宏基因组克隆微生物活性物质筛选的新途径.pdf

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1、2 0 0 5 年3 2( 1 )微 生 物学 通 报 1 1 3 宏基因组克隆微生物活性物质筛选的新途径* 阎 冰 , 2洪 葵 ， 许 云 ，马 超 ( 中国 热 带 农业科学院 热带生物 技术 研究所 热带作物 生物技术国 家 重点实验 室 海口 5 7 1 1 0 1 ) ( 广西红树林研究中 心 北海 5 3 6 0 0 0 ) 2 摘要: 在现有技术条件下自 然界存在的微生物9 5 %以上未能培养， 采用传统的分离培养筛 选的 途径寻找新的微生物生物活性物质受到局限; 宏基因组是特定小生境中全部微小生物 遗传物质的总和， 直接抽提环境样品中的总D N A ， 利用适宜的载体克隆到替

2、代宿主细胞中 构建宏基因组文库， 通过外源基因赋予宿主细胞的新性状或基于某些已知D N A序列筛选， 寻找新的生物活性物质或基因， 极大地扩展了微生物资源的利用空间， 增加了获得新的生 物活性物质的机会。 关键词: 宏基因组， 环境总D N A ， 功能驱动筛选， 序列驱动筛选 中图分类号: Q 9 3文献标识码: A文章编号: 0 2 5 3 - 2 6 5 4 ( 2 0 0 5 ) 0 1 -0 1 1 3 -0 5 Me t a g e n o m e C l o n i n g -A N e w A p p r o a c h f o r N o v e l Mi c r o b i

3、 a l B i o a c t i v e C o mp o u n d s D i s c o v e r y Y A N B i n g t ,Z H O N G K u i t X U Y u n t M A C h a o t ( I n s t i t u t e o f T r o p ic a l B io l o g i c a l S c ie n c e s , C h i n e s e A c a d e m y of T r o p i c a l A g r i c u l t u r a l S c ie n c e , S t a t e K e y L a

4、b f o r T r o p i c a l C r o p s B i o t e c h n o lo g y ， H a i k o u 5 7 1 1 0 1 ) t ( G u a n g x i M a n g r o v e R e s e a r c h C e n t e r , B e i h a i 5 3 6 0 0 0 ) 2 A b s t r a c t : I t i s r e p o rt e d t h a t m o r e t h a n 9 5 % m i c r o b e s p e c i e s n o n - c u l t u r e

5、d o r u n - c u l t u re d y e t i n n o w d a y s b y t h e t r a d i t i o n a l c u l t i v a t i o n a p p r o a c h , w h i c h l i m i t s d i s c o v e r i n g n o v e l b i o a c t i v e c o m p o u n d s f ro m m i c r o o r g a n i s m s . M e t - a g e n o m e i s t h e g e n o m e s o f

6、t h e t o t a l m i c ro b i o t a f o u n d i n n a t u r e . M e t a g e n o m e l i b r a r i e s w e re c o n s t r u c t e d b y d ir e c t - l y e x t r a c t i n g D N A f r o m e n v i ro n m e n t a l s a m p l e a n d t r a n s f o r m i n g t o s u r r o g a t e h o s t . T h e l i b r a

7、r i e s w e r e s c re e n e d f o r n o v e l b i o a c t i v e c o m p o u n d s o r g e n e s s u r ro u n d i n g t h e i r s y n t h a s e i n d i ff e re n t s t r a t e g i e s o f f u n c t io n - d r i v e n o r s e - q u e n c e - d r i v e n . T h e s e h a v e e n o r m o u s l y a m p l

8、 i f i e d t h e s p a c e o f m i c ro b i a l r e s o u r c e u t i li z a t i o n a n d e n h a n c e d t h e o p - p o r t u n i t y o f o b t a i n n o v e l b i o a c t i v e c o m p o u n d s . K e y w o r d s : M e t a g e n o m e , E n v i r o n m e n t a l t o t a l D N A, F u n c t i o n

9、- d r i v e n s c r e e n i n g , S e q u e n c e - d r i v e n s c r e e n i n g 微生物活性物质筛选传统方法的基础是微生物分离， 获得纯培养，其研究流程包 括微生物分离纯化、大量培养、活性检测、活性物质的分离纯化直至开发利用。这一 途径被证明是行之有效的， 沿着这一途径找到了许多活性物质， 但重复发现率特别高。 分子微生物生态学研究表明环境中大量存在未能培养的微生物，据估计每克土壤样品 中可含有高达4 , 0 0 0 种的不同微生物， 某些环境中采用现有培养技术能够培养的微生 物不到1 %。最近，一个全新的理念“

