《大鼠肾移植模型的建立方法及技巧.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《大鼠肾移植模型的建立方法及技巧.pdf（3页珍藏版）》请在三一文库上搜索。
1、现代中西医结合杂志M o d e r nJ o u r n a lo fI n t e g r a t e dT r a d i t i o n a lC h i n e s ea n dW e s t e r nM e d i c i n e2 0 0 9A p r ，1 8 ( 1 1 )1 2 1 7 大鼠肾移植模型的建立方法及技巧 高松，梁军丽，刘建华，曾金雄，李敏 ( 南京军区福州总医院，福建福州3 5 0 0 2 5 ) 摘要目的为进行大鼠肾移植术后急性排斥反应研究的需要，建立大鼠肾移植模 型。方法采用原位低温灌注、裸眼下原位套管吻合静脉、端侧吻合动脉，输尿管膀胱瓣与膀 胱吻合法。
2、蛄果建立了可靠稳定的大鼠肾移植模型，手术成功率8 9 。结论此方法建 立的模型较可靠，完全可以满足移植术后急性排斥反应研究。 关键词】肾移植；大鼠；急性排斥反应 中图分类号 R 一3 3 2 文献标识码】 A 文章编号 1 0 0 8 8 8 4 9 ( 2 0 0 9 ) 1 1 1 2 1 7 0 3 E s t a b l i s h e dm e t h o da n dc r a f to fr e n a lt r a n s p l a n t a t i o nm o d e li nR a t s G a oS o n g ，L i a n gJ u n l i ，L i u
3、J i a n h u a ，Z e n gJ i n x i o n g ，L iM i n ( F u z h o uG e n e r a lH o s p i t a lo fN a n j i n gM i l i t a r yC o m m a n d ，F u z h o u3 5 0 0 2 5 ，F u j i a n ，C h i n a ) A b s t r a c t ：0 b j e c t i v eI ti st Oe s t a b l i s hk i d n e yt r a n s p l a n t a t i o nm o d e li nR a
4、t sf o rt h er e q u i r e m e n to fa c u t er e j e c t i o ns t u d y a f t e rk i d n e yt r a n s p l a n t a t i o no fR a t s M e t h o d sT h et r a n s p l a n t a t i o nw a gp e r f o r m e dw i t hh y p o t h e r m i ap e r f u s i o ni ns i t u ，c a n n u - l ac o i n c i d i n gv e i n
5、 si ns i t uu n d e rn a k e de y e ，e n d t o - s i d ea n a s t o m o s i so fa r t e r i e sa n da n a s t o m o s eo ft t r e t e r o c y s t i cv a l v et ob l a d d e r R e s u l t sR e l i a b l ea n ds t e a d yk i d n e yt r a n s p l a n t a t i o nm o d e li nR a t sw a se s t a b l i s h
