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1、 第 18 卷 第 10 期医 学 研 究 生 学 报Vol. 18 No. 10 2005 年 10 月Journal of Medical PostgraduatesOct. 2005 论 著 四种气管上皮细胞分离培养方法的比较研究 邓三明1， 汪 健1， 连耀国2， 倪云峰1， 卢 强1， 杨 晔1， 李小飞 1 （1. 第四军医大学唐都医院胸外科， 陕西西安 710038； 2. 空军总医院肾内科， 北京 100036） 摘要： 目的： 比较四种不同的方法在培养气管上皮细胞中的异同， 改进其培养技术， 为组织工程气管提供种子细 胞。 方法：用两步酶消化法 （使用0. 1% Dispas
2、e 4消化18h 后， 用0. 25%的胰酶37消化5min） 、 Dispase 冷消 化法 （用 0. 1%Dispase 4消化18h） 、 胰酶温消化法（0. 25%的胰酶37消化10min） 和机械刮刷法四种方法分离、 培养兔气管上皮细胞， 测定分离细胞的数量和纯度。 结果：两步酶消化法、 Dispase 冷消化法较其他两种方法得 到的气管上皮细胞纯度高， 细胞状态好； Dispase 冷消化法得到细胞数量较其他方法少， 其余三种方法得到的细胞数 统计学上不存在差异。 结论：两步酶消化法较其他方法所得细胞数量多、 纯度高、 细胞成活率高， 是一种较好的 气管上皮细胞体外分离培养方法。
3、 关键词： 气管上皮细胞； 胰酶； Dispase； 细胞培养 中图分类号： R-331 文献标识码： A 文章编号： 1008-8199 （2005） 10-0870-02* Comparison of tracheal epithelial cells culture methods in vitro DENG San-ming1，WANG Jian1，LIAN Yao-guo2，NI Yun-feng1， LU Qiang1，YANG Ye1，LI Xiao-fei1 （1. Department of Thoracic Surgery，Tangdu Hospital，the Fourt
4、h Military Medical University，Xian 710038，Shaanxi，China；2. Department of Nephrology，General Hospital of Air Force，PLA，Beijing 100036，China） Abstract： Objective： To seek an effective method to get a large amount of pure tracheal epithelial cells in vitro for tracheal tissue engineering. Methods：Four
5、kinds of methods were compared： 0. 1%dis- pase treatment for 18h at 4 and 0. 25% trypsin treatment for 5min at 37. 0. 1%dispase treatment for 18h at 4. 0. 25% trypsin treatment for 10min at 37. direct insolation. The cells from rab- bits trachea were grown in serum-free medium. Cell account/ purity
6、of the cells were compared. Re- sults：The quality and purity of cells got by the methods of 0. 1%dispase treatment for 18h at 4 and 0. 25% trypsin treatment for 5 min at 37 and 0. 1% dispase treatment for 18 h at 4 were better than those in the others. The quantity of cells gotten by 0. 1% dispase t
7、reatment for 18 h at 4 was less than those in the other three methods. The quantity of cells gotten by other methods were not different in statistics. Conclusion： The method of 0. 1%dispase treatment for 18h at 4 and 0. 25% trypsin treatment for 5 min at 37 is the best way to obtain a large amount o
