《在体转染GSK3β引起TAU蛋白在PHF1 位点的过度磷酸化.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《在体转染GSK3β引起TAU蛋白在PHF1 位点的过度磷酸化.pdf（5页珍藏版）》请在三一文库上搜索。
1、5 0 6 A r ti c l e II ) 1 0 0 0 一 4 7 1 8 ( 2 0 0 6 ) 0 3 一 0 5 0 6 一 0 5 T r a n s f e c t i o n w i t h GS K一 h y p e r p h o s p h o r y l a t i o n 3 p i n vi voi n d u c e s加u a t P HF一1 s i t e s L I H o n g 一 h a n i ， W A N G S h a o 一 h u i2 ， W A N G Q u n 2 ， L I AO Xi a o一m et2 ， W A N G
2、 X ia o 一 c h u a n 2 ， WA N G J i a n 一 z h i 2 ( D iv is io n of H is to lo g y S K 一 3 (3 t r a n s f e c t io n g r o u p , v e c t o r g ro u p a n d c o n t r o l g r o u p ; 0 . 1 p g / 3 K l . G S K 一 3 (3 一 H A p l a s m id o r v e c to r ， i n j e c te d b il a te r a ll y i n to c e re b
3、r u m o f t h e r a t s r e s p e c t iv e l y , r a t s w it h o u t in j e c t io n w e re c o n t ro l s . W e s t e r n b l o t t in g a n d im m u n o h i s t o c h e m i c a l s ta in i n g o f c o rt e x w e re c a r r ie d o u t t o d e t e c t t h e e x p r e s s i o n o f G S K一 3 (3 一 H A
4、 p l a s m i d a n d t a u p h o s p h o ry l a t i o n u s i n g p h o s p h o ry l a t i o n 一 d e p e n d e n t t a u a n t i b o d y P H F ， 一 1 . R E S U L T S : A f t e r t r u n s f e c t i o n w i t h G S K 一 3 P 一 H A f o r 4 8 h , G S K 一 3 p 一 H A w a s e x p r e s s e d i n G S K 一 3 尽 t
5、 r a n s f e c t io n g ro u p ; a n d h y p e r p h o s p h o ry la te d t a u a t P H F 一 1 s i te s a c c u m u l a t e d in n e u ro n s i n t h e tr a n s f e c t e d a r e a s . T h e h y p e r p h o s p h o ry l a t e d t a u c o l o c a l i z e d l a r g e l y w i t h G S K 一 3 (3 e x p r e
6、s s e d b y t h e t r a n s f e c t e d G S K 一 3 (3 p l a s m i d . C O N C L U S I O N S : T r a n s f e c t i o n w i t h G S K 一 3 R i n ， c a n i n d u c e t a u h y p e r p h o s p h o ry l a t i o n i n v o l v i n g th e p a t h o g e n e s i s o f n e u ro d e g e n e r a t i v e d i s o r
7、d e r s . T h e s e d a t a f u rt h e r p ro v e t h a t G S K 一 3 P i s a k e y k i n a s e t o i n d u c e t a u h y p e r p h o s p h o ry l a t i o n a n d m a y b e a t h e r a p e u t i c t a r g e t f o r t a u o p a t h y 一 ， l a t e d n e u ro d e - g e n e r a t i v e d i s e a s e s . K
8、E Y W O R D S G ly c o g e n s y n th a s e k i n a s e 3 ; T a u p ro t e i n s ; H y p e r p h o s p h o ry la ti o n C L C n u m b e r 8 3 6 3 D o c u m e n t c o d e A A l z h e i m e r s d i s e a s e ( A D ) i s o n e o f t h e m o s t c o m m o n u l a t e s t u b u l i n a s s e m b l y i n
9、t o n e u r o d e g e n e r a t i v e d i s o r d e r s . T h e i n c i d e n c e o f t h e d i s e a s e g o e s u p s h a r p l y w i t h t h e q u i c k e n i n g p r o c e s s o f t h e p o p u l a - t i o n娜n g . I t b e c o m e s t h e f o u r t h l e a d i n g c a u s e t o d e a t h f o l l
