天麻素对海人酸致大鼠大脑皮质神经元损伤的保护作用.pdf

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1、生垦塞旦塑丝壅塞盘查! ! ! ! 生! 旦箜! ! 鲞笪! 塑 曼坠! 塑! ! ! ! ! ! ! ! ! 里! ! ! ! 堡! ! 堕! 型竺坚垡! ! ! 竺! 坚! ! ：! ! ! ! ：Y ! ! ：! ! 型! ：! 3 3 研究生园地 天麻素对海人酸致大鼠大脑皮质神经元损伤的保护作用 赵燕玲 张博爱贾延劫籍炀飞 孙桂芳文全庆 郑州大学第一附属医院神经内科郑州4 5 0 0 5 2 【摘要】目的探讨天麻素对海人酸致大鼠大脑皮质神经元损伤的保护作用及可能机制。方法提取新生大鼠大脑皮 质神经元体外培养，7 d 后随机分为对照组、海人酸模型组、不同浓度天麻素干预组( 1 2 5 、

2、2 5 、5 0 m g L ) ；采用倒置相差显微镜 观察神经元形态学变化A O E B 荧光染色检测神经元凋亡，L D H 活性测定检测胞膜稳定性，C Y 3 荧光染色检测E p h A 4 表达 变化。结果与海人酸模型组相比，各天麻素干预组神经元凋亡率、L D H 活性显著下降( P O 0 1 ) ，E p h A 4 表达上调显著受 抑( P o 0 1 ) 。以2 5 m g L 天麻素效果最明显。结论天麻素对海人酸诱导大鼠大脑皮质神经元损伤具有保护作用，以中浓 度效果最佳，可能与抗凋亡、稳定细胞膜、抑制细胞活化蛋白E p h A 4 的表达上调等因素相关。 【关键词】天麻素；海人

3、酸 神经元；凋亡；E p h A 4 【率固分类号】R - 3 3 2【文献标识码】A【文章编号】1 6 7 3 5 1 1 0 ( 2 0 0 9 ) 0 5 0 0 3 3 0 4 P r o t e c t i v ee f f e c t so fg a s t r o d i n eo ni a iu r e dr a tc e r e b r a ln e u r o n sb yK AZ h a oY a n l i n g ，Z h a n gB o a i ，J i aY a n j i e ，e t a 1 D e p a r t m e n to f N e u r o

4、l o g y ，t h eF i r s tAfl t l i a t e dH o s p i t a lo fZ h e n g z h o uU n i v e r s i t y ，Z h e n g z h o u4 5 0 0 5 2 ，C h i n a A b s t r a c t O b j e c t i v eT oe x p l o r et h ep r o t e c t i v ee f f e c t so fg a s t r o d i n eo ni n j u r e dr a tc e r e b r a lc o r t i c a ln e u

5、 r o n sb yK Aa n dt h e p o s s i b l em e c h a n i s m M e t h o d sN e u r o n sf r o mn e w b o r nr a tc e r e b r a lc o r t e xw e r ec u l t u r e di nv i t r of o rs e v e nd a y s a n dw e r ed i v i d e di n t of i v eg r o u p sr a n d o m l y ：c o n t r o lg r o u p ，e x p o s u r et O

6、K Ag r o u p ，a n de x p o s u r et Og a s t r o d i no fd i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o n g r o u p s ( 1 2 5 m g L ，2 5 m g L ，5 0 r a g L ) M o r p h o l o g i cc h a n g e so fn e u r o n sw e r eo b s e r v e d w i t hi n v e r t e dp h a s ec o n t r a s tm i c r o - s c o p e A p o p

7、 t o s i so fn e u r o n sw a sd e t e c t e db yf l u o r e s c e i ns t a i no fA O E B S t a b i l i t yo fc e l lm e m b r a n ew a sd e t e c t e db ym e a s u r eo f L D H E x p r e s s i o n so fE p h A 4w e r em e a s u r e db yf l u o r e s c e i ns t a i no fC Y 3 R e s u l t s N e u r o n

