局部亚低温对大鼠局灶性脑缺血再灌注后凋亡相关因子的影响.pdf

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1、第4 2 卷第3 期 2 0 0 8 年6 月 哈尔滨医科大学学报 J O U R N A LO FH A R B I NM E D I C A LI I N E R S r r Y V 0 1 4 2 N j 3 J u n ，2 0 0 8 2 5 1 局部亚低温对大鼠局灶性脑缺血再灌注 后凋亡相关因子的影响 张丽1 ，苏志强2 ( 1 哈尔滨医科大学第四临床医学院神经内科；2 哈尔滨医科大学第一临床医学院神经内科，黑龙江哈尔滨1 5 0 0 0 1 ) 摘要】 日曲研究局部亚低温对大鼠局灶性脑缺血再灌注后c a s p a s e - 3 、凋亡诱导因子( a p o p t o s i

2、 si n d u c i n gf a c t o r ， A I F ) 、F a s 的影响，探讨亚低温对脑缺血再灌注损伤的保护机制。方法 线栓法建立大鼠大脑中动脉阻塞( M o 均) 及再通模型，分为假手术组、常温及亚低温脑缺血再灌注组，应用R T - P C R 技术检测再灌注后不同时相缺血侧皮层 c a s p a s e - 3 、A I F 、F a s 的表达。结果每一再灌注时间点亚低温组c a s p a s e - 3 、A I F 及F a s 的m R N A 表达均低于常温组，并 有显著性差异。结论局部亚低温减少c a s p a s e 依赖性通路中的关键蛋白酶c

3、 a s p a s e - 3m R N A 的表达，减少c a s p a s e 非 依赖性通路中的关键蛋白A I Fm R N A 的表达，减少外源性胱冬酶激活途径中关键受体F a sm R N A 表达，通过多个环 节而抑制脑缺血再灌注后凋亡的发生，从而起到脑保护作用。 关键词 亚低温；脑缺血再灌注；凋亡；A I F ；e a s p a s e - 3 ；F a s 中图分类号 R 一3 3 2 ；R 7 4 3 文献标识码】A 文章编号 1 0 0 0 1 9 c 1 5 ( 2 0 0 8 ) 0 3 0 2 5 1 0 4 E f f e c to ff o c a lm i

4、 l dh y p o t h e r m i ao nt h ea p o p t o s i s - r e l a t e df a c t o r si n c e r e b r a li s c h e m i ar e p e r f u s i o nr a t s Z H A N GL i ，S UZ h i q i a n g ( D e p a r t m e mo fN e u r o l o g y ，T h e 乃砒C l i n i c a lC o t l e g e ，H a r b i nM e d i c a lU n i v e r s i t y ，H

5、 a r b i n1 5 0 0 0 1 ，C h i n a ) A b s t r a c t ：O b j e c t i v e T oi n v e s t i g a t et h ee f f e c to fm i l dh y p o t h e r m i ao na p o p t o s i s - r e l a t e df a c t o r sc a s p a s e - 3 ，印- o p t o s i si n d u c e df a c t o r ( A I F ) a n dF a si nf o c a lc e r e b r a li s

6、 c h e m i ar e p e f f u s i o nr a t s M e t h o d s T h em i d d l eC e r e b r a la r t e r yo c c l u s i o n ( M C A O ) a n dr e p e f f u s i o nm o d e l so fr a tw e r ea c h i e v e db ya ni n t r a l u m i n a lf i l a m e n t T h e a d u l tm t sw e r er a n d o m l yd i v i d e di n t

7、os h a m - o p e r a t e dg r o u p ，n o r m o t h e r m i ai s c h e m i ar e p e f f u s i o ng r o u pa n dm i l d h y p o t h e r m i ai s c h e m i ar e p e r f u s i o ng r o u p T h em R N A so fc a s p a s e 一3 ，A I F ，a n dF a si nt h ei s c h e m i cc o d e xw e r e a s s e s s e db yR T -

