大豆种子几丁质酶的诱导及对壳聚糖降解的研究.pdf

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1、第12卷第2期上 海 水 产 大 学 学 报Vol.12 , No.2 2003年06月JOURNAL OF SHANGHAI FISHERIES UNIVERSITYJune ,2003 文章编号: 1004 - 7271(2003)02 - 0152 - 06 大豆种子几丁质酶的诱导 及对壳聚糖降解的研究 收稿日期:2002211205 作者简介:赵光远,(1973 - ) ,男,河南泌阳人,在读博士生,研究方向为食品生物技术。E2mail :guangyuan2zhao 赵光远,陈海华 (江南大学食品学院,江苏 无锡 214036) 摘 要:大豆种子经甲壳低聚糖处理后发芽,其体内的几丁

2、质酶活力比发芽前提高了46倍,比发芽的大豆提 高了1.3倍。大豆种子经甲壳低聚糖处理后发芽的提取物作用于DD值为71. 1 %的壳聚糖15min ,可使其乙 酸盐溶液的VDP值达60 %以上。初步纯化的大豆几丁质酶可降解壳聚糖释放还原糖且较适合降解DD值低 的壳聚糖,其作用于DD值71.1 %的壳聚糖37.5h可得到平均聚合度为425的水溶性甲壳低聚糖,得率为40 % 左右。 关键词:大豆种子;几丁质酶;发芽;壳聚糖 中图分类号:TS201.2 文献标识码: A Study on the induction of soybean chitinase and the application of

3、 chitinase to the depolymerization of chitosan ZHAO Guang2yuan , CHEN Hai2hua ( College of Food Science, Southern Yangtze University , Wuxi 214036, China) Abstract :The activity of chitinase in soybean increased by 46 times after being germinated which had been treated by chitooligosaccharide than b

4、efore being germinated , and increased by 1. 3 times than germinated which was untreated by chitooligosaccharide. After the abstraction of germinated soybean which treated by chitooligosaccharide acted with chitosan of DD 71.1 %for 15 minutes , it can raise the VDP of acetate salt solution to more t

5、han 60 %. Soybean of primary purification can free reduced sugar and is easier to degrade chitosan whose DD is lower , and when it acted on chitosan of DD 71. 1 % for 37. 5 hours , it produced water2soluble chitosin whose average DP is 425 , and its yield is about 40 %. Key words :soybean;chitinase

6、;germinate ;chitosan 甲壳低聚糖克服了甲壳素和壳聚糖不溶于水的缺点,易吸收,有抗菌、 抗肿瘤和提高植物防御能力 等功能。近年来,与用不同脱乙酰度(degree of deacetylation DD)的壳聚糖为底物经酶降解制备甲壳低聚 糖相关的研究如酶的选育、 酶对壳聚糖降解的进程和产物物化参数、 酶降解反应器系统已成为热点,涉 及的酶有微生物来源的壳聚糖酶1、 微生物来源的几丁质酶2、 麦芽脂酶3、 溶菌酶4、 木瓜蛋白酶5、 纤维素酶和半纤维素酶6等。植物几丁质酶(chitinase) (EC3.2.1.14)广泛存在于高等植物中,分布于植 物的茎叶种子和愈伤组织中,并

7、可诱导产生,已从多种植物中提取出来并加以研究。几丁质酶分为内切 1995-2005 Tsinghua Tongfang Optical Disc Co., Ltd. All rights reserved. 酶和外切酶,已研究的多为几丁质内切酶且研究集中于其在植物受到病原菌及害虫侵袭时所起的防御 作用。由于几丁质的不溶性,研究者多用改性几丁质、 胶态几丁质(用浓酸处理得到)等作为酶的底物酶 解反应进程研究。研究表明,植物几丁质酶可切开以上底物中的GlcNAc - GlcNAc7。1984年Scott A. W 等8从未发芽的大豆中提取纯化出了内切几丁质酶,它可能存在同功酶。其平均分子量为316