10、 宏基因组克隆” :直接提取特定环境中的总 ， 国家 “ 8 6 3 ”海洋生物技术青年基金项目 资助 ( N o . 2 0 0 2 A A 6 2 8 1 4 0 ) 海南省普通高校优秀中青年教师科研和教学奖励基金资助 * . 联系人E - m a i l : k l 0 2 2 1 6 3 . n e t 收稿日 期: 2 0 0 4 -0 4 - 1 5 , 修回日 期: 2 0 0 4 -0 5 - 3 1 万方数据 1 1 4 微 生 物 学 通 报2 0 0 5 年3 2( 1 ) D N A ， 克隆到可培养的宿主细胞中， 从所获得的重组克隆子中筛选活性物质和相关基 因， 显示

11、了其在挖掘和利用那些未能培养微生物的基因资源筛选新生物活性物质的潜 力。 1 宏基因组及其研究流程 “ M e t a g e n o m e ”是由H a n d e l s m a n 等1 9 9 8 年提出的 新名词， 其定义为 “ t h e g e n o m e s o f t h e t o t a l m i c r o b io t a f o u n d i n n a t u r e “ I 即 生境中全部微小生物遗传物质的总和，国内 学 者 将 其 翻 译 为“ 宏 基因 组 ” ， 文 献中 常 见 的“ c o ll e c t iv e g e n o m e

12、“ , “ e n v ir o n m e n t a l g e - n o m e ”等， 现已普便采用 “ M e t a g e n o m e “ ， 且主要指环境样品中的细菌和真菌的基因组 总和。宏基因组文库既包含了可培养的又包含了未可培养的微生物基因， 避开了微生 物分离培养的问 题， 极大地扩展了微生物资源的利用空间， 增加了获得新的生物活性 物质的机会。图1 对采用宏基因组克隆策略与传统培养途径筛选活性物质的研究流程 进行了简略比较。 图1 采用传统培养途径和宏基因组途径筛选新的微生物活性物质研究流程的简略比较 宏基因组克隆筛选生物活性物质研究概况 1 9 9 1 年P a

13、 c e 等在研究海洋微小浮游生物时， 直接提取浮游生物群体的总D N A经 酶切后通过x 噬菌体载体克隆到大肠杆菌中构建了e D N A文库， 并从中筛选到了r R N A 基因， 展示了 从环境中克隆任何生物体基因的可能性。采用宏基因组克隆最先筛选到 的生物活性物质是具有抗菌活性的五种新的小分子物质T e r r a g i n e A , B , C , D , E ，由 万方数据 2 0 0 5 年3 2( 1 )微 生 物 学 通 报 加 拿 大T e r r a G e n D i s c o v e ry公司 从以 链 霉 菌为 宿主的 宏 基因 组文 库中 筛选到 。 德国 哥

14、 廷根大学的D a n i e l R . 实验室从土壤样品直接提取D N A ， 利用表达载体p S K + 转化到大 肠杆菌中成功构建了宏基因组文库， 用4 - 基丁酸作唯一的碳源和能源筛选到了5 个 能够稳定利用4 - 基丁酸的克隆子，随后的研究中先后获得了新的生物素合成操纵子、 脂 ( 醋)酶、 琼脂糖酶、 乙 醇 脱 氢酶、 甘油脱水酶等， 一 。由 于细菌合成某些活性物 质的基因经常以基因簇的形式出现， 美国威斯康星大学的H a n d e l s m a n 实验室利用细菌 人工染色体载体p B e l o B A C II 构建了两个土壤样品的 宏基因组B A C 文库， 筛选

15、出了一个 分泌脱氧核糖核酸酶、1 个有抗菌活性、 2 个分泌醋酶、8 个分泌淀粉酶、 2 9 个有溶血 活性的克隆子， 随后对1 个棕色重组克隆子进行了亚克隆研究，获得了2 个具有广谱 抗菌 作用的 新 抗 生素T u r b o m y c in A 和B 及 其 合 成酶 基因 簇1 8 , 9 。 美国 康 乃 尔 大 学的B a k - e r 实验室采用C o m s i d 载体构建宏基因组文库， 筛选到了紫色菌素和脱氧紫色菌素、 长 链一 N - 酞基氨基酸抗菌化合物及其合成酶基因簇、 长链一 酞基脂肪酸苯酚及其合成酶基因 簇 “ 。 此 外， C o u r ti s 1 1