10、o w i n g c a r d i o v as c u l a r d i s e a s e , c a n c e r a n d s t ro k e . A D i s c h a r a c t e r i z e d c l i n i c a l l y 场 p ro g re s s i v e m e m o ry i m p a i r m e n t a n d c o g n i t i v e d e f i c i t s . T h e h a l l m a r k l e s i o n s f o u n d i n A D b r a i n a r
11、 e s e n i l e p l a q u e s( S P ) ，n e u ro f ib r i l l a ry t a n g l e s ( N E T ) 一 a n d lo s s o f n e u ro n s t l . T h o u g h th e p a t h o g e n e s is l e a d i n g t o A D p a t h o l o g y i s s t i l l u n c l e a r , t h e e x t e n t o f d e - m e n t i a i s p o s i t i v e l y
12、c o r r e l a t e d t o t h e a m o u n t o f N F T i n t h e b r a in o f A D p a tie n ts 2 1 . N F T is c o m p o s e d o f b u n d l e s o f p a i r e d h e l i c a l f i l a m e n t s ( P H F ) ， w h o s e m a j o r p ro t e i n s u b - u n it is a b n o r m a lly h y p e r p h o s p h o ry l a
13、 te d ta u 3 ,4 1 . S u ita b ly p h o s p h o ry l a t e d t a u i s a n i m p o r t a n t c y t o s k e l e t a l p ro t e i n i n n e u r a l s y s t e m, a n d i t b i n d s t o m i c ro t u b u l e , a n d t h u s s t i m - m i c ro t u b u l e s t a b i l i t y , c y to s k e l e t a l i n t e
14、 g r i t y a n d a n d ma i n t a i n s n o rm a l a x - o p l a s m i c t r a n s p o r t . H o w e v e r , a b n o r m a l l y h y p e r p h o s p h o ry - l a t e d t a u l o s e s t h e a b o v e 一m e n t i o n e d f u n c t io n s 5 1 . T h e i m b a l a n c e b e t w e e n p ro t e i n k i n a
15、 s e s a n d p ro t e i n p h o s - p h a t a s e s i n t h e i n v o l v e d n e u ro n s i s t h e m a j o r b i o c h e m i c a l m e c h a n i s m o f t h e a b n o r m a l t a u h y p e r p h o s p h o ry l a t io n . T a u i n N F T s a g g re g a t e s i n t h e n e u ro n a l c e l l b o d y
16、 , i t is h y p e r p h o s p h o ry l a t e d a t s p e c if ic s it e s 1 5 1 ， a n d t a k e s 。 。 a n a b n o r ma l c o n fo r m a t io n 6 1 . T w o p ro l in 。 一 d ir e c te d k in a s e s , g l y c o g e n s y n t h a s e k i n a s e 一 3 ( G S K 一 3 ) a n d c y c l i n 一 d e - p e n d e n t
17、k i n a s e 一 5 a r e t h o u g h t t o b e k e y f a c t o r s i n a b n o r - m i l t a u p h o s p h o ry la tio n h i . M a m m a lia n G S K 一 3 e x is ts a s t w o i s o f o r m s , a a n d 月 ， a n d t h e y ， c o n s t i t u t i v e l y a c t i v e i n n e u ro n s . G S K一 3 p h a s b e e n
18、i d e n t i f i e d i n as s o c i a t i o n w i t h N F T s i n t h e A lz h e i m e r s d i s e a s e ( A D ) b r a i n 8 1 ， I n R e ce i v e d d a t e 2 0 0 5 一 1 2 一 0 8 A c c e p t e d 2 0 0 6 一 0 1 一 1 6 F o u n d a t i o n it e m S u p p o rt e d p a rt ia ll y b y g r a n ts f r o m t h e N
19、 a t io n al N a tu r a l S c ie n c e F o u n d a t io n o f C h i n a ( 3 0 4 0 0 1 0 3 , 3 0 4 3 0 2 7 0 , 3 0 4 7 2 0 3 0 a n d 3 0 4 0 0 0 6 8 ) ， th e N a t io n a l S c i e n c e a n d T e c h n o l o g y C o m m itt e e o f C h i n a ( 2 0 0 6 C B 5 0 0 7 0 3 a n d G 1 9 9 9 0 5 4 0 0 7 ) .