8、00 ,最适 pH范围为3.34.0。Colantuoni.D等9从发芽的大豆中提取纯化出了几丁质酶。但他们都未研究几丁 质酶对壳聚糖的降解。 1 材料与方法 1. 1 主要试验材料 1. 1. 1 壳聚糖A、B 购自浙江玉环生化有限公司,脱乙酰度(DD)分别为71. 1 %和85. 2 %。将低脱乙酰度壳聚糖A在 85 90 用氢氧化钠处理5h ,静置过夜,再处理4h ,制得壳聚糖C(DD = 88. 5 %)。壳聚糖的纯化按文 献10 :壳聚糖用稀乙酸(2 %V/ V)配成1.52.0 %的溶液,过滤,加入1mol/L氢氧化钠调pH 7.5 ,放置 3h ,洗至中性,用异丙醇洗两次,减压干

9、燥。甲壳低聚糖按文献11自己制备:8g纯化的壳聚糖A加 100mL 5 %的双氧水,90 反应30min ,再用10 %氢氧化钠调至中性,过滤,滤液加3倍乙醇,过夜,离心, 用乙醇洗,减压干燥,制得甲壳低聚糖。 1. 1. 2 大豆(Glycine hispidaMax) 购自无锡青山农贸市场 1. 2 试验方法 1. 2. 1 几丁质酶的诱导 大豆用3 %次氯酸钠表面消毒,然后分以下四组处理 第一组:大豆90g浸泡2h ,不发芽。 第二组:大豆90g浸泡10h ,25 发芽3d。 第三组:大豆90g浸泡10h ,用制备的甲壳低聚糖的水溶液(1 %W/ V)50ml处理5min ,25 发芽3

10、 6d。 第四组:大豆90g浸泡10h ,用不同脱乙酰度的壳聚糖溶解于稀乙酸(1 %V/ V)或溶解于不同pH值 的乙酸钠缓冲液而得到的50mL溶液(1 %W/ V)处理5min ,在25 发芽3d。 1. 2. 2 粗酶液的制备 1.2.1中的大豆加300mL水和400mL的0. 1mol/L柠檬酸缓冲液(pH 4. 6) ,组织捣碎机匀浆,7200 r/ min离心20min ,上清液即为粗酶液。 1. 2. 3 几丁质酶的初步纯化 粗酶液100mL ,加39g硫酸铵(60 %饱和度 ) , 搅拌1h ,7200r/ min离心20min ,上清液对蒸馏水4 透 析2d ,定容至50mL

11、,作为液态初步纯化几丁质酶。 1. 2. 4 几丁质酶酶活测定 壳聚糖A溶于稀乙酸(1 %V/ V)配成1 %( W/ V)的壳聚糖溶液,用5 %碳酸氢钠溶液调pH值为3.8 , 以此壳聚糖溶液为底物12。取0.9mL壳聚糖A溶液加0. 1mL待测酶液,同时以0. 9mL壳聚糖A溶液 加0.1mL灭活酶液为对照,37 反应60min ,按文献13用DNS法测还原糖。定义1h产生1mol的还原 糖(以N2乙酰胺基葡萄糖计)所需酶量为一个单位U。 1. 2. 5 大豆几丁质酶对壳聚糖降解能力的表征 测还原糖产生量 壳聚糖的稀乙酸溶液加一定量的酶液,反应后用DNS法(以N -乙酰胺基葡萄 糖为标样)

12、测反应液中还原糖含量。 壳聚糖溶液粘度降低表征 壳聚糖A分别溶于稀乙酸(1 %V/ V)和乙酸钠缓冲液配成1 %(W/ V) 3512期 赵光远等:大豆种子几丁质酶的诱导及对壳聚糖降解的研究 1995-2005 Tsinghua Tongfang Optical Disc Co., Ltd. All rights reserved. 的溶液。分别取上述壳聚糖A溶液60mL加入旋转粘度计(同济大学机械仪器厂)中27 恒温后,加预 先27 恒温的3mL酶液,立即计时,27 反应15min ,用旋转粘度计测反应物各时间段粘度。对照以水 代替酶,其余条件相同。 粘度降低百分比(VDP) = (对照粘度

