩松，丁时禹，方平，等. 中华核医学杂志，2004， 24（3） ：152154 LIN Yansong, DING Shiyu, FANG Ping, et al. Chin J Nucl Med, 2004, 24(3): 152154 3 Stolerman I. TiPS, 1992, 13: 170176 4 Kung M P, Liu B L, Yang Y
20、Y, et al. J Nucl Med, 1991, 32: 339342 5 Add C A, Murtra P, De Felipe, et al. J Neurosci, 2003, 23: 82718280 6 Volpicelli L A, Easterling K W, Kimmel H L, et al. Pharmacol Biochem Behav, 1999, 64: 34873493 7 Childers S R. Life Sci, 1991, 48: 19912003 8 Christie M J, Williams J T. Mol Pharmacol, 1987
21、, 32(5): 633637 Exploration of central dopamine transporter and D2 receptor in morphine abstinent rats LIN Yansong1 DING Shiyu2 CHEN Zhengping2 WANG Bocheng1 ZHANG Manda2 WANG Shizhen1 1(Peking Union Medical College Hospital, Beijing 100730) 2(Jiangsu Institute of Nuclear Medicine, National Laborato
22、ry of Nuclear Medicine, Wuxi 214063) Abstract The experiment was designed to investigate the variation of DAT and D2 receptor in morphine administered and 1,2,3 day abstinent rats. Morphine exposure was induced by repeated morphine (i.p.) treatment for 8 days. Conditioned place preference test was c
23、onducted to evaluate the drug seeking behaviour and morphine dependence of rats with morphine exposure. Biodistribution of the imaging agents 125I-CIT and 125I-IBZM was used to evaluate the central DAT and D2 receptor during morphine exposure and 1,2,3 days abstinence. Results reveal the following f
24、acts. (1) The morphine abstinent rats showed diarrhea and body-shake 1 day after morphine withdrawal. (2) For morphine group, 125I-CIT %ID/g in ST and NAC was higher than that of the 1,2,3 days abstinent rats and control (P0.05). (3) 125I-IBZM %ID/g in ST, NAC and HIP in morphine rats were lower tha
25、n those of the abstinent and control rats (P0.05), indicating the reduction of hyper-activated DAT and the increase of down-regulatory D2 receptor induced by morphine during morphine withdrawal. Our results confirmed that the dopamine system, especially DAT and D2 receptor in mesolimbic and meso-str
26、iatum pathway, has been implicated in morphine treatment. The rewarding properties of morphine and the somatic expression of morphine abstinence were related to changes in mesolimbic and meso-striatum dopaminergic activity. Key words Drug dependence, Morphine, Dopamine transporter, D2 receptor, 125I-B-CIT, 125I-IBZM CLC R749