6、 e d T h ea c h i e v e m e n tr a t i oo fo p e r a t i o n w a s8 9 C o n c l u s i o nT h em o d e le s t a b l i s h e dw i t ha f o r e s a i dm e t h o di sr e l i a b l e 。w h i c hi sr a d i c a l l ys a t i s f i e df o rt h ea c u t er e j e c t i o ns t u d ya f t e rk i d n e yt r a n s
7、p l a n t a t i o n K e yw o r d s ：k i d n e yt r a n s p l a n t a t i o n ；R a t s ；a c u t er e j e c t i o n 大鼠肾移植模型在移植器官排斥反应研究中较为理想， 成本较低，建立方法多样，多位学者曾报道过几种有价值的模 型建立方法 1 q 】。但在实际操作中，很多细节部分决定了大 鼠移植后的存活率，笔者在模型建立中借鉴了多种方法，并最 后选择了肾动脉缝合法、静脉套管法、输尿管膀胱瓣与膀胱吻 合法，改进了多处关键步骤中的细节操作，提高了移植大鼠的 存活率，为研究大鼠急性排斥反应奠定了
8、实验基础。 1 实验资料 1 1 动物清洁级W i s t a r 、S D 大鼠各4 7 只，均为雄性，体质 量2 5 0 3 5 0g ，均由我院动物中心提供。 1 2 手术器材显微外科器械，无菌冰块，无菌C u f f 管( 内 径1 5m m ，长4m m ) ，9 0 带钎无损伤缝合线，5 0 结扎线，1 0 缝合线，肝素( 2 5I U m L ) 平衡液，1 氯胺酮注射液，青霉素 钠注射液。 1 3 模型的建立方法以W i s t a r 大鼠为供者，S D 大鼠为受 者，利用显微外科技术，在裸眼下行原位左侧肾脏移植，供体 肾动脉带腹主动脉瓣与受鼠腹主动脉端侧吻合，肾静脉C u
9、f f 管端端吻合，供肾输尿管带膀胱瓣与受鼠膀胱吻合，建立大鼠 f 乍者简介】高松( 1 9 8 0 一) ，男，硕士，研究方向为肾脏疾病的中 医理论基础及治疗方法。 通信作者】刘建华( 1 9 5 3 一) ，女，科主任，主任医师，教授，硕士 生导师，T d ：0 5 9 1 2 2 8 5 9 4 4 8 【基金项目】福蹩省自热基金资助项目( 2 0 0 6 J 0 1 t 5 ) 肾移植模型。动物准备：供、受鼠术前禁食1 2h ，不禁水；麻醉 采用1 氯胺酮腹腔内注射( 0 5m L 1 0 0g ) 。 1 3 1 供肾原位低温灌注与取肾( 以左肾作为供肾)麻醉 满意后，固定四肢于固定
10、板上，腹部用2 5 碘酒消毒后取腹 部正中切口，从剑突至耻骨联合依次剪开皮肤、肌肉，盐水纱 布拧干，中间剪开，铺巾，自制拉钩牵开切口，将肠管推向右侧 并另用盐水纱布覆盖，显露左肾，显微镊去除后腹膜，游离出 腹主动脉、下腔静脉，上达肠系膜上动脉分叉处，下至髂动脉 分叉处，用5 0 丝线结扎左精索静脉及左肾上腺静脉并剪断， 去除肾脂肪囊，分离左输尿管至膀胱，连带膀胱离断，显微血 管钳阻断下腔静脉和腹主动脉上、下端，由腹主动脉下端插入 灌注管，并提前于上方0 5c n l 处待线，适当力度拉紧血管与 灌注管，以防滑脱。在下腔静脉下端剪一开口，用4 含肝素 钠2 5I U m L 生理盐水经腹主动脉插
11、管灌注，灌注速度控制 在1 5 2 0 m L m i n ，灌洗至左肾和所属血管完全苍白，自下 腔静脉流出液变清澈为止。灌注完毕，拔出腹主动脉插管，切 断腹主动脉和下腔静脉上、下端，从底部分离出左肾，并将其 置于4 生理盐水中存放。 1 3 2 修剪供肾在4 生理盐水中进行供肾的修剪，并将 所盛器皿放入无菌冰保持低温。分离出腹主动脉、下腔静脉、 肾动脉、肾静脉，并去除血管周围脂肪，将肾动脉腹主动脉端 修剪成约4 m m 3 m m 的椭圆形动脉瓣，肾静脉下腔静脉端 修整成一漏斗状静脉瓣，将肾静脉穿入自制C u f f 套管腔内， 并把肾静脉壁外翻在套管上( 翻套时注意之前肾上腺静脉结 万方数