13、-反应物反应15min粘度/对照粘度)100 % 壳聚糖C溶于的稀乙酸(1 %V/ V)中配成1 %(W/ V)的溶液(用碳酸氢钠调pH 4. 5) ,取9. 5mL上述 溶液加入奥氏粘度计中37 恒温10min ,加0. 5mL预先恒温至37 的酶液,快速测定开始及每隔5min 时间段的流过时间(s)。以0.5mL水代替纯化的提取物,同样条件按文献14测其开始及每隔5min时 间段的流过时间。 粘度降低百分比(VDP) = (对照流过时间-反应物反应30min流过时间/对照流过时间)100 % 1. 2. 6 水可溶性甲壳低聚糖得率和平均聚和度的测定 大豆几丁质酶作用于壳聚糖后的酶解液加热使

14、酶失活,测其体积,计为T mL。取1mL用6mol/L盐 酸完全水解后用DNS法测还原糖(以胺基葡萄糖为标样 ) , 计为 C( mol/ mL)。 用5 %氢氧化钠溶液调酶解液pH值8.5 ,用滤纸过滤(目的在于去除热变性的酶和没被水解的壳聚 糖 ) , 滤液即为水可溶性甲壳低聚糖,测其体积,计为t mL ,其平均聚和度用端基分析法测定:取1mL滤 液测其还原糖含量,计为A2(mol / mL) (DNS法测,以N2乙酰胺基葡萄糖为标样 ) ; 另取1mL滤液完全水 解后DNS法测还原糖量(用胺基葡萄糖为标样 ) , 计为A1(mol / mL) ,则透过液中甲壳低聚糖平均聚合 度(DP)为

15、15 DP =A1/ A2(1) 甲壳低聚糖得率=A1t/ CT(2) 1. 2. 7 制备甲壳低聚糖 5g壳聚糖A溶于450mL的1 %(V/ V)乙酸中(用碳酸氢钠调pH 4. 0) ,加初步纯化酶43mL ,共反应 37.5h。 反应结束,共500mL ,按1.2.6中方法测定水可溶性甲壳低聚糖得率和平均聚合度。 2 结果与讨论 2. 1 大豆几丁质酶的诱导 2. 1. 1 不同诱导方法对大豆种子提取物中几丁质酶活力的影响 大豆经发芽、 甲壳低聚糖和壳聚糖处理后发芽,其提取物中几丁质酶活力见表1。 表1 不同状态大豆的提取物中几丁质酶活力 Tab.1 Chitinase activity

16、 in the extraction of soybean treated in different conditions 处理方法酶活(U/ mL) a 提取物b总酶活U 第一组(不处理)0.36230 第二组(发芽c)7.14544 第三组(甲壳低聚糖处理后发芽)16.810752 第四组(壳聚糖Ad处理后发芽)7.95056 a :定义每小时产生1mol的还原糖(以N -乙酰胺基葡萄糖计)所需酶量为一个单位U;b:提取物总体积为640mL ;c :发芽时间为3d; d:壳聚糖A溶液浓度(见实验部分) ,pH为4.2。 大豆不发芽,体内生理活动不旺盛,几丁质酶活力最低。大豆经甲壳低聚糖处理

17、后发芽,几丁质酶 活力最高,是不发芽大豆的47倍,比发芽大豆也提高了1.3倍。其次是大豆经壳聚糖A处理后发芽,其 几丁质酶活力为不发芽大豆的22倍,但只比发芽大豆提高了0.1倍。大豆发芽3d后,几丁质酶活力是 不发芽大豆的20倍。三种条件下提取物中几丁质酶对壳聚糖乙酸盐溶液粘度降低百分比(VDP)分别 为64.5 %、56.3 %、55.6 %(结果未列出)。可见酶活力大小与之对壳聚糖乙酸盐溶液粘度降低百分比 451上 海 水 产 大 学 学 报 12卷 1995-2005 Tsinghua Tongfang Optical Disc Co., Ltd. All rights reserved

18、. (VDP)相一致。则诱导强弱顺序为:甲壳低聚糖处理后发芽壳聚糖A处理后发芽未经处理而发芽, 但后二者的差别不显著。 2. 1. 2 诱导时间对大豆种子提取物中几丁质酶活力的影响 大豆种子经甲壳低聚糖处理后发芽,提取物中几丁质酶活力变化及其对壳聚糖乙酸盐溶液 (pH 3.9) 粘度降低百分比(VDP)见图1、 图2。 图1 大豆提取物中几丁质酶活力 随发芽时间的变化 Fig.1 The effect of germinating time on chitinase activity of soybeans 图2 大豆发芽时间(天)与其提取物酶降低 壳聚糖醋酸盐溶液粘度 Fig.2 The e

