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1、收稿日期:2005_04_11 作者简介:李 艳,女,主管检验师 尿激酶型纤溶酶原活化物和基质金属蛋白酶类在腹主动脉瘤组织中的表达 李 艳 1,张业伟2(1 河南中医学院附属第一医院检验科,河南 郑州450000;2南京医科大学附属第一医院肝脏移 植中心,江苏 南京210029) 摘要:目的 探讨尿激酶型纤溶酶原活化物(u_PA)和明胶酶A(MMP_2)、明胶酶B(MMP_9)在腹主动脉瘤(AAA)组织 中的表达及产生的源泉。方法 用u_PA和MMP_2、MMP_9单克隆抗体以免疫组织化学方法在30例AAA组织和30 例正常腹主动脉组织切片上检测u_PA和MMP_2、MMMP_9抗原(蛋白);
2、用u_PA的寡核苷酸探针和MMP_2、MMP_9 的cDNA探针以原位杂交方法,在上述AAA组织和正常腹主动脉组织的冰冻切片上探测u_PA和MMP_2、MMP_9的 mRNA。结果u_PA和MMP_9主要在AAA组织中层和外膜巨噬细胞表达,在正常腹主动脉组织中无表达;MMP_2在 AAA组织中主要由中层平滑肌细胞表达, 在正常腹主动脉组织中无表达。结论 由巨噬细胞产生的u_PA直接激活原 MMP_2和原MMP_9 ,在 AAA形成和扩张中起着关键性作用。 关键词:腹主动脉瘤;尿激酶型纤溶酶原活化物;明胶酶A;明胶酶B;免疫组织化学;原位杂交 中图分类号:R543.16; R329.26 文献标
3、识码:A 文章编号:1000_2588(2005)10_1305_03 E“#$%.-22(0$(.;74-&;+$/ 2Liver Transplantation Center, First Affiliated Hospital, Nanjing Medical University, Nanjing 210029, China ? urokinase_type plasminogen activatormatrix; metalloproteinases; gelatinase A; gelatinase B; immunohistochemistry; in situ hybridiz
4、ation 采用免疫组织化学和原位杂交方法对尿激酶型 纤溶酶原活化物(u_PA)和明胶酶A(MMP_2)、明胶 酶B(MMP_9)的抗原(蛋白)和mRNA在腹主动脉瘤 (AAA)组织中的表达进行实验研究,结果报道如下。 1 对象和方法 1.1 临床资料 30例AAA病人术中切除AAA组织, 男16 例、 女14例,平均年龄63.3岁,术前经彩超、CT、血管造 影等诊断为肾动脉下型AAA。 术中均可见腹主动脉 呈梭形扩张、瘤内壁附壁血栓及瘤壁内膜显著的粥样 化,经肉眼和镜下检查诊断为AAA。 对照组30例正 常腹主动脉标本在手术台上取自尸体供肾者修肾时 剪下的腹主动脉壁,经大体和镜下病理检查为正
5、常腹 主动脉。实验组和对照组的腹主动脉组织均取自肾动 脉下23 cm前外侧壁全层腹主动脉壁。 每例标本分 阶段为两份:一份经4%多聚甲醛固定、梯度酒精脱 水及石蜡包埋,切片厚5 m ,作 HE染色和免疫组织 化学染色;另一份标本立即浸入液氮中速冻,后放入 _80 冰箱中保存,实验时以恒冷冰冻切片机 _4 切 片,厚5 m,作原位杂交。 为防止PNA酶污染,收集 标本及切片制备过程中的器械、容器刀片等均经高压 或DEPC水处理。 1.2 实验方法 1.2.1 免疫组化染色采用SABC法。 (1)主要试剂: 即用型SABC试剂盒和DAB显色试剂盒购于武汉 博士德生物工程有限公司, 鼠抗人巨噬细胞C
6、D_68 单克隆抗体购于福州迈新公司,鼠抗人u_PA单克隆 2005;25(10) 第一军医大学学报(J First Mil Med Univ)1305 图2 实验组MMP-9单克隆抗体免疫组化染色 Fig.2 Immunohisto hemistry of MMP-9 mono lonal antibody in the experimental group 图1 HE染色结果Fig.1 Result by HE staining A: Experimental group; B: Control group 抗体及鼠抗人MMP-2单克隆抗体和鼠抗人MMP-9 单克隆抗体购于DAKO公司。