8、f pure tracheal epithelial cells from rabbit in vitro. Key words： Tracheal epithelial cells； Trypsin；dispase； Dispase； Cell culture 078 *收稿日期： 2005-06-17； 修订日期： 2005-07-08 基金项目： 国家自然科学基金资助项目 （批准号： 39970707） ； 陕西省自然科学基金资助项目 （批准号： 99SM37） 作者简介： 邓三明 （1979- ） ， 男， 陕西西安人， 医师， 医学硕士， 从事胸腔外科专业。 通讯作者： 李小飞 （1
9、961- ） ， 男， 河南沁阳人， 副主任医师， 副教授， 医学博士， 从事胸腔外科专业。 0 引 言 气管移植现处于实验研究阶段 1， 2， 组织工程 气管是气管移植的重要手段。气管上皮细胞是组织 工程中不可缺少的部分， 但培养方法国内报道尚不 多。本实验在国内外相关实验基础上 3 -7， 使用两 步酶消化法、 Dispase 冷消化法、 胰酶热消化法及机 械刮刷法， 分离、 培养兔气管上皮细胞， 比较四种方 法分离培养的细胞数量、 纯度及成活率。 1 材料和方法 1. 1 动物和组织来源 1 月龄健康的雄性新西兰 兔， 体重 （300 0. 25） g。耳缘静脉空气栓塞致死， 无菌条件下
10、取出气管， 在不含 Ca2 +、 Mg2 +的 PBS 中 剔除气管周围的软组织，用含有青霉素 10 万单 位/ L、 链霉素 50 mg/ L 的 PBS 反复冲洗气管内外， PBS 浸泡待用。 1. 2 试剂 上皮细胞培养液 K-SFM （serum-free ke- ratinocyte mediem） 、 DMEM 培养液、 胎牛血清 （FBS） 、 胰酶、 Dispase 购自 Gibco 公司。 1. 3 气管上皮细胞的分离培养 用两步酶消化法、 Dispase 冷消化法、 胰酶热消化法及机械刮刷法分 离、 培养气管上皮细胞， 对所得细胞的数量、 纯度在 倒置显微镜下进行观察。两步
11、酶消化法： 将冲洗 干净的气管一端用线扎紧， 从另一端加入 0. 1% 的 Dispase 至气管微胀后扎紧， 置入 4冰箱， 18 h 后将 消化酶换成 0. 25% 的胰酶， 置入 5% CO2、 37孵箱 培养 5 min 后取出， 放出气管内消化液， 加入含 10% 胎牛血清的培养液终止胰酶反应。用 5 ml 注射器 抽吸液体反复冲洗气管内面， 收集细胞悬液于离心 管中， 800 r/ min 离心 7 min， 弃上清， 用 PBS 洗涤 1 次。用 K-FSM 培养液重悬细胞后移入一次性培养 板中， 计数细胞。置入 5%CO2， 37孵箱培养， 静置 3 天后换液， 以后隔天换液。
12、Dispase 冷消化： 步 骤与两步酶消化法相似， 将消化条件换成0. 1% Dis- pase， 4 下消化 18 h， 收集细胞悬液于离心管中。 其余步骤同两步酶消化法。胰酶热消化：步骤与 两步酶消化法相似， 将消化条件换成 0. 25% 的胰 酶， 37消化10min， 用含10%胎牛血清的培养液终 止胰酶反应。收集细胞悬液于离心管中。其余步骤 同两步酶消化法。机械刮刷法：将冲洗干净的气 管剖成两半， 用手术刀刮取气管内膜， 用 PBS 冲洗， 收集冲洗液。计数细胞。置入 5% CO2、 37孵箱中 培养， 静置 3 天后换液， 以后隔天换液。 1. 4 上皮细胞鉴定 倒置显微镜下观察
13、培养的气 管上皮细胞状态， 计数细胞。免疫组化检测气管上 皮细胞角蛋白， 操作步骤按试剂盒说明书进行。 1. 5 统计学方法 使用 SPSS10. 0 统计学软件行单 因素方差分析， 两组间比较用 LSD 方法， P0. 05 为 差异有显著性统计学意义。细胞数量以均数 标准 差 （x s） 表示。 2 结 果 免疫组化检查气管上皮细胞特有的角蛋白， 染 色阳性可证实为气管上皮细胞 2. 1 气管上皮细胞分离的比较 Dispase 冷消化得 到的细胞数量 （381780 580） 较其他方法得到的少 （P 0. 05） 。镜下观察细胞状态 差异较大。两步酶消化法、 Dispase 冷消化所得细
14、胞 纯度高。机械刮刷法所得气管上皮细胞纯度较差， 细胞中含有大量的成纤维细胞， 在以后的培养中抑 制了气管上皮细胞的贴壁与增殖， 对气管上皮细胞 培养影响较大。胰酶热消化得到的细胞不能贴壁， 不能继续培养。 2. 2 倒置显微镜下气管上皮细胞生长特征 两步 酶消化法、 Dispase 冷消化法分离的气管上皮细胞为 圆形， 折光度好， 悬浮在培养液中， 静置 3 天后在显 微镜下可见细胞贴壁， 呈铺路石样， 4 5 天后细胞 增殖， 形成小片状的细胞群， 6 8 天后小片状细胞 群逐渐融合成片。机械刮刷法所得的细胞静置 3 天 后显微镜下可见细长梭形与铺路石样细胞并存， 4 5 天细胞增殖后可见
15、细长梭形细胞呈放射状或漩涡 状分布， 形成小片状的铺路石样细胞群， 6 8 天后 可见细长梭形细胞与铺路石样细胞互相掺杂生长。 胰酶温消化法消化得到的细胞不能贴壁和展开。 3 讨 论 气管上皮细胞作为种子细胞是组织工程气管中 不可缺少的部分。气管上皮是假复层纤毛柱状上 皮， 仅有一层细胞。使用酶消化时应严格把握酶浓 度及消化时间。消化不到位时分离下来的细胞数量 较少； 消化过头会将黏膜层的成纤维细胞一并消化 下来， 同时还会破坏已消化细胞膜的完整性， 影响上 皮细胞的贴壁、 增殖。Dispase 是一种分离上皮与真 皮细胞的中性蛋白酶， 在分离上皮细胞时， 作用于基 膜， 选择性地分解纤维黏连