8、 a la p o p t o t i cr a t i o sa n da c t i v i t i e so f L D Hw e r en o t a b l yd e c r e a s e da n du p - r e g u l a t i o n so fE p h A 4w e r en o t a b l yi n h i b i t e di ne x p o s u r et Og a s t r o d i no fd i f f e r e n tc o n c e n - t r a t i o ng r o u p sc o n t r a s tt oc o

9、 n t r o lg r o u p ，a n dt h ee f f e c to f2 5 m g Lg a s t r o d i nw a st h em o s to b v i o u s C o n c l u s i o nG a s t r o d i nh a d a n e u r o p r o t e c t i v ee f f e c to ni n j u r e dr a tc e r e b r a lc o r t i c a ln e u r o n s ，e s p e c i a l l yg a s t r o d i no fm o d e r

10、 a t ec o n c e n t r a t i o n ，w h i c hm a yb e a s s o c i a t e dw i t hr e s i s t a n c eo fa p o p t o s i s ，s t a b i l i z a t i o no fc y t o m e m b r a n e ，i n h i b i t i o no fE p h A 4u p - - r e g u l a t i o na n dS Oo r b K e yw o r d s G a s t r o d i n ；K A , N e u r o n ；A p

11、o p t o s i s ；E p h A 4 天麻素是我国传统中药天麻的主要药用成分， 不但能镇静、镇痛，改善心脑血管功能还具有神经保 护作用 。本实验通过海人酸( k a i n i ea c i d ，K A ) 诱 导谷氨酸受体过度激活制作神经毒性模型，天麻素 作为干预因素，检测神经元凋亡率、膜稳定性及细胞 活化蛋白E p h A 4 的表达变化，探讨天麻素对兴奋毒 性致大鼠大脑皮层神经元损伤的保护作用及可能机 制。 1 材料与方法 1 1 试验动物及主要试剂S P F 级健康新生S D 大鼠( 郑州大学医学院实验动物中心) ，N e u r o b a s a l 培养基，B 2

12、7 试剂( 美国G i b c o 公司) ，海人酸( 美国 S i g m a 公司) ，天麻素( 南京替斯艾么中药研究所) ， 抗鼠E p h A 4 多克隆抗体( 美国S a n t aC r u z 公司) ， A O E B 荧光试剂盒、C Y 3 荧光试剂盒( 武汉博士得 通讯作者：张博爱，女，教授，E m a i l ：x i a o 】【i l i 6 2 3 1 6 3 t o m 生物制品公司) ，L D H 定量检测试剂盒( 南京建成生 物工程研究所) 等。 1 2 新生大鼠皮层神经元原代培养将新生( 2 4 h 以内) S D 大鼠无菌条件下断头，取出双侧大脑皮层 置D

13、 h a n k s 溶液中反复漂洗，剥离血管及脑膜后 剪成约l m m 3 的小块，置2 5 9 L 胰蛋白酶中3 7 水浴消化5 1 0 m i n ，加入胎牛血清终止消化，吹打 均匀后置离心机中1 0 0 0 r m i n ，离心1 0 r a i n ，弃上清 液，加入培养液( n e u r o b a l 培养基5 0 0 m l 添加B 2 7 试剂1 0 m l ，青霉素G 、链霉素各5 万单位，L 一谷氨酰 胺l m m o l 。p H 值7 2 0 ) 吹打至细胞分散，2 0 0 目筛 网过滤，调整细胞密度为1 3 1 0 6 个c m 3 ，接种到 多聚左旋赖氨酸包被

14、过的2 4 孔培养板。置9 5 空 气5 C O 。培养箱中3 7 培养，2 4 h 后首次换液，以 后每3 天换液一次，7 d 后备用。 1 3 神经元分组及模型建立参照S i m o n i a n 等 2 制作海人酸诱导神经元凋亡模型，取出培养7 d 的神 万方数据 。3 4 。 主垦塞旦登丝壅瘟盘查；! ! ! 生! 旦筻! ! 鲞蔓! 塑 壁堕! ! 苎型! ! 型堕! 坚生! ! 堕! 竺! ! ! 望! 竺! 塑坚! ! ：! ! ! ! ：Y ! ! ：! ! 塑! ：! 经细胞，吸掉培养液用无钠L o c k e s 液( N 一甲基一p 葡 萄糖胺1 5 4 6 m m o