8、 P C R R e s u l t s C 0 叫) 蒯w i t hn o r r n o t h e n n i ai s c h e m i ar e p e f f u s i o ng r o u p ，A I F ，c a s p a s e 一3 ，a n d F a sm R N Am a r k e d l yd e c r e a s e di nm i l dh y p o t h e r m i ag r o u p C o n c l u s i o nF o c a lm i l dh y p o t h e r m i aa l l e v i a t e sr

9、 a t c e r e b r a li s c h e m i ar e p e f f u s i o ni n j u r yb yi n h i b i t i n ga p o p t o s i si nd i f f e r e n tl e v e l s n o to n l yd e c r e a s i n gc a s p a s e 3e x - p r e s s i o n ( t h ek e yp r o t e i ni nc a s t m s e - d e p e n d e n tp a t h w a y ) b u ta l s od e c

10、 r e a s i n gA I Fe x p r e s s i o n ( t h ek e yp r o t e i n i nc a s p a s e i n d e p e n d e n tp a t h w a y ) ，f u l t h e n T l O r ed e c r e a s i n gF a se x p r e s s i o n ( t h ek e yr e c e p t o ri nd e a t hr e c e p t o r c a s p a s ea c t i v a t e dw a y ) K e yw o r d s ：m i

11、l dh y p o t h e r m i a ；c e r e b r a li s c h e m i a r e p e r f u s i o n ；a p o p t o s i s ；A I F ；c a s p a s e 一3 ：F a s 凋亡在脑缺血后神经元的损伤中发挥重要作 用。亚低温( 3 2 3 5o C ) 作为一种有效的神经保护 方法，可抑制脑缺血再灌注后凋亡的发生川。细胞 凋亡途径包括c a s p a s e 3 依赖途径及凋亡诱导因子 收稿日期 2 0 0 7 0 6 0 6 基金项目 国家自然科学基金资助项目( 3 0 4 7 0 5 8 5 ) 作者简

12、介】张丽( 1 9 7 2 一) 。女，黑龙江哈尔滨人，主治医师，博士。 * 通讯作者 ( a p o p t o s i si n d u c i n gf a c t o r ，A I F ) 介导的非c a s p a s e 一3 依 赖途径；c a s p a s e 。3 的激活又可通过内源性和外源性 途径，其中F a s 是外源性c a s p a s e 3 激活途径中的重 要受体乜】。本研究从& I F 、c a s p a s e 3 、F a s 等凋亡不同 环节，深入探讨局部亚低温抑制脑缺血再灌注后凋 亡的发生机制，为将局部亚低温应用于脑缺血病人 的临床治疗提供依据。

13、万方数据 2 5 2哈尔滨医科大学学报第4 2 卷 1 材料与方法 1 1 实验动物分组 7 0 只雄性W i s t a r 大鼠，购自中国农业科学院哈 尔滨兽医研究所，体重( 2 5 04 - 3 0 ) g 。随机分为常温 假手术组( n = 5 ) 、亚低温假手术组( n = 5 ) 、常温缺 血再灌注和亚低温缺血再灌注组。后两个缺血再灌 注组各分为6 个亚组，都先缺血2h ，后分别再灌注 2 , 6 、1 2 、2 4 、4 8 、7 2h ( 每亚组n = 5 ) 。亚低温组从缺 血时开始低温2h 。 1 2 局灶脑缺血再灌注模型制作 采用改良的L o n g a 线栓法 3 1

14、建立大鼠大脑中动 脉阻塞( m i d d l ec e r e b r a la r t e r yo c c l u s i o n ，M C A O ) 及再通 模型。缺血2h 后抽出栓线使血流再通。假手术组 栓线仅插至距分叉处1 0m i l l 。按L o n g a 神经功能评 分法，以麻醉清醒后评分1 4 分为有效模型。开颅 后见蛛网膜下腔出血者排除在外。至预定的再灌注 时间点，深度麻醉处死动物，取缺血侧视交叉至视交 叉前2n l m 范围内皮层脑组织，置入液氮中保存。 1 3 局部亚低温方法 亚低温组采用可调控半导体制冷仪( 哈尔滨工 业大学热工教研室研制，专利号Z L 9 8