20、,L C o r re s p o n d i n g a u t h o r T e l : 0 8 6 一 2 7 一 8 3 6 9 一 2 6 2 5 ; F a x : 0 8 6 一 2 7 一 8 3 6 9 一 3 8 8 3 ; E 一 m a i l : w a n g j z m a i l s . t j m u . e d u . c n 5 0 7 w o r k h a s s h o w n t h a t G S K一 3 俘 p h o s p h o ry l a t e s t a u a t m u l t i - p l e s i t e s ,
21、a n d s o m e o f t h e s e s i t e s a r e a b n o r m a l l y p h o s p h o - ry l a te d i n n e u ro d e g e n e r a t iv e d i s e a s e 9 1 . I n t h e p r e s e n t s t u d y , G S K 一 3 俘 p l a s m i d w a s d i r e c t l y t r a n s f e c t e d i n t o r a t s c e r e b r u m t o f u r t h
22、e r t e s t t h e e f f e c t o f G S K 一 3 俘o n t a u p h o s p h o ry l a t i o n i n v i v o . W e o b e r s e v e d t h a t a f t e r t r a n s f e c t i o n f o r 4 8 h , G S K一 3 俘 w a s e x p r e s s e d i n G S K一3 归t r a n s f e c t i o n g ro u p a n d h y p e r p h o s p h o ry l a t e d
23、t a u a t P H F一1 s i t e s a c c u mu l a t e d i n n e u ron s i n t h e t r a n s f e c t e d a re a s . M e a n w h i l e , t h e h y p e r p h o s p h o ry l a t e d t a u c o l o c a l i z e d l a r g e l y w i t h G S K 一 3 P e x p r e s s i o n in d u c e d b y t h e t r a n s f e c t - e d
24、G S K一 3 (3 p l a s m i d . AND MET HODS t ro p h o r e s i s ( P A G E ) a n d th e b a n d s o f p ro t e in w e re t r a n s - f e r re d t o n i t r o c e l l u l o s e m e m b r a n e s . T h e p ro t e i n b a n d s w e r e p ro b e d w i t h p r im a ry a n t ib o d i e s : R a b b i t p o l
25、y c l o n a l a n t i b o d y R 1 3 4 d( 1 : 3 0 0 0 0 ， re c o g n i z in g t o t a l ta u , g i f t f ro m D r s . I g b a l s , N e w Y o r k S t a t e I n s t i t u t e f o r b a s i c r e s e a r c h , S t a t e n I s l a n d , N Y ， U S A ) o r m o n o c l o n a l P H F 一1( 1 : 5 0 0 , r e c -
26、 o g n i z i n g p h o s p h o ry l a t e d t a u a t S e r 3 9 6 / 4 0 4 , g i f t f ro m D r . P D a v i e s , A l b e r t E i n s t e i n C o l l e g e o f M e d i c i n e , B ro n x , N Y , U S A )o r R a b b it p o l y c l o n a l a n t ib o d y G S K一3 (3 ( 1 : 1 0 0 0 ， C e l l S i g n a l in
27、 g ) o r R a b b i t p o l y c l o n a l a n t i b o 街 p h o s p h o 一 G S K 一 3 (3 ( S e r 9 ) ( 1 : 1 0 0 0 ， i n a c t i v a t i n g G S K 一 3 f3 , C e l l S ig n a l i n g ) ， a n d v i s u a l i z e d b y u s i n g C h e m il u - m i n e s c e n t S u b s t r a t e K i t a n d C L 一 X P o s u r
28、 e F i l m . T h e p ro - te i n b a n d s w e r e q u a n t i t a t i v e l y a n a ly z e d b y K o d a k D ig it a l 1 S u 嗜c a l p r o c e d u r e s f o r t r a n s f e c t i o n o f G S K一 3 p S c ie n c e I D s o f t w a r e ( E as t m a n K o d a k C o m p a n y ) ， a n d t h e i n t o r a t
29、c e r e b r a l c o r t e x mo u n t o f p ro t e i n b a n d s w a s e x p r e s s e d as s u m a b s o r b a n c e 2 1 m a t u re S D r a t s ( 2 5 0 一 2 8 0 g ) w e re u s e d . T h e y v a l u e . w e re r a n d o m ly a l l o c a t e d t o t h re e g r o u p s as f o l l o w s : G S K 一3 I m m