12、据 1 2 1 8 现代中西医结合杂志M o d e mJ o u r n a lo fI n t e g r a t e dT r a d i t i o n a lC h i n e s ea n dW e s t e r nM e d i c i n e2 0 0 9A p r ，1 8 ( 儿) 扎线头方向) ，5 0 丝线结扎固定肾静脉及套管，膀胱修整成 以左输尿管口为中心、约为4m m 3m m 的椭圆形膀胱瓣。 供肾修整完毕，放入4 生理盐水中存放。 1 3 3 保留右肾的左肾原位移植S D 大鼠同前消毒后取腹 部正中切口从剑突至下腹部( 下端露出膀胱1 2 即可) ，盐水 纱布
13、浸入生理盐水后拧干，自中间剪开，铺巾，自制拉钩牵开 切口，将肠管推向右侧并另用盐水纱布覆盖( 术中注意保持肠 道湿润) ，显露左肾，显微镊去除后腹膜，5 0 丝线结扎左精索 静脉、左肾上腺静脉，离肾门约1e m 处结扎剪断左输尿管，剥 离左肾脂肪囊，分离左肾动、静脉，在肾动脉腹主动脉端结扎、 剪断肾动脉，在肾静脉下腔静脉端下一L e e 夹、肾门端剪断， 取出左肾，用肝素钠经注射器冲洗出血管内残余血液。分离 腹主动脉、下腔静脉，去除血管周围脂肪，在左肾动脉下方约 0 5c m 处，用2 个L e e 氏夹分别阻断腹主动脉，形成一约1c m 的腹主动脉段，并在其上面做一与供肾动脉瓣相当的纵行切
14、口，肝素钠冲洗后用8 0 丝线端侧连续缝合供。肾肾动脉与受 肾腹主动脉，缝合完毕前肝素钠冲洗1 次，缝合完毕后L e e 夹 钳夹供肾动脉，开放腹主动脉，保证通畅、无出血；肝素钠冲洗 受肾静脉确认静脉无扭转后，将受肾静脉套至供肾C u f f 套管 上。用5 0 丝线结扎固定，至此供肾血管已吻合完毕( 动、静脉 血管重建过程中，供肾周围始终用低温棉球局部降温) ；先开 放肾动脉，后开放肾静脉，可见供肾血管充盈、供肾红润且富 有弹性( 见图1 及图2 ) 。观察供肾3 4m i n ，见输尿管口尿液 流出，开始尿路重建。在受鼠膀胱顶部剪一与供肾膀胱瓣相 当的切口，用8 0 丝线连续缝合供肾膀胱瓣
15、与受鼠膀胱。至 此，移植吻合完毕，检查腹腔无渗血，在受鼠右肾蒂处待一4 号丝线( 术后第3 天结扎右肾用) ，线头留于体外，恢复腹内 脏器位置后，用1 号线依次缝合肌肉、腹壁，手术结束。 图2 血管吻合好开放后3 r a i n 1 3 4 术后处理 注意受鼠的干燥及保暖，术后2 4h 内给 予5 葡萄糖盐水喂养，之后恢复正常饮食。术后3d ，每日 注射青霉素钠8 万I U 。 2结果 2 1 手术用时共行大鼠肾移植4 7 台，供体手术时间3 0 3 5m i n ，受体手术时间4 5 5 5r a i n ，其中动脉吻合时间1 0 1 5 m i n ，静脉吻合时间6 8m i n ，手术时
16、间主要受操作者熟练程 度及配合协作影响。 2 2 术后存活情况移植肾大鼠术后存活超过1 0d3 只，超 过7d1 3 只，超过3d2 5 只，1 只因麻醉过深死亡，2 只因静脉 血栓形成存活1d ，2 只因膀胱破裂死亡，1 只因动脉出血死 亡。术后动物存活达3d 认为模型建立成功【4 】。此方法大鼠 肾移植术后存活率达8 9 。 2 3 术后病理切片在移植肾术后7d 和1 0d ，随机抽取移 植肾行病理切片检查，并与正常肾组织比较，可看出不同阶段 比较典型的移植术后急性排斥反应。第7 天排斥反应明显， 可见肾组织内大量淋巴细胞浸润，肾小管扩张，充满蛋白管 型，结缔组织增生，肾小动脉外膜结缔组织