15、 2 3 6 9 3 6 0 ) 。设 定制冷器温度为6 8 ( 先前实验已证实脑内缺血 区温度为3 3 左右) 4 。大鼠于脑缺血后立即病灶 侧紧密接触半导体制冷块给予亚低温，采用S L 4 型 针型点温度传感器( 上海同济大学研制) ，于亚低温 使用1 0m i n 内测大鼠鼓膜温度( 脑温平均高于鼓膜 温0 6 0 0 8o C ) ，证实脑温可以降至( 3 3 0 5 ) o C 。 亚低温持续2h 。亚低温结束后将大鼠置于室温( 2 5 ) 下自然复温。 1 4 R T - P C R 检测A I F ，c a s p a s e 一3 ，F a sm R N A 的表达 样品总R

16、N A 提取采用瞄z 0 1 试剂盒( M R S 公 司) ，操作按试剂盒说明进行。逆转录反应采用P r o m e g aA 3 5 0 0 逆转录试剂盒，引物合成由上海生工生 物工程公司合成，引物序列：c a s p a s e 3 ( G e n e B a n k N M 0 1 2 9 2 2 ) ：s e n s e5 7C T G G A C T G C G G T A T I G A G 3 ，a n t i - s e r I s e57 G G G ，I l G C G G T A G A G T A A G C3 ，扩增产物片段 长度1 0 2b p ；A I F 引物

17、序列( G e n e B a n k N M 0 3 1 3 5 6 ) ： 删5 A G T C C n A T l l C 玎o G l 娜A T3 a n t i s e n s e5 7 G A G G T C G C A T G T A 姗A G37 ，扩增产物片段长度 3 1 4 b p ；F a s ：( G e n e B a n k N M l 3 9 1 9 4 ) ：$ O l l , , a e5 C A A T G A G T c G T r AAA G G r K B A T3 a n t i s e n s e5 C A G C C l T A A G T G

18、A T A T I T G A G T G T A3 ，扩增产物片段长度5 9 3 b p ；内参照G A P D H ( G e n e B a n k M l 7 7 0 1 ) ：s e n s e5 T A A A I ：A I C 1 1 l ：1 1 A C A C T37 a n t i S e i l S e5 A C T C C l W A G G C C A T G T A C 沁37 ，扩增产物片段长 度2 0 0b p 。扩增条件c a s a p a s e 3 、F a s ：9 4 预变性 5B i n ；9 4 变性3 0s ，5 2o C 退火3 0s ，7

19、2 延伸 4 5s ，3 5 个循环；7 2 再延伸5m i n ；A I F ：9 4 预变 性5m i n ；9 4 变性3 0s ，5 4o C 退火3 0s ，7 2o C 延伸 4 5s ，3 5 个循环；7 2 再延伸5m i n ；G A P D H ：9 4 预 变性5m i n ；9 4o C 变性3 0s ，5 4o C 退火3 0S ，7 2 延 伸4 5s ，2 5 个循环；7 2o C 再延伸5m i n 。P C R 产物在 含溴化乙啶的1 5 琼脂糖凝胶电泳，紫外透射仪 观察，柯达D i g i t a lS c i e n c e1 D 凝胶图像系统扫描分 析。

20、以G A P D H 为内参照进行光密度分析，测定各样 本m R N A 的相对表达量。 1 5 统计学处理 实验数据以元s 表示，采用S P S S1 1 0 统计软 件处理，采用方差分析及成组资料t 检验，P 0 0 5 为差异有统计学意义。 2 结果 根据D N An l a d ( e r ( 撑S M 0 2 4 1 ，美国F e n n e n t a sL i f e S c i e n c e 公司) 所示，R T P C R 结果显示所扩增的 c a s p a s e - 3 、A I F 、F a s 、G A P D H 基因片段大小分别约为 1 0 2 、3 1 4