30、u n o h i s t o c h e m is t r y 3 P t r a n s f e c t i o n g r o u p , v e c t o r g r o u p a n d c o n t ro l g r o u p , 7 A f t e r t r a n s f e c t e d w i t h G S K一 3 (3 一 H A p l a s n u d o r v e c - r a t s f o r e a c h g ro u p . T h e S u r g i c a l p r o c e d u r e w as c a r r i
31、e d o u t f o r f o r 4 8 h , t h e r a t s w e r e d e e p l y a n e s t h e t i z e d a n d p e r - a c c o r d i n g t o t h e w e l l e s t a b l i s h e d m e t h o d i n o u r l a b o r a t o - f u s e d t h r o u g h a r t e r i a e a o r t a w i t h 1 0 0 m l , o f n o r m a l s a l i n e ,
32、r , 10 7 . 1 4 r a t s w e r e f ir s tly a n e s th e t iz e d b y c h lo r a l h y d r a te a n d p e r fu s e d w ith 4 0 0 m l, P B s o lu t io n c o n ta in in g 4 % ( 3 0 m g / k g , 1 p ) a n d p l a c e d o n a s t e re o t a c t i c i n s t r u m e n t p a r a f o n n a l d e h y d e . T h
33、e b r a i n w as re m o v e d a n d p o s t f i x e d i n w i t h t h e i n c i s o r b a r s e t 2 n u n b e l o w t h e e a r b a r s ( i . e . fl a t t h e s a m e 4 % p a r a f o n n a l d e h y d e s o l u t i o n f o r 1 2 h b e f o re it s k u l l ) . A 1 0 p .L s y r i n g e ( H a m i l t o
34、n ) w as s t e r e o t a c t ic a l ly w as c o ro n a r i ly s l i c e d i n t o 4 0 fun s e c t i o n s w i t h f re e z i n g m i - p l a c e d i n t o t h e c e r e b r u m a t th e c o o r d in a t e s f ro m b re g m a c ro t o m e ( C M 1 9 0 0 , L E I C A ) ， F r e e fl o a t i n g s e c t i
35、 o n s w e r e a n d d u r a o f A P 一 4 , M L 一2 , D V一 2( i n m m ) a f t e r t h e i n c u b a t e d w i t h 1 % B S A i n 0 . 0 1 m o l / L P B S t o b l o c k n o n s c a l p w as i n c i s e d a n d re t r a c t e d . T h e n ， 0 . 1 p g G S K一 3 P一 s p e c i f i c s i t e s f o r 3 0 m i n a
36、n d c e l l u l a r m e m b e r s w e r e r u p - 一 H A p l as m i d ( H A i s t h e m a r k e r o f G S K 一 3 (3 w h i c h e x - t u re d w i t h 0 . 3 % T r i t o n X一 1 0 0 i n 0 . 0 1 m o l / L P B S f o r p r e s s e s a s m a l l m o l e c u l e w i t h o u t c h a n g i n g t h e s t r u c t
37、u r e 2 0 m i n a t 3 7. S e c t io n s w e r e t h e n i n c u b a t e d o v e r n i g h t a n d a c t i v i t y o f G S K一 3 P , a n d c a n b e r e c o g n i z e d b y u s i n g a t ro o m t e m p e r a t u r e w i t h m o n o c l o n a l a n t i 一 H A一 T a g a n t i - t h e s p e c ifi c a n t i
38、 b o d y .T h i s p l as m id i s a g if t f ro m J R b o d y ( 1 : 1 0 0 , c o m b i n i n g w i t h G S K 一 3 (3 一 H A ) . A n d t h e W o o d g e t t o f U n i v e r s i ty o f T o ro n t o , C a n a d a ) o r v e c to r in 1 i m m u n o r e a c t i o n w as v i s u a l i z e d b y u s in g O r e
39、 g o n G r e e n 4 8 8 t, L O p t i 一M E M a n d 2 L l ip o f e c t a n r i n e 2 0 0 0( I n v it ro - 一 c o n j u g a t e d g o a t a n t i 一 m o u s e I g G( H+ L ) ( 1 : 1 0 0 0 , g e m ) / ( 如 t i 一 M E M ( 5 Ii L / 9 5 I L L ) i n a t o t a l v o lu m e o f 3 M o l e c u l a r p ro b e )f o r 2