15、 l ，K C l5 6 m m o l ，C a C l 22 3 m m o l ， M g C l 21 0 r e t o o l ，N a H 0 0 33 6 m m o l ，H E P E S5 m m o l ， D 葡萄糖5 6m m o l 溶于1 L 去离子高纯水中，p H 值7 4 0 ) 洗一遍，室温暴露于添加海人酸( 终浓度 1 0 0 t 比m o l L ) 的无钠L o c k e s 液3 0m i n ，无钠 L o c k e s 液再次洗后换回原培养液，放回培养箱继 续3 7 培养2 4 h 。对照组除L o c k e s 液中不添加海 人酸，余步

16、骤相同。天麻素干预组在L o c k e s 液中 同时添加海人酸和天麻素( 终浓度分别为1 2 5 m g L 、2 5 m g L 、5 0 m g L ) ，换回原培养液后再次添加天 麻素，使其持续存在，余步骤相同。 1 4 神经元形态学观察倒置相差显微镜下，正常 细胞大小形态均匀一致，细胞体椭圆或锥形、光滑， 细胞突起广泛分支、光滑，折光性强；受损细胞大小 形态改变，胞体出现颗粒，轴突出现串珠，突起缩短， 分支减少，折光性下降。 1 5 神经元凋亡检测应用A O E B 荧光试剂盒 行A O E B 染色，操作步骤按照试剂盒说明书进行。 荧光显微镜下可见四种细胞形态：活细胞( V N

17、) ，核 染色质着绿色并呈正常结构；早期凋亡细胞( V A ) ， 核染色质着绿色呈固缩状或圆珠状；晚期凋亡细胞 ( N V A ) ，核染色质着橘红色并呈固缩状或圆珠状； 非凋亡死亡细胞( N V N ) ，核染色质着橘红色并呈正 常结构。高倍镜下随机选取4 个视野分类计数细胞 计算凋亡率，细胞凋亡率= ( V A + N V A ) ( V N + N V N + V A + N V A ) X1 0 0 1 6 膜稳定性检测收集培养上清液，参照试剂盒 说明书测定培养液中L D H 活性。 1 7 E p h A 4 表达测定 4 多聚甲醛固定，应用 C Y 3 荧光试剂盒进行免疫组化染色

18、，操作步骤按照 试剂盒说明书进行。含50 A B S A 的T B ST x 封闭 6 0 m i n ；兔抗鼠E p h A 4 抗体浓度为1 ：1 0 0 ，4 过 夜；C Y 3 标记的抗兔I g G 浓度为1 ：2 0 0 ，作用 6 0 m i n ；抗荧光淬灭封片液封片后荧光显微镜下观 察，免疫阳性细胞呈红色荧光。应用I m a g e - P r o P l u s6 0 专业图像分析软件分析各实验组的荧光图 片单个细胞的累积光密度值及平均累积光密度值。 进行统计学分析。 1 8 统计学处理所有数据以均数士标准差( z s ) 表示，用S P S S l 3 0 统计软件，采用单

19、因素方差分 析( A N O V A ) 处理实验数据，经最小显著性差异法 ( L S D 法) 进行检验。P 0 0 5 为差异有统计学意 义，P O 0 1 统计学有显著差异。 2结果 2 1 神经元形态海人酸模型组受损细胞较对照 组显著增多，各天麻素干预组受损细胞显著少于海 人酸模型组，以2 5m g L 天麻素减轻细胞损伤最明 显。 2 2 神经元凋亡率A 0 E B 荧光染色显示海人酸 模型组细胞凋亡率较对照组显著增高，各天麻素干预 组细胞凋亡率显著低于海人酸模型组，以2 5 m L 天 麻素降低细胞凋亡率最明显( 见表1 ，图1 A 、B 、C ) 。 图1 A 对照组2 4 hA