21、、5 9 3 、2 0 0b p ，与目标片段大小一致，提示均 为特异性扩增。 假手术组c a s p a s e 3 、A I F 、F a sm R N A 有少量表 达。常温组及亚低温组c a s p a s e - 3m R N A 表达于缺血 2h 再灌注2h 明显增加( 与对照组相比分别为t = 6 3 1 3 ，P 0 0 0 1 ；t = 2 3 2 9 ，P 0 0 5 ) ；以后随着缺 血时间的延长，表达逐渐增强；至再灌注2 4h 达高 峰。缺血2h 再灌注2h 后，常温组A I Fm R N A 表达 明显增加( 与假手术组相比t = 5 1 3 8 ，P 0 0 0 1

22、 ) ； 而在此时间点亚低温组A I Fm R N A 表达与假手术组 相比无明显改变( t = 1 8 8 5 ，P = 0 0 9 6 ) ，至再灌注 6h 可见明显增加( 与假手术组相比t = 4 2 4 9 ，P 0 0 5 ) 。A I Fm R N A 随着再灌注时间的延长，表达逐 渐增强，至再灌注2 4h 达高峰，再灌注7 2h 仍高于 假手术组。F a sm R N A 表达于缺血2h 再灌注6h 开 始明显增加( 与假手术对照组相比t = 5 1 1 ，P 0 0 1 ) ；以后随着缺血时间的延长，表达逐渐增强；至 再灌注2 4h 达高峰。 各再灌注时间点常温组与亚低温组比较

23、， c a s p a s e 一3 、A I F 、F a sm R N A 表达均有显著差异( P 0 0 5 ) ，亚低温组m R N A 的表达低于相应常温组( 附 表，图1 、2 、3 ) 。 万方数据 第3 期张丽，等局部亚低温对大鼠局灶性脑缺衄再灌注后凋f 相关因子的影响2 5 3 附表 大鼠脑缺血再灌注后常温及局部亚低温组c a s p a s e - 3 、A I F 及F a s 的m R N A 表达 * 常温与亚低温组相比P O 0 5 ；* * 常温与亚低温组相比P 0 0 1 图1 常温组及局部亚低温组各再灌注时间点c a s p a s e - 3m R N A

24、的表达 M ：# S M 0 2 4 1 ；l ，3 ，5 ，7 常温组再灌注2 ，1 2 ，2 4 ，4 8h ；2 ，4 ，6 ，8 亚低 温组再灌注2 ，1 2 ，2 4 ，4 8h 图2 常温组及局部亚低温组各再灌注时间点A I Fm R N A 的表 达 M ：_ I fS M f f 2 4 1 ；1 ，3 ，5 ，7 常温组再灌注2 ，1 2 。2 4 ，7 2h ；2 ，4 ，6 ，8 亚低 温组再灌注2 ，1 2 ，2 4 ，7 2h 图3 常温组及局部亚低温组各再灌注时间点F a sm R N A 的表达 M ：# 5 M 0 2 4 1 ；1 ，3 ，5 ，7 常温组再灌

25、注6 ，2 4 ，1 2 ，7 2h ；2 ，4 ，6 ，8 亚低 温组再灌注6 ，2 4 ，1 2 7 2h 3 讨论 局灶脑缺血后神经细胞死亡存在坏死和凋亡两 种方式，在梗死中心以坏死为主，在半暗带以细胞凋 亡为主。研究局灶脑缺血后半暗带细胞凋亡及各种 保护措施的机制有重要的临床意义。近年来大量文 献证明亚低温( 3 2 3 5 ) 对缺血性神经元有保护 作用 5 ，其机制涉及降低糖代谢率和耗氧量、抑制兴 奋性氨基酸递质释放和自由基产生、减轻脑水肿、保 护血脑屏障、减少神经细胞凋亡等。而有关亚低温 抑制脑缺血再灌注后神经细胞凋亡的具体机制尚不 清楚。C a s p a s e 3 在凋亡发