16、和P i e 等 分 别从土 壤和甲 虫宏基因 组文库中 获得了 新的 抗肿瘤 活性物质聚 酮的 合成酶 基因 簇， D i a z T o r r e s 12 采 用人唾液、 C o t t r e l l “ 采用海水构建宏基 因组文库分别筛选到了 新的几丁质酶和四环素抗性基因等等。目 前已采用土壤、 海水、 海洋浮游生物、 海绵、甲虫、 人唾液等环境样品成功构建了宏基因组文库，已筛选到 脂酶/ 醋酶、蛋白酶、淀粉酶、氧化酶、几丁质酶、核酸酶、膜蛋白、 4 - 经基丁酸代谢 酶系、 生物素合成酶系、 色素、 抗菌抗肿瘤活性物质及抗生素抗性基因等 ( 表1 ) 。 表 1 D N A来源载

17、体 几个已构建的宏基因组文库特点及其筛选到的活性克隆 克隆子数插人片段大小宿主活性类型 2 4 , 5 7 6 ,4 0 k b 3 0一 4 0 k b 3 . 0 - 5 . 6 k b 2 5 - 4 0 k b 5 -8 k b 参考文献 8 , 9 000溯532 354001 土壤 土壤 土壤 土壤 土壤 土壤 土壤 人唾液 海水 p B e l o B A C II p WE 1 5 p S K十 p WE 1 5 p B l u e s c ri p t S K S u p e r C o s I 9 3 0 , 0 0 0 T O P O- X L A - Z a p II

18、0 . 8一3 . O k b 1 . 8 - 6 . l k b 大肠杆菌核酸酶、淀粉酶、抗菌 大肠杆菌生物素合成酶 大肠杆菌乙醇氧化还原酶 大肠杆菌淀粉酶、 琼脂糖酶、酞胺酶 大肠杆菌4 - 羚基丁酸代谢酶系 大肠杆菌抗菌 链霉菌抗菌 大肠杆菌四环素抗性 大肠杆菌几丁质酶 1 4 1 3 000020450000 00，-25， 3 宏基因组文库的构建 宏基因组文库的构建沿用了分子克隆的基本原理和技术方法， 并根据具体环境样 品的特点和建库目的采用了一些特殊的步骤和对策。 3 . 1 土壤样品总D N A的提取获得高质量土壤样品中的总D N A是宏基因组文库构建 的关键之一。既要尽可能地完

19、全抽提出样品中的D N A ， 又要保持其较大的片段以获得 完整的目 的基因或基因 簇， 另外土壤中存在腐殖酸类物质强烈抑制分子克隆操作过程 中多种酶的活性，须尽量除去。提取方案大致上可以分为两类，一类是原位裂解法， 将土壤样品直接悬浮在裂解缓冲液中处理， 继而抽提纯化， 此法操作容易、成本低、 D N A提取率高、 偏差小， 但由于强烈的机械剪切作用， 所提取的D N A片段较小 ( 1 - 5 0 k b ) ， 且腐殖酸类物质也难以完全去除; 另一类是异位裂解法， 先采用物理方法将微 万方数据 微 生 物 学 通 报2 0 0 5 年3 2( 1 ) 生物细胞从土壤中分离出来， 然后采用

20、较温和的方法抽提D N A ，如先采用尼可登介质 密度梯度离心分离微生物细胞， 然后包埋在低熔点琼脂糖中裂解， 脉冲场凝胶电泳回 收D N A 。此法可获得大片段D N A ( 2 0 一 5 0 0 k b )且纯度高， 但操作繁琐， 成本高，有 些微生物在分离过程中可能丢失， 温和条件下一些细胞壁较厚的微生物D N A抽提不出 来。徐 平等采用了 用微波法快速提取放线菌基因 组D N A ， 该法曾被O r s i n i 用于土壤细 菌基因 组D N A的 提取 is 。 3 . 2 载体载体的选择主要是针对有利于感兴趣的目 标基因的扩增、表达及在筛选细 胞毒类物质时表达量的调控等。 很