20、 O E B 荧光染色调亡细胞( A O E B 荧 光染色，2 0 0 ) 图1 B 海人酸模型组调亡细胞显著增多。核染色质着橘红 色并呈固缩状或圆珠状( A t ) E B 荧光染色，2 0 0 ) 围1 C2 5 m g L 天麻素干预组调亡细胞显著低于海人酸模 型组( A O E B 荧光染色，2 0 0 ) 万方数据 主垦塞旦盐丝瘗疸盘查! ! ! ! 笙! 旦箜! ! 鲞筮i 塑! i 竺苎! ! ! 塑! ! ! 里! ! 鲤塑! 塑! ! 翌! ! 望兰! ! ! ! 坚! 曼! ! ! ! ! ! ! ! ：! ；堕! ：! 3 5 2 3 膜稳定性 海人酸模型组细胞培养液中

21、L D H 活性较对照组显著升高，各天麻素干预组培养液中 L D H 活性显著低于海人酸模型组，以2 5 m g L 天麻 素减少L D H 漏出最明显( 见表1 ) 。 2 4E p h A 4 表达海人酸模型组神经元的红色荧 光强度较对照组显著增强，各天麻素干预组神经元 的红色荧光强度显著弱于海人酸模型组，以2 5 r a g L 天麻素抑制E p h A 4 表达最明显( 见表1 ，图2 A 、 B 、C ) 。 圈2 A 对照组2 4 hC Y 3 荧光染色神经元红色荧光强 度小( C Y 荧光染色，4 0 0 ) 圈2 B 海人酸模型组神经元红色荧光强度较对照组显著 增强( C Y

22、荧光染色，4 0 0 ) 围2 C2 5 m g L 天麻素干预组神经元红色荧光强度显著弱 于海人酸模型组( C Y 荧光染色，4 0 0 ) 表1 各组神经元凋亡辜、培养液中L D H 活性、 E p h A 4 荧光染色平均累积光密度值( z s ) 组别 凋亡率L D H 活性 E p h A 4 ( ，雄一4 ) ( U L ，挖一4 ) 光密度值( n = 5 ) 与空白对照组比较，P O 0 1 口P O 0 5 ；与海人酸组比 较，P O 0 1 3 讨论 天麻素是我国传统中药天麻的主要药用成分， 化学名为4 一羟甲基苯一胪D 吡喃葡萄糖苷，具有镇 静、镇痛、抗炎及增强血管顺应性

23、、改善脏器缺氧等 作用，安全低毒，I 临床上主要用于神经衰弱、头痛、眩 晕等。近年来研究表明天麻素亦可通过影响凋亡调 控基因的表达增加脑内超氧化物歧化酶含量，清除 自由基，阻滞细胞内钙超载，抑制N O 产生，增加 V E G F 表达，保护脑细胞膜A T P 酶的活性，改善离 子转运等机制起神经保护作用 1 矗 。 海人酸是谷氨酸的结构类似物，在脑内可作用 于谷氨酸能末梢突触前膜上的K A 受体，刺激内源 性兴奋性氨基酸的释放并抑制其再摄取，使兴奋性 氨基酸过度激活，产生兴奋毒性，致突触后神经元受 损 4 。本实验通过细胞形态学观察，A O E B 荧光染 色检测凋亡，培养液L D H 活性测

24、定，C Y 3 荧光染色 测定E p h A 4 表达强弱，显示大鼠大脑皮层神经元暴 露于1 0 0 p m o l L 海人酸后，大小形态异常，轴突缩 短，突起、突触减少，染色质凝集或断裂，凋亡细胞显 著增多，胞膜完整性受到破坏，胞浆漏出L D H 显著 增加，细胞活化蛋白E p h A 4 表达显著上调，提示细 胞受损。加人天麻素干预后，细胞凋亡、L D H 漏出、 E p h A 4 上调明显受抑，表明天麻素对海人酸致神经 细胞的兴奋毒性损伤具有一定保护作用，以中浓度 的天麻素保护作用最明显。与其抗凋亡、稳定细胞 膜、抑制损伤应答分子E p h A 4 的表达上调相关，机 制可能为：(