17、增生，淋巴细胞浸 润。术后1 0d ，排斥反应更明显，肾小管扩张伴淋巴细胞浸 润，部分结构损坏，部分肾小管出现坏死。见图3 5 。 图4 术后7d 移植肾( P A M 4 0 0 ) 3 讨论 本组大鼠肾移植模型手术难度小，手术全程在裸眼下进 行，无需显微镜辅助，血管吻合后出血少，血栓形成概率小，膀 胱吻合术成功率高，并发症少，有利于肾功能的保持。手术方 法较简单，易学易成功，条件普通的实验室均可开展。但手术 过程中，笔者结合文献报道与自身体会，发现很多细微之处。 总结了不少经验。 在供肾灌注冲洗时，灌注压力要控制适当，即灌注速度要 万方数据 现代中西医结合杂志M o d e mJ o u
18、r n a lo fI n t e g r a t e dT r a d i t i o n a lC h i n e s ea n dW e s t e r nM e d i c i n e2 0 0 9A p r ，1 8 ( 1 1 )1 2 1 9 中，结扎肾上腺静脉时，把结扎头朝向肾上级方向，受体术时 便可防止静脉方向扭转。 静脉吻合管要求较严格，比如硬度要适中，若过软，可能 结扎后血管会狭窄，容易形成血栓；吻合管长度，一般加工成 3 - - 4m m ，过短时结扎线容易滑脱，过长血管壁容易损伤；另 外管径要求约1 5m m ，过细血流不畅，过粗吻合困难，易撕破 血管壁。 在肾移植术
19、后先保留右肾，并在右肾肾蒂处留线，应用原 图5 术后1 0d 移植肾( P A M 2 0 0 ) 肾肾血管体外延迟结扎 引，待3d 后体外结扎。这样可以为 保持适度与均匀。有文献报道灌注时压力最好在7 0m m H g 移植肾恢复肾功能争取时间，提高了移植肾大鼠的存活率。 ( 1m m H z ：0 1 3 3k P a ) 左右 5 l ，但实际操作中无法量化。在 参考文献】 预实验中总结出灌注速度过慢会出现残余血液冲洗不净，导 12 F a b r eJ , L i nS H , M o r r i sP R “8 l t ”“5 p l a n t a t i o nm ” 。8 协i
20、 l 。f 致血栓形成，肾功能受损。灌注速度过快，导致压力过大，肾 ，h 8 ：“i 9 “e s L N z J s 14 1 1 ：1 9 LJ 上J 掣， P To A ，u n t E，urg971,2 i e t s c hN e t tK l a re ta lAn e wm o d i t i e dt e c h n i q u eo t 组织受损。笔者采用2 0m L 注射器加留置针灌注，速度控制 u r 。t e r o u r e t 。r o s t o m yi 。r a tk i d 。e y t ，a n 。p l a n t a t i 。 J T r a 。s
21、 p l 。t 。 在1 5 2 0m L m i n 。这样可以保证灌注彻底并减低肾组织 t i o nP r o c e e d i n g , 2 0 0 5 , 3 7 ( 1 ) ：1 8 9 - 1 9 1 损伤。 3 L a u r i t z e nC An e wa n de 鲒i e rt e c h n i q u et 。a n a s t 。I n o s em i c r - 在手术过程中发现，动静脉吻合完成开放后，移植肾出现 o ，e l e s J S c a 。dJP I a s tR e c o n s t r S u r g 。1 9 7 8 ，1 2 (
22、 3 ) ：2 9 1 2 9 4 一个从饱满、红润到苍白继而逐渐再次充血、红润的过程，但 4 C u l yC R ，C 1 e m e t tD ，W i s e m a l lL R O x a l i p l a t i n Ar e v i e wo fi t sp - 无法像刚开放时那样红润、有光泽。笔者考虑有2 个原因：h a r m a c o l o g i c a lp r o p e r t i e sa n dc l i n i c a le f f i c a c yi nm a e t a s t a t i ec o l 一 刚开放时血流立即充满肾脏，肾表皮充血明