19、ffect of germinating time on VDP of chitosan soultion made by soybean chitinase 大豆经甲壳低聚糖处理后发芽第4天几丁质酶活力达最高值17. 2U/ mL(图1) ,其提取物对壳聚糖 乙酸盐溶液作用的VDP也达最高值64.1 %(图2) ,发芽超过4d ,酶活及酶提取物对壳聚糖乙酸盐溶液 作用的VDP都降低,大豆开始腐烂,所以诱导以34d为宜。另外,发芽温度高于30 豆子也易腐烂。 表2 壳聚糖脱乙酰度(DD)对诱导效果的影响 Tab.2 The effect of DD of chtosan used as ind

20、ucer on the activity of induced chitinase 诱导物 壳聚糖脱乙酰度DD( %) 对壳聚糖乙酸盐溶液 作用的VDP 壳聚糖A71.162.8 壳聚糖B85.261.9 壳聚糖C88.561.4 注:壳聚糖醋酸盐溶液的pH为3.84.0 2. 1. 3 壳聚糖脱乙酰度对诱导效果的影响 壳聚糖A、B和 C( 脱乙酰度DD分别为71. 1 %、 85.2 %和88.5 %)按实验1.2.1部分对大豆处理,诱 导后的大豆的提取物对壳聚糖乙酸盐溶液作用的 VDP以壳聚糖A的最高,为62. 8 % ,以壳聚糖C的 最低,为61.4 %(表 2) 。大豆的提取物对壳聚糖

21、乙 酸盐溶液作用的VDP可反映大豆中几丁质内切酶 活力的高低,由此知如用壳聚糖对大豆中几丁质内 切酶诱导,应选择脱乙酰度(DD)低的壳聚糖。 图3 壳聚糖诱导液的pH值对诱导效果的影响 Fig.3 The effect of pH chtosan on the activity of chitinase induced 2.1.4 pH值对诱导效果的影响 壳聚糖A分别溶解于pH值为4. 0、5. 0、6. 0和 7.0( 用水代替缓冲液)的缓冲液制成1 %(W/ V)的 诱导液,各用50mL此溶液处理大豆5min ,大豆在 25 发芽3d ,诱导后的大豆制得的几丁质粗酶液 3mL对60mL壳聚

22、糖A的乙酸盐溶液作用的VDP(用 旋转粘度计测得)以诱导液pH为5.0和6. 0的较高 (分别为64. 2 %和64. 0 %) ,而7. 0最低(55. 6 %) (图 3) 。pH值过低,不利于大豆发芽,体内生理活动 受抑制,几丁质内切酶合成量低。当pH为7.0时壳 聚糖不溶于水,故诱导效果较差。 5512期 赵光远等:大豆种子几丁质酶的诱导及对壳聚糖降解的研究 1995-2005 Tsinghua Tongfang Optical Disc Co., Ltd. All rights reserved. 2. 2 初步纯化的几丁质酶对壳聚糖的降解作用 2. 2. 1 pH值对初步纯化几丁质

23、酶活力的影响 由表3结果知初步纯化几丁质酶在pH 4.0的活力大于在pH 4.5的。 表3 pH值对初步纯化几丁质酶活力的影响 Tab.3 The effect of pH value on the activity of chitinase primarily purified 初步纯化几丁质酶来源 酶活U/ mL pH 4.0pH 4.5 未处理直接发芽的大豆0.540.24 甲壳低聚糖诱导的大豆0.860.54 壳聚糖诱导的大豆0.720.22 注:酶活测定底物为脱乙酰度88.5 %的壳聚糖C,其余条件同实验部分 2. 2. 2 初步纯化几丁质酶降低壳聚糖乙酸盐溶液粘度 对壳聚糖降解能力