7、(2)对照体系:阳性对 照选用2例骨肉瘤已知阳性的石蜡切片于正式实验 时做u-PA、MMP-2、MMP-9的阳性对照。 空白对照, 在做免疫组织化学时, 随机选取3例, 省去u-PA、 MMP-2、MMP-9一抗,用作空白对照,用PBS缓冲液 替代一抗。 (3)主要实验步骤:按试剂盒说明书进行。 一 抗的浓度分别为:u-PA为3.3 g/ml,MMP-2为1.6 g/ml,MMP-9为2 g/ml。 采用DAB溶液显色。 (4) 结果判断: 在400光镜下根据细胞质棕黄色颗粒染 色的范围和程度判断结果。 1.2.2 原位杂交(1) 主要度剂:40 bp单链u-PA cRNA寡核苷酸裸探针, 经
8、随机引物法地高辛标记。 MMP-2和MMP-9的cRNA探针购自北京医科大学 医学交流服务部, 敏感性加强型原位杂交测试剂盒 (过氧化物酶) 和DAB显色试剂购自武汉博士德生 物工程有限公司。(2)对照体系:阳性对照选用2例骨 肉瘤已知阳性的冰冻切片于正式实验时做u-PA、 MMP-2、MMP-9杂交反应的阳性对照。杂交反应对照 为在做原位杂交时,随机选取3例切片,省去u-PA、 MMP-2、MMP-9探针,以PBS缓冲液代替。 (3)主要 实验步骤:cRNA单链寡核苷酶u-PA探针由苏州大 学病理教研室进行地高辛标记,以u-PA探针进行原 位杂交的主要实验步骤参考敏感性加强型原位杂交 检测试
9、剂盒使用说明书, 以MMP-2和MMP-9的 cRNA探针进行原位杂交的主要实验步骤参考相关 文献1。采用DAB溶液显色。(4)结果判断:将每张切 片在1040倍光学显微镜下任选3个视野, 由计算 机显微图象分析系统自动分别测量每个视野阳性染 色的面积、灰度,计算每个视野的阳性单位值阳性单 位值=面积(256-灰度),求出3个视野的阳性单位 值的平均值,即为每张切片的平均阳性单位值。 1.3 统计学处理 免疫组化染色结果的实验数据采用两独立样本 秩和检验(Mann-Whitney Test),实验组和对照组平均 阳性单位值之间比较采用t检验。 2 结果 2.1 HE染色 实验组各例均有不同程度
10、的粥样硬化,平滑肌细 胞数量减少,残留平滑细胞变性、萎缩,大量单核炎性 细胞浸润动脉中层和外膜。CD-68免疫组化染色证实 这些炎性细胞主要是巨噬细胞(图1A)。 对照组无粥 样硬化,无炎性细胞浸润(图1B)(P0.01)。 2.2 免疫组化 采用u-PA单克隆抗体免疫组化染色,实验组30 例中有9例见浸润于中层和外膜中的巨噬细胞胞质 内颗粒状黄染,对照组30例中未见阳性染色,两组比 较有显著差异(P0.01)。 采用MMP-9单克隆抗体免 疫组化染色显示,实验组30例中均见阳性染色,虽然 有在中层和外膜的浸润巨噬细胞表达MMP-9, 但其 主要的表达见于外膜的滋养血管腔内和周围的巨噬 细胞等
11、炎性细胞,同时在阳性表达MMP-9的巨噬细 胞周围有较多的炎性细胞(巨噬细胞等)浸润(图2)。 第一军医大学学报(J First Mil Med Univ) 第25卷1306 2.3 原位杂交 采用u_PA反义寡核苷酸cRNA探针作冰冻切 片原位杂交,探测u_PA cRNA,两组均有阳性信号表 达,实验组中见弥漫性浸润于中层和外膜的巨噬细胞 强阳性信号表达, 高于对照组 平 均 阳 性 。 采 用 MMP_2 cDNA探 针 作 原 位 杂 交 ,探 测MMP_2 mRNA,两组均有阳性信号表达,实验组中杂交阳性 信号主要见于中层平滑细胞质内,以周围有炎性细胞 浸润的平滑肌信号为强。 用MMP
12、_9 cRNA,两组均有 阳性信号表达,实验组中杂交阳性信号主要见于外膜 的滋养血管(新生自管)腔内和血管周围的巨噬细胞 等炎性细胞,同时在阳性表达MMP_9的巨噬细胞周 围有较多的炎性细胞(巨噬细胞等)浸润,还可见浸润 于中层和外膜的巨噬细胞阳性表达。 3 讨论 近年来通过大量的动物实验和临床观察性研究, 认为AAA的形成、扩张及最终破裂是通过浸润于动 脉壁中层和外层的炎性细胞尤其是巨噬细胞释放的 各种蛋白水解酶而导致动脉壁中层和外膜弹性蛋白、 胶原蛋白等结构蛋白破坏的结果。在这些酶中纤溶原 激 活 物 (PAS)/纤 溶 酶 系 统 和 基 质 金 属 蛋 白 酶 (MMPs)中的明胶酶起