23、显，显示有光泽， o r e c t a lc a n c e ra n d i t sp o t e n t i a l i n o t h e ra l i g n a c i e s J D r u g s ，2 0 0 0 ， 待血流由入球小动脉进入毛细血管后血流变缓慢。由于手 6 0 ( 4 ) ：8 9 5 9 2 4 术时间较长，体液丢失较多，出现肾灌注压不足现象。这样不 5 J e n sP H ，D a n i e lP ，M a r t i nL ，e ta l M i c r O S L - g i c a lc u r r i c u l u mf o r 利于移植肾的
24、功能恢复。笔者采用术后即时给予滴洒备好的l e a - , n i r i g k i d n 8 Ya n dl i v e rt r a n s p l a n t a t i o ni nt h 8r a t J M i c r o 一 温度3 7 左右生理盐水，增强循环。并通过阴茎背静脉补液 8 “r g 。r y , 2 0 0 5 , 2 5 ( 8 ) ：6 1 4 5m L 6 1 ，大大改善了上述循环不足表现，术后5m i n 左右即可 6 1 张建平，张豪杰，王翔，等大鼠原位肾移植模型的建立 J 复 看到尿液渗出。 7 黄赤兵，吴军一种用于大矗肾移植的肾血管体外结扎法 J
25、静脉吻合时，经常出现这样的现象：由于肾静脉血管管壁 上海试验动物学，2 0 0 1 ，2 l ( 2 ) ：8 2 8 4 较薄，容易发生扭转但不易纠正往往手术结束后开放血流时 收稿日期】2 0 0 8 1 1 一0 7 发现。大大降低了手术成功率。笔者总结经验：在供体手术 ( 上接第1 2 0 8 页) 参考文献】 1 张玉珍中医妇科学 M 北京：中国中医药出版社，2 0 0 2 ：3 1 8 2 国家中医药管理局中药新药临床研究指导原则( 试行) M 北京：中国医药科技出版社，2 0 0 2 ：2 4 3 2 5 3 3 陈贵廷实用中西医结合诊断治疗学 M 北京：中国医药科技 出版社，1
26、9 9 1 ：9 4 6 4 朱新群，贾殿举，马椭妇产科感染基础与临床 M 北京：科学 出版社，2 0 0 2 ：1 3 9 1 4 1 5 周英芪藤止痛汤治疗气虚血瘀型慢性盆腔炎1 0 0 例 J 广西 中医药，2 0 0 7 ，3 0 ( 2 ) ：4 8 6 江苏新医学院中药大辞典( 上) M 上海：上海人民出版社， 1 9 7 7 ：3 8 5 ；1 0 9 4 1 1 9 5 7 侯家玉中药药理学 M 北京：中国中医药出版社，2 0 0 2 ：1 3 6 ； 1 4 5 ；1 6 0 ；2 1 3 8 金瑛，陈听。张佳红，等盆腔炎1 5 0 例致病因素分析 J 中国 实用妇科与产科杂
27、志，2 0 0 4 ，2 0 ( 9 ) ：5 5 7 5 5 8 9 王光超皮肤病及性病学 M 北京：北京科学出版社，2 0 0 2 ： 3 6 7 3 9 l 1 0 王岱明抗生素的药理特点与序贯疗法 J 中国实用儿科杂 志，2 0 0 3 ，1 8 ( 4 ) ：1 9 5 1 9 6 1 1 A z o u l a y V u p u i s E ，V a l l e e E ，B e d o sJ P ，e t a l P r o p h y l a c t i c a n d t h e r - a p e u t i ea c t i v i t i e ao fa z i t h r o m y c i ni nam o u s em o d e lo fp n e u m o c o c e a l p n e u m o n i a J A n t i m i c r o bA 黜O a e m o t h e r ，1 9 9 1 ，3 5 ( 6 ) ：1 0 2 4 1 0 2 8 【收稿日期】2 0 0 8 1 1 1 5 万方数据