25、1 ) i J l 节递质性氨基酸的含量，增强神经 细胞对谷氨酸的再摄取，抑制谷氨酸的瀑布性释放， 减弱谷氨酸对受体的过度刺激，维持兴奋性氨基酸 和抑制性氨基酸的动态平衡 钉；( 2 ) 增加凋亡抑制基 因的表达，降低凋亡促进基因的表达1 ；( 3 ) 抑制磷 脂酶的激活，阻止磷脂的降解，维持神经细胞膜流动 性和完整性1 ；( 4 ) 通过抑制E p h A 4 的表达，调控细 万方数据 3 6 胞形态、黏附、存活，对抗其诱发调亡、引发轴突退 缩、抑制轴突生长、影响突触传递、负向调控树突棘 等作用8 州。 兴奋性氨基酸介导的神经毒性机制参与了许多 急慢性神经系统疾病的发生，天麻素的抗兴奋毒性

26、损伤作用对治疗这类疾病具有重要的临床价值，其 神经保护具体机制的研究能为进一步明确天麻素的 药理提供依据，尚需更加深入的探索。 参考文献 1 张艳琼王晓丹。黄利鸣，等天麻对中枢神经系统影响的基础 研究进展I - J 3 时珍国医国药，2 0 0 6 ，1 7 ( 4 ) z5 4 1 5 4 2 2 S i m o n i a nN A ，G e t zR L ，L e v e q u eJ C ，e ta 1 K a i n i ca c i di n - d u c e sa p o p t o s i si nn e u r o n s J N e u r o s c i e n c e

27、 ，1 9 9 6 ，7 5 ( 4 ) ： 1 0 4 7 1 0 5 5 3 刘艳茹张博爱，李文涛，等天麻钩藤饮对脑缺血大鼠的神经 保护机制研究C J 中国实用神经疾病杂志，2 0 0 7 ，1 0 ( 3 ) ；1 0 2 一 脑梗死患 1 0 4 W a n gQ ，Y uS S i m o n y iA e ta 1 K a i n i ca c i d m e d i a t e de x c i t o t o x i c i t ya sam o d e lf o rn e u r o d e g e n e r a t i o n J M o lN e u r o b i 0

28、 1 2 0 0 5 ，3 1 ( 1 - 3 ) ：3 - 1 6 Z e n gX ，Z h a n gY ，Z h a n gS ，e ta LAm i c r o d i a l y s i ss t u d yo f e f f e c t so fg a s t r o d i no nn e u r o c h e m i c a lc h a n g e si nt h ei s c h e m i c r e p e r f u s e dr a tc e r e b r a lh i p p o c a m p u s J B i o lP h a r mB u l l ，

29、 2 0 0 7 3 0 ( 4 ) ：8 0 1 - 8 0 4 谢琳，李茂进，刘永霞等天麻素对染铅大鼠脑细胞凋亡影响 E J 中国公共卫生，2 0 0 7 ，2 3 ( 4 ) ：4 7 8 4 7 9 孙晓芳，王巍，王丹巧等天麻及其制剂神经保护机制的研究 进展 J 中国中药杂志，2 0 0 4 2 9 ( 4 ) ；2 9 2 2 9 5 P a s q u a l eE B E p h e p h r i nb i d i r e c t i o n a ls i g n a l i n gi np h y s i o l o g y a n dd i s e a s e J C e

30、l l 。2 0 0 8 ，1 3 3 ( 1 ) t 3 8 5 2 M o r e n o - F l o r e sM T ，W a n d o s e l lF U p - r e g u l a t i o no fE p ht y r o s i n ek i n a s er e c e p t o r sa f t e re x c i t o t o x i ci n j u r yi na d u l th i p p o c a m p u s J N e u r o s c i e n c e ，1 9 9 9 ，9 1 ( 1 ) 1 1 9 3 2 0 1 ( 收稿

31、2 0 0 9 - 0 1 1 5 ) 者颈动脉粥样硬化斑块与血浆胆红素、尿酸 李春滕军放冀书娟 郑州大学第一附属医院神经内科郑州4 5 0 0 5 2 的关系 【摘要】目的探讨脑梗死患者颈动脉粥样硬化斑块与血浆胆红素、尿酸的关系。方法对3 5 1 例脑梗死患者行颈动脉 彩色超声检查确定有无颈动脉斑块，根据斑块的有无分为颈动脉斑块组( ”一2 1 8 ) 和对照组( 竹= 1 3 3 ) 。检测两组患者血浆胆红 素、尿酸，同时调查血糖、血脂、吸烟、酗酒、高血压等其他危险因素并比较分析。结果颈动脉斑块组血浆胆红素水平低于对 照组，尿酸水平高于对照组，差异有统计学意义( P o 0 5 ) 。L