16、蛋白和型胶原蛋白， 而 保存上皮细胞的活性和连接 8。胰酶是目前应用 最为广泛的组织消化分离试剂， 主要功能是使细胞 间的蛋白质水解、 细胞分散 9。胰酶消化能力较 Dispase 强， 对细胞的损伤也较大， 而后者较温和， 只 是将上皮细胞分离下来， 而保留细胞膜的完整性， 不 损伤细胞的活力。 本实验结果显示， 单独使用胰酶 （下转第 874 页） 178 第 10 期 邓三明， 等 四种气管上皮细胞分离培养方法的比较研究 3 讨 论 NF-kB 是近年来研究较为深入的调节细胞基因 转录的一种关键因子， 调控基因编码急性时相蛋白、 细胞因子和细胞黏附分子等。通过调控多种基因的 表达，NF-
17、kB 参与免疫反应、 炎症反应、 细胞凋亡、 肿瘤发生等多种生物进程 1， 2。 细胞在静息状态下，NF-kB 以无活性的潜伏状 态存在于细胞质中， 与一类抑制因子 IkB （IkBs） 结 合组成为一异源三聚体。其中 p50-p65-IkB 或 IkB 是 NF-kB/ IkB 结合的主要形式。三聚体中 IkB 家族抑制因子的存在可阻碍 p50， p65 复合物的 二聚体化， 从而使 NF-kB 的活性丧失 3， 4。当细胞 受到肿瘤坏死因子 （TNF） 、 佛波醇酯 （PMA）等 NF-kB激活剂刺激时， 激活 IkB 激酶 （IkB kinase， IKK） ， IKK 催化 IkBs
18、的 Ser32/36 磷酸化后，随之泛 素化及酶解。IkBs 从三聚体中解离出来， 暴露出 p50 亚基上的易位信号和 p65 亚基上的 DNA 结合 位点， 从而使此异二聚物表现出 NF-kB 活性， 并从 细胞质中易位至细胞核中， 与 kB 基序 （kB motif） 相 结合， 从而发挥转录调控作用 5， 6。有研究表明， IkB 的 Ser32/36 两个磷酸化位点任一个或同时发 生点突变， 可使 IkB 不被 IKK 磷酸化及降解， 从而 特异性地结合 NF-kB， 阻遏其异常激活 7， 8。 基于上述机制， 我们利用 RT-PCR 和重叠延伸 PCR 技术， 体外定点突变 IkB
19、磷酸化位点 Ser36， 将 其突变为 Ala36， 并以 PcDNA3. 0 载体成功构建了 PcDNA3.0-IkBM 重组真核质粒表达系统。为研究 在炎性反应、 细胞凋亡、 肿瘤发生等多种生物进程中 观察超级抑制物 IkBM 对 NF-kB 活性的抑制作用奠 定基础。 参考文献： 1 Celec P. Nuclear factor kappa B-molecular biomedicine：the next generation J . Biomed Pharmacother， 2004， 58 （6-7） ： 365-371. 2 Bobrovnikova-Marjon EV，Marj
20、on PL， Barbash O， et al. Expres- sion of angiogenic factors vascular endothelial growth factor and in- terleukin-8/ CXCL8 is highly responsive to ambient glutamine a- vailability：role of nuclear factor-kappa B and activating protein-1 J . Cancer Res， 2004， 64 （14） ： 4858-4869. 3 Ghosh S，May MJ，Kopp
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24、ed，1999， 5 （4） ： 412-417. （责任编辑： 鲁 立； 英文编辑： 李幼生 = ） （上接第 871 页） 热消化法时消化能力强， 对细胞损伤也较大， 消化下 来的细胞状态差， 不能贴壁， 也不增殖， 单独使用 Dis- pase 冷消化时， 细胞纯度、 细胞状态虽然较好， 但消化 不到位， 所得细胞数量较少。两步酶消化法避免了酶 单独消化的缺点， 消化时对气管上皮细胞与成纤维细 胞的分离作用温和， 可将两者分离， 得到的气管上皮 细胞纯度好， 同时细胞数量较多。使用机械刮刷法 时， 刮刷力量较难掌握， 难免将一些成纤维细胞共同 刮刷下来。成纤维细胞贴壁与增殖能力较气管上皮
25、 细胞强， 在随后的培养中， 虽然我们使用无血清培养 液抑制成纤维细胞的生长， 但仍有部分成纤维细胞分 裂增殖， 从而抑制气管上皮细胞的生长。通过本实验 我们认为， 两步酶消化法较其他几种消化法所得的细 胞数量多、 纯度较高， 消化下来的细胞较容易贴壁、 增 殖， 是一种较好的气管上皮细胞体外分离培养方法。 参考文献： 1 张 涛， 李小飞. 气管移植研究进展 J . 实用医学杂志， 2002， 18 （10） ： 1131-1133. 2 王海峰， 陈晓峰. 人工气管移植新进展 J . 临床肺科杂志， 2001， 6 （2） ： 25-28. 3 章静波. 组织和细胞培养技术 M . 北京：
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