26、生的蛋白酶级联反应过程 中处于核心位置，活化的c a s p a s e 3 切割聚A D P 核糖 聚合酶 p o l y ( A D P r i b o s e ) p o l y m e r a s e ，P A R P 、a c t i n 、f o d r i n 、l a m i n 等底物，最终使细胞凋亡。我们对M C A O 大鼠的研究表明，c a s p a s e 一3m R N A 于再灌注2h 开始 增高，于2 4h 达到高峰后逐渐下降。这与脑缺血再 灌注后凋亡发生的规律相一致 6 7 。在再灌注各时间 点亚低温组e a s p a s e 3m R N A 的表达明显

27、低于常温 组。推测亚低温通过抑制脑缺血后c a s p a s e 一3 转录， 参与减少神经细胞凋亡。与X u 等“ 1 体外细胞水平 的研究结果类似，x u 在体外神经元凋亡模型中发 现，在缺血2 4h 常温组( 3 7 ) c a s p a s e 一3 ，8 和一9 的 活性显著增加，而在亚低温组( 3 3 ) c a s p a s e s 活性 显著降低。 A I F 介导的细胞凋亡是独市于c a s p a s e 通路之外 的另一条更原始、更保守的凋亡途径旧J 。研究显示， A I F 在缺血半暗带神经细胞凋亡中通过非c a s p a s e 依 赖途径发挥重要作用 9 0

28、 J 。目前，对于局灶脑缺血 再灌注后A I Fm R N A 的表达及亚低温对其的影响尚 未见报道。本实验结果显示假手术组可见低量A I F m R N A 的表达，A I Fm R N A 水平于局灶脑缺血2h 再 灌注2 6h 后开始增高，于2 4h 达到高峰后逐渐下 降。提示在脑缺血这种凋亡信号刺激下A I F 的转录 万方数据 2 5 4 哈尔滨医科大学学报第4 2 卷 开始活跃，并且A I Fm R N A 随时间的动态变化与脑 缺血后神经细胞凋亡发生的规律趋于一致【6 J 。本研 究结果还显示每一再灌注时间点亚低温组A I Fr n R N A 的水平皆低于相应常温组，提示亚低温

29、可在转录 水平抑制脑缺血后A I F 的表达。常温组A I F 的m R N A 水平于再灌注2h 时开始升高；而亚低温组至再 灌注6h 时才开始升高，表明亚低温可以延缓A I F 转录水平的激活。可见，亚低温可通过抑制脑缺血 再灌注后A I F 的转录而参与减少神经细胞凋亡的机 制。C u l m s e e 等刮研究显示，通过抑制p o l y ( A D P - r i b o s e ) 及B i d 可减少A I F 至细胞核的易位。亚低温抑 制A I Fm R N A 表达，发挥脑缺血保护作用，是否与此 两种因子有关尚有待研究。 C a s p a s e 的激活主要有2 种途径：

30、即死亡受体介 导途径( 外源性途径) 和线粒体依赖性凋亡途径( 内 源性途径) 。F a s 又称A p o 1 或C D 9 5 ，是e a s p a s e 激活 外源性途径中重要的死亡结构域受体，F a s 在局灶 脑缺血的病理机制中发挥作用 1 1 J ，抑制F a s 可减轻 脑缺血损伤2 J 。 本研究结果表明，F a s 的m R N A 表达于脑缺血 再灌注后6h 开始增加，于脑缺血再灌注后2 4h 达 到高峰，以后逐渐下降，直到再灌注7 2h 仍高于正 常。这与M a l s u y a m a 等 1 3 1 的报道相符，他们在全脑 缺血小鼠发现，缺血3 0m i n 后

31、6h 可见F a sm R N A 的 表达。本研究还发现局部亚低温与相应常温组F a s m R N A 的表达存在明显差异。在局部亚低温各组， F a sm R N A 的含量较相应常温组皆可见减少。推测 F a s 参与了局部亚低温减少脑缺血再灌注后神经细 胞凋亡的保护机制。 总之，本研究进一步阐明局部亚低温对局灶脑 缺血再灌注时凋亡产生抑制作用的机制。局部亚低 温可通过多个环节抑制脑缺血再灌注后凋亡发生， 起到脑保护作用，减少e a s p a s e 依赖性通路中关键蛋 白酶c a s p a s e 3m R N A 的表达，减少c a s p a s e 非依赖性 通路中关键蛋白