32、o g i s t i c 多元回归分析发现，血浆胆红素、尿酸均为脑梗死患者颈 动脉粥样硬化斑块的独立危险因素。结论在脑梗死患者颈动脉斑块的发生发展中，血浆胆红素、尿酸起了非常重要的作用。 【关键词】胆红素I 尿酸；脑梗死；颈动脉粥样硬化斑块 【中图分类号】R 7 4 3 3 3【文献标识码】A 【文章编号】1 6 7 3 5 1 1 0 ( 2 0 0 9 ) 0 5 0 0 3 6 一0 3 A s s o c i a t i o no fs e r u mb i l i r u b i na n du r i ca c i dl e v e lw i t hc a r o t i dp

33、l a q u ei np a t i e n t sw i t hc e r e b r a li n f a r c t i o n L i C h u n ，T e n g J u n f a n g ，J i S h 可加以D e p a r t m e n t o fN e u r o l o g y ，t h e F i ”t A f f i l i a t e dH o s p i t a l ，Z h e n g z h o u U n i v e r s i t y ，Z h e n g z h o u4 5 0 0 5 2 ，C h i n a A b s t r a c

34、t O b j e c t i v eT os t u d yt h er e l a t i o n s h i pb e t w e e nc a r o t i dp l a q u ea n ds e r u mb i l i r u b i n ，u r i ca c i di np a t i e n t sw i t hc e r e - b r a li n f a r c t i o n M e t h o d sT h r e eh u n d r e da n df i f t y - o n ei n - p a t i e n t sw i t hc e r e b

35、r a li n f a r c t i o nw e r es c r e e n e df o rc a r o t i dp l a q u eb y d u p l e xc o l o rD o p p l e ra n dt h e nc l a s s i f i e di n t op l a q u eg r o u p ( 行= 2 1 8 ) a n dc o n t r o lg r o u p ( 咒= 1 3 3 ) T h es e r u mb i l i r u b i na n du r i c a c i dw e r em e a s u r e d T

36、 h eo t h e rr i s kf a c t o r s s u c ha ss e r u mg l u c o s e ，l i p i d s ，s m o k i n g ，d r i n k i n g ，h y p e r t e n s i o nw e r ei n v e s t i g a t e d R e s u l t sT h el e v e l so fb i l i r u b i nw e r el o w e ri nc a r o t i dp l a q u eg r o u pt h a nt h o s eo fc o n t r o l

37、g r o u p T h el e v e l so fu r i ca c i dw e r e h i g h e ri nc a r o t i dp l a q u eg r o u p T h er e s u l to fl o g i s t i cr e g r e s s i o na n a l y s i si n d i c a t e dt h a ts e r u mb i l i r u b i n ，u r i ca c i dw e r et h ei n d e p e n d e n tr i s kf a c t o r s C o n c l u s

38、 i o nB o t hs e r u mb i l i r u b i na n du r i ca c i da r es t o n g l ya n dc l o s e l yr e l a t e dt Ot h eo c c u r a n c ea n dd e v e l o p m e n to fc a r o t i dp l a q u ei np a t i e n t sw i t hc e r e b r a li n f a r c t i o n K e yw o r d s B i l i r u b i n ；U r i ca c i d ，C e r e b r a li n f a r c t i o n ；C a r o t i da t h e r o s c l e r o t i cp l a q u e 颈动脉斑块形成是动脉粥样硬化的明显特征， 它可反映动脉粥样硬化的程度1 | ，传统的危险因素 通讯作者：膝军放，男。教授，博士生导师，E m a i l ：t j f 6 6 6 6 y a h o 仉c o i n c n 是高血压、糖尿病、高血脂等，然而很多患者并不存 在上述危险因素。近年的研究发现血浆胆红素和尿 酸异常在动脉粥样硬化斑块的发生中可能起到一定 I = l 口 口 口 口 凹 万方数据