21、多微生物活性物质是其次生代谢产物， 代谢途径由 多基因簇调控， 尽量插人大片段 D N A以获得完整的代谢途径多基因簇是很有必要的。 目 前多采用细菌人工染色体 ( B A C )和粘粒 ( C o s m i d )载体， 前者插人片段大 ( 可达 3 5 0 k b ) ， 但克隆效率低， 后者插入片段中等 ( 2 0 一 4 0 k b ) ， 克隆效率高。B A C 和C o s - m i d 载体在宿主细胞中的稳定性高， 但拷贝数低， 宏基因的扩增困难， 表达量低。为了 提高宏基因的表达便于重组克隆子活性检测， 有研究者直接利用表达载体构建宏基因 组文库。表达载体可插人的宏基因片段

22、一般小于1 0 k b ， 适合于筛选单一基因或小的操 纵子产物。 外源基因的表达受宿主细胞的遗传类型、细胞基质、 细胞的生理状态及初 级代谢产物等的 影响， 利用穿梭载体扩大宿主范围有利于促使和提高外源基因的表达。 为提高和调控外源基因的拷贝数与表达量， 常需构建不同类型的载体， 如H a n d e l s m a n 实验室构建的s u p e r B A C - X 载体系 列， 以p B e l o B A C 1 1 为骨架， 添加各种复制原点， 调控 其拷贝 数及宿主范围， 利于 外源 基因的表达 及调 控其表 达量t ， 。 3 . 3 宿主宿主菌株的选择主要考虑转化效率、 重

23、组载体在宿主细胞中的稳定性、 宏 基因的表达、目 标性状 ( 如抗菌)缺陷型等。研究经验表明不同微生物种类所产生的 活性物质类型有明显差异， 不同的研究目 标应选择不同的宿主菌株，如7 0 %的抗生素 来源于放线菌， 如以寻找抗菌抗肿瘤活性物质为目 标， 选择链霉菌为宿主较理想，而 筛选新的酶则采用大肠杆菌为宜。 4 宏基因组文库的筛选 由于环境样品中微生物种类繁多， 宏基因组文库容量一般较大， 活性克隆子的筛 选是新活性物质筛选的瓶颈，根据研究目的， 可从生物活性水平、化合物结构水平以及 D N A 序列水平设计不同的 筛选方案。 4 . 1 生物活性水平的筛选 又称为功能驱动筛选 ( f

24、u n c t i o n - d r i v e n s c r e e n i n g ) ， 根据重组 克隆产生的新活性进行筛选。采用各种活性检测手段检测挑选活性克隆子， 进而对其 深人研究。如在各种选择性平板上通过可见性状筛选到了产生脂酶、淀粉酶、七叶昔 水 解酶、 甘 油 脱 水酶 及 抗菌活 性的 克隆 子 ， “ ， 。 这一策略以 生物活 性为 线索能 够 发现 全新的活性物质或基因，能够快速鉴别有开发潜力的克隆子， 但工作量大， 效率低， 并且受检测手段的局限。 4 . 2 化合物结构水平的筛选在一定条件下不同结构的物质在色谱中有不同的峰值， 通过比 较转人和未转人外源基因的

25、宿主细胞或发酵液抽提物的色谱图筛选产生新结构 化合物的克隆子。如W a n g ( 2 0 0 1 )等通过对重组克隆子的细胞抽提物与对照宿主细胞 万方数据 2 0 0 5 年3 2( 1 )微 生 物 学 通 报 1 1 7 抽提物的高压液相色谱图谱进行比较，发现了2 个产生新结构化合物的克隆，获得了 五 种全新的 小分子抗菌化合物 。 这一策略 可直接筛选到 新结构化合物， 但不一定有生 物活性， 且工作量大， 成本高。 4 . 3 D N A序列水平的筛选 又称为序列驱动筛选 ( s e q u e n c e - d r i v e n s c r e e n i n g ) ， 根据

26、已 知相关功能基因的序列设计探针或P C R引物，通过杂交或P C R扩增筛选阳性克隆子。 如K n i e t s c h ( 2 0 0 3 )等根据所有已知脱水酶基因的保守序列设计了一对简并P C R引物 对宏基因组D N A扩增， 扩增产物制作探针与宏基因组文库进行杂交， 筛到两个高甘油 脱 水酶 和1 ， 3 一 丙二 醇 脱 水酶 活 性的 克隆 子， 有 望开 发 应用于工 业生产 7 1 。 这一 策略 有 可能筛选到某一类物质中的新分子， 而且基于D N A的操作有可能利用基因芯片技术大 大提高筛选效率， 但必须对相关基因序列有一定的了解， 较难发现全新的活性物质。 5 结语