24、强的初步纯化几丁质酶来自经过诱导的大豆,由未发芽大豆制备的几丁质粗酶 与经过诱导的大豆制备的几丁质粗酶对壳聚糖C乙酸盐溶液的VDP相差1.6倍(见表 4) 。 表4 初步纯化几丁质酶对壳聚糖醋酸盐溶液的VDP Tab.4 The effect of chitinase activity on the VDP of chitosan acetate solution 初步纯化几丁质酶来源 壳聚糖醋酸盐溶液粘度(流动时间表征) 降低百分率VDP 未发芽大豆16.0 % 未处理直接发芽的大豆25.0 % 甲壳低聚糖诱导的大豆25.6 % 壳聚糖诱导的大豆24.9 % 注:测试条件见1.2.5 图4

25、壳聚糖醋酸盐溶液粘度随时间变化的曲线 Fig.4 The effect of reaction time on the viscostiy of chitosan acetate solution 图4中曲线A是壳聚糖C乙酸盐溶液在几丁质 初步纯化酶(来自甲壳低聚糖诱导的大豆)作用下其 粘度(用在奥氏粘度计中的流动时间表示)随时间变 化的过程曲线,曲线B为对照。由曲线A的形状知 壳聚糖乙酸盐溶液的粘度随时间延长而降低,壳聚 糖分子量逐渐变小。反应的初始的20min内壳聚糖 乙酸盐溶液粘度急剧下降,而25min后趋缓,这符合 酶促反应动力学规律。 2. 2. 3 初步纯化几丁质酶降解壳聚糖产生还

26、原糖 图5是还原糖产生量同酶促反应时间关系图, 所用酶同图4。由图知随反应时间延长,还原糖产 生量增加。但壳聚糖底物DD值小的A在相同反应 时间内还原糖产生量要比DD值大的C要高,即聚 糖底物脱乙酰度越小,酶解反应产生的还原糖越多,当酶作用于DD值为95 %的壳聚糖时,酶解反应产 生的还原糖比DD值为88.5 %的C更少(结果未列出)。所以大豆几丁质适合降解脱乙酰度DD小的壳 聚糖,要求被切的糖苷键一侧或两侧为GlcNAC。壳聚糖脱乙酰度DD越小,酶切位点越多,产物平均聚 合度越小;壳聚糖脱乙酰度DD越大,酶切位点越少,产物平均聚合度越大。 2. 2. 4 甲壳低聚糖的制备 5g壳聚糖A溶于4

27、50mL 1 %(V/ V)乙酸中(用碳酸氢钠调pH 4. 0) ,加初步纯化酶43mL ,共反应 651上 海 水 产 大 学 学 报 12卷 1995-2005 Tsinghua Tongfang Optical Disc Co., Ltd. All rights reserved. 图5 还原糖产生量同酶促反应时间的关系 Fig.5 The effect of reaction on the production of reducing sugar 37.5h ,得到的甲壳低聚糖平均聚合度DP为4.78 - 5.29 ,得率: 41.7 %。 3 讨论 经诱导的大豆的几丁质酶酶活(基于测

28、还原糖 产生量)是未经诱导的大豆的46倍,而其对壳聚糖 乙酸盐溶液的VDP不足未经诱导的大豆的几丁质 酶的2倍,由此推测大豆经诱导产生内切几丁质酶 的同时,其他属于几丁质酶系的酶如N -乙酰胺基 葡萄糖酶(Acetyiglucosaminidase)、 胺基葡 萄 糖 酶 (glucosaminidase) 16和几丁二糖酶(chitobiase)8也被 诱导产生,这些酶可从壳聚糖的一端1次切12个残基下来,这样,在有限的时间里壳聚糖的聚合度不 会显著降低,宏观表现即为粘度不会急剧降低,而有还原力的组分却大量产生从而被测为高的酶活力。 为确认这些酶存在与否,可用它们的专一性底物来测酶活。 为探

29、明几丁质的具体作用方式,可进一步分离纯化其酶解产物,然后分析其糖残基的组成、 在产物 分子中的排列顺序及产物分子的构型和构象。 参考文献: 1 Jeon YJ , K im S K. Production of chitooligosaccharides using an ultrafiltration membrane reactor and their antibacterial activityJ . Carbohydrate Polymers ,2000 , 41:133 - 141. 2 Aiba S I. Preparation of N2acethylchitooligosacc

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