13、着重要作用24。PAS和纤溶酶 是明胶酶在体内的主要激活物,PAS有组织型(t_PA) 主要参与溶栓, 而u_PA主要功能与细胞外基质 (ECM)的重构代谢有关5。 因此,u_PA作为明胶酶的 激活物, 在明胶酶对主动动脉壁ECM的弹性蛋白、 胶原蛋白等降解以及AAA的形成、扩张和最终破裂 可能起着关键性作用。 在我们的实验中,采用免疫组织化学染色方法和 原位杂交技术显示u_PA主要由浸润于动脉中层和 外膜的巨噬细胞表达。u_PA以酶原prou_PA的形式 分泌。Prou_PA通过自身非水解链的N_ 端特异性结 构系列结合于细胞膜表面的高亲和性结合位点u_PA 受体(u_PAR)6。 此时,p
14、rou_PA被微量纤溶酶或通过 其他途径激活, 并能在细胞表面保持活性数小时7。 u_PA和u_PAR的结合加速了纤溶酶原的活化,并使 纤溶酶定位于局部接触部分, 活化的纤溶酶又激活 prou_PA,形成正反馈调节环8。 纤溶酶对ECM只有 有限的水解活性, 单以纤溶酶灌注大鼠的腹主动脉, 不能使AAA形成 9。 纤溶酶直接活化 proMMP_1、 proMMP_3、proMMP_9等 ,MMP_3又 可 激 活 proMMP_1、proMMP_2、proMMP_9, 形成正反馈调节 环1013。 同时活化的u_PA能直接激活由细胞泌出并 与胞膜相关联的proMMP_2和proMMP_914。
15、 因此, 在PAS/纤溶酶系统和MMPs的活化过程中,u_PA 起着“扳机点“样的作用。 MMP_2主要由中层的平滑细胞分泌,MMP_2被 u_PA活化后,降解弹性纤维、胶原等,导致腹主动脉 壁结构蛋白的破坏 , 是AAA形成 的 原 因 之 一 。 MMP_9可由多种细胞合成分泌,与类风温关节炎、肾 病、肿瘤浸润及转移和新生血管时基质的变化等有 关15。 细胞因子可调节MMP_9的表达16。Herron等17 证实在AAA组织外膜滋养血管数量较正常腹主动 脉组织增多。Szekanecz等18发现含有IL_8的腹主动 脉瘤组织的提取清液,能增加腹主动脉内皮细胞的迁 移。 内皮细胞的迁移是新生血
16、管形成的关键步骤之 一。 White等19证实在AAA形成的早期,与中层交界 处的外膜的弹性蛋白降解早于外膜结构完整性的破 坏。 在我们的实验中,实验组虽然有在中层和外膜的 浸润巨噬细胞表达MMP_9, 但其主要表达见于外膜 滋养血管腔内和周围的巨噬细胞等炎性细胞,同时在 阳性表达MMP_9巨噬细胞周围有较多的炎性细胞 (巨噬细胞等)浸润。 我们得出的结论是:在AAA的 形成和早期扩张中,MMP_9的主要作用是参与新生 血管形成有关的基质代谢,使腹主动脉的新生血管数 量增加。在血管周围巨噬细胞、淋巴细胞等的作用下, 使得滋养血管腔内和周围的巨噬细胞在局部过度表 达MMP_9,导致外膜的弹性纤维
17、局灶性破坏,之后巨 噬细胞弥漫浸润于ECM中继续表达MMP_9, 从而 导致中层弹性纤维和胶原管等结构蛋白的广泛破坏, 可能是导致AAA继续扩张和破坏的原因之一。 结合前人的实验研究结果,我们的实验从蛋白和 分子水平证实:由巨噬细胞分泌的u_PA,激活由平滑 肌 细 胞 分 泌 的proMMP_2和 由 巨 噬 细 胞 分 泌 的 proMMP_9, 并调节MMP_2和MMP_9的活性,在 AAA的形成、扩张和最终破裂中起着关键性作用。在 AAA形成过程中需u_PA和明胶酶间的相互蛋白水 解作用。 在细胞表面,这些蛋白水解过程可通过u_PA 和明胶酶与细胞表面间的特异反应而受到调节。理解 调节
18、u_PA和明胶酶与细胞膜间反应的分子机理,将 为我们提供控制明胶酶活性的方法,从而达到在临床 上采用非手术方法有效治疗AAA。 参考文献: 1Maggiano N, Larocca LM, Pinntelli M, et al. Detection of mRNA and hnRNA using a digoxigenin labeled cDNA probe by i sit( hybridization on frozen tissue sectionsJ. Histochem J, 1991, 23 (19): 69_74. 2Carmeliet P, Moons L, Lijnen R
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