27、 微生物蕴藏着巨大的基因多样性资源， 采用传统的培养途径筛选微生物活性物质 虽然有效但受培养技术的限制。宏基因组克隆充分利用了生物学和生物技术手段， 使 人们有可能挖掘和利用占微生物种类9 9 %以上的传统途径触及不到资源。虽然分子克 隆技术已足以完成宏基因组文库的构建及筛选， 且已筛选到了一些新的生物活性物质， 但宏基因在宿主细胞中不表达或表达量低、活性克隆子的频率极低等制约了它的实用 性。 研究者们正在探索构建新的载体、扩大宿主范围等提高宏基因的表达; 通过富集 特定类群的基因组提高目 标基因在文库中的频率， 如在拟采样环境中添加纤维素和稳 定同 位素3 C ， 与纤维素降 解有关的 微生

28、物代谢活跃， 13 C 就进人到相关的基因组中， 提 取带” C 标记的D N A片段建库有望获得较多的 纤维素降解活性克隆; 开发D N A芯片和 蛋白 质芯片提高筛选效率。相信随着技术的不断进步， 宏基因组克隆必将成为微生物 活性物质筛选的重要手段并发挥巨大作用。 参 考 文 献 1 H a n d e l s m a n J , R o n d o n M R , B r a d y S F , e t a l . C h e m B io l , 1 9 9 8 , 5 : 2 4 5 一 2 4 9 . 2 W a n g G Y , G r a z i a n i E , Wa t

29、 e r s B , e t a l . O r g L e t t , 2 0 0 0 , 2 : 2 4 0 1 一 2 4 0 4 3 H e n n e A , D a n i e l R , S c h m i t z R A , e t a l . A p p l E n v iro n M i c ro b io l , 1 9 9 9 , 6 5 : 3 9 0 1 一 3 9 0 7 . 4 E n t c h e v a P , L i e b l W, J o h a n n A , e t a l . A p p l E n v i ro n M i c ro b i

30、o l , 2 0 0 1 ， 6 7 : 8 9 一 9 9 . 5 V o g e t S , L e g g e w i e C , U e s b e c k A , e t a l . A p p l E n v i ro n M i c ro b i o l , 2 0 0 3 ， 6 9 : 6 2 3 5 一 6 2 4 2 . 6 K n i e t s c h A , W a s c h k o w i t z T , B o w i e n S , e t a l . A p p l E n v i ro n M i c ro b i o l , 2 0 0 3 ， 6

31、9 : 1 4 0 8 一 1 4 1 6 . 7 K n i e t s c h A , B o w i e n S , W h i t e d G , e t a l . A p p l E n v i ro n M i c ro b i o l , 2 0 0 3 , 6 9 : 3 0 4 8 一 3 0 6 0 . 8 R o n d o n M R , A u g u s t P R , B e t t e r m a n n A D , e t a l . A p p l E n v i ro n M i c ro b i o l , 2 0 0 0 , 6 6 : 2 5 4

32、1 一 2 5 4 7 9 G ill e s p i e D E , B r a d y S F , B e t t e r m a n n A D , e t a l . A p p l E n v i ro n M ic ro b i o l , 2 0 0 2 , 6 8 : 4 3 0 1 一 4 3 0 6 . 1 0 B r a d y S F , C h a o C J , C la r d y J . J A m C h e m S o c , 2 0 0 2 , 1 2 4 : 9 9 6 8 一 9 9 6 9 . 1 1 C o u r to i s S , C a p

33、 p e l l a n o C M , B a ll M, e t a l . A p p l E n v i r M ic ro b i o l , 2 0 0 3 ， 6 9 : 4 9 一 5 5 . 1 2 C o t t re ll M T , M o o r e J A , K i r c h m a n D L A p p l E n v i ro n M i c ro b io l , 1 9 9 9 , 6 5 : 2 5 5 3 一 2 5 5 7 . 1 3 D i a z - T o r r e s M L , M c N a b R , S p r a tt D A , e t a l . A n t i m i c ro b i a l A g e n t s a n d C h e m o t h e r a p y , 2 0 0 3 ， 4 7 ( 4 ) : 1 4 3 0- 1 4 3 2 . 1 4 徐 平， 李文均， 徐丽华，等. 微生物学通报， 2 0 0 3 , 4 : 8 4 - 8 5 1 5 W r e n B , D o r r e ll N . M e t h o d s i n M ic ro b i o l o g y , 2 0 0 3 ， 3 3 : 2 4 1 一 2 5 5 . 万方数据