40、 h . A f t e r b e i n g w a s h e d w i t h p .L w as i n j e c t e d b i l a t e r a ll y i n t o c e re b r u m o f t h e r a t s . R a t s 0 . 0 1 m o l / L P B S f o r 5 t i m e s , t h e s e c t i o n s w e r e i n c u b a t e d w i t h o u t in j e c t i o n w e re c o n tr o l s . A l l s u
41、r g ic a l p r o c e d u r e s w it h m o n o c l o n a l P H F 一 1 ( 1 : 3 0 0 , re c o g n i z in g p h o s p h o ry - w e re p e r f o r m e d u n d e r s t e r i l e c o n d i t i o n s a n d p e n i c il l i n l a t e d t a u a t S e r 3 9 6 / 4 0 4 ， a g i f t f ro m D r . P D a v i e s , A l
42、b e r t ( 2 0 0 0 0 0 U ， im ) w a s in j e c t e d t o p re v e n t in f e c t i o n . E in s t e i n M e d ic a l S c h o o l ) o v e r n i g h t a t r o o m t e m p e r a t u r e . 2 We s t e r n b l o t t i n g T h e i m m u n o r e a c t i o n w a s v i s u a l i z e d w i t h R h o d a m i n e
43、 R e d 一 T h e c e re b r u m t i s s u e a ro u n d th e i n j e c t io n h o l e w i t h X g o a t a n t i 一 m o u s e I g G( H+ L )( 1 : 1 0 0 0 , M o l e c u l a r d i a m e t e r 2 m m w as h o m o g e n a t e d 4 8 h a f t e r t r a n s f e c t i o n . p ro b e ) f o r 2 h . T h e im a g e s w
44、 e re p h o t o g r a p h e d b y C o n f o c a l W e s t e rn b l o t t in g w a s p e r f o r m e d a c c o r d i n g t o t h e w e l l 一 e s - m i c r o s c o p y ( O l y m p u s F V 5 0 0 ) . ta b lis h e d m e th o d in o u r l a b o r a to ry 3 ,4 1 . B r ie fl y , t h e s a m - 4 S ta t is t
45、ic a l a n a ly s is P i e s w e r e s e p a r a t e d饰 S D S一p o l y a c r y l a m i d e g e l e l e c - D a t a w e re e x p re s s e d x*a n d a n a l y z e d u s i n g S P S S 5 0 8 。 1 0 . 0 s t a t i s t i c a l s o f t w a r e . T h e O n e 一 W a y A N O V A p r o c e d u re f o l l o w e d 场
46、L S D s p o s t h o c t e s t s w a s u s e d t o d e t e r m i n e th e s t a t i s t i c a l d i ff e re n c e s o f t h e v a l u e s b e t w e e n g ro u p s . 1 T r a n s f e c t i o n w i t h G S K一3 p 一H A i n cer e b r a l c o r - t e x o f r a t s A f t e r tr a n s f e c t i o n w i t h v
47、e c t o r o r G S K一 3 R 一 H A f o r 4 8 h , w e c h e c k e d t h e e x p r e s s i o n o f G S K一 3 月 i n t h e t h re e g ro u p s . T h e re s u l t s h o w e d t h a t t h e e x p re s s i o n o f G S K 一 3 俘 i n G S K一 3 日g ro u p w a s e n h a n c e d( F i g l a , P 0 . 0 5 ) . U s i n g R a
48、b b i t p o l y c l o n a l a n t i b o d y p h o s p h 。 一 G S K一 3 日 t o i - d e n t i f y i n a c t i v e G S K 一 3 (3 , w e f o u n d t h a t t h e e x p re s s i o n o f P 一 G S K 一 3 p in t h r e e g r o u p s w e re v e ry l o w . T h e re w a s n o o b v io u s d iff e re n c e a m o n g t h
49、 e m( F i g 1 b ) . T h e s e f i n d i n g s s u g g e s t e d t h a t e x o g e n o u s G S K一3 日 一H A w a s e x p re s s e d a n d a c t i v e i n G S K 一 3 p t r a n s f e c t i o n g ro u p . 2 T r a n s f e c t i o n w i t h G S K一 3 P 一 H A i n r a ts c e r e b r a l c o r t e x i n d u ce s t a u p r o t e i n h y p e r p h o s p h o r y l a t i o n a t P i n， 一1 s i t e s T h e i m m u n o r e a c t i o n o f p h o s p h o ry l a t e d t a u w as s t ro n g e r a