32、A I Fm R N A 的表达，减少外源性胱 冬酶激活途径中关键受体F a sm R N A 的表达，起到 脑保护作用。为亚低温脑保护对脑缺血的临床应用 提供了理论基础。 参考文献 1 S e h a l l e rB ，G r a fR t t y p o t h e r m i aa n ds t r o k e ：t h ep a t h o p h y s i o l o g i e a l b a c k 删 J P a t h o p h y s i o l o g y ，2 0 0 3 ，l O ( 1 ) ：7 3 5 2 J m aN ，S u s i ns A ，D a

33、u g a sE ，矗a E e n t i a lr o l eo ft h em i t o c h o n d r i a l 8 p o r , t o s i s - i n d u c i n gf a c t o ri np I q 即日蒯c e l l , e a t h J N a t u r e ，2 0 0 1 ， 4 1 0 ( 6 8 2 8 ) ：5 4 9 - 5 5 4 3 h n 铲E Z ，W e i m t e i nP R ，C a r l s o nS ，e t 耐R e v e r s i b l em i d d l ec e r e b r a

34、l a r t e r yo c c l u s i o nw i t h o u te r a n i e c t o m yi nr a t s E J S t r o k e ，1 9 8 9 ，2 0 ( 1 ) ： 8 4 - 9 1 4 王德生，丰宏林，盛莉，等病变侧亚低温对局部脑缺血再灌流 损伤有关因素的影响 J 】中华神经外科杂志，1 9 9 9 ，1 5 ( 4 ) ：2 4 0 - 2 4 2 5 H a n l e yD F R e v i e wo fc r i t i c a l ma n de m e r g e n c ya p p r o a c h e st

35、oS t l - o k e J S t r o k e ，2 0 0 3 ，3 4 ( 2 ) ：3 6 2 3 6 4 6 P h a n i t h iP B ，Y o d a i d aY ，S a n t a n aA ，e ta M i l dh y p o t h e n n i am i t i g a t e s p o 豳i s e h e r n l cn a u “m a ld e a t hf o l l o w i n gf o c a lc e r e b r a li h e m i ai n r a t b r a i n ：i m n m n o h i s

36、 t o c h e m i e a ls t u d y0 fF a s ，c a 渺3a n d1 1 I N ， J 1 N e u r o p a t h o l o g y 。2 0 0 0 ，2 0 ( 4 ) 2 7 3 2 8 2 7 X u L ，Y e n a r i N A ，S t e i n l ) e I 葛G K 。da M i l d h y o o t h e r m i l t l * e d l i c e t a p o p - 嫡so fm n e u r o l l s n 口t r oe a r l yi nt h ee a s c a d e J

37、 JC e r e bB l o o d F l o wl V l e t a b ，2 0 0 2 ，2 2 ( 1 ) 2 1 2 8 【8 J S u s i nS A ，l o r e n z oH K ，Z a n m m iN ，矗以M o l e c u l a rc h a r a c t e r i z a t i o no f m i t o e h o n d r i a la p o p t 0 6 i s - i n d u c i n gf a e t o r J N a t u r e ，1 9 9 9 ，3 9 r 7 ( 6 7 1 8 ) ： 4 4 1 4

38、 4 6 9 C a oG ，C l a r kR S ，P e iW ，西a T r a n s l o e a t i o no fa p o p t o s i s - i n d u c i n gf a c t o ri nv u l n e r a b l en e u r o ma f t e rt r a n s i e n tc e r e b r a li s c h e 曲a n di nn e 帅 h a lc u l t u r e sa f t e ro x y g e n - 9 1 c o d e p r i v a t i o n J JC e r e bB

39、l o o dF l o w l v l e t a b ，2 0 0 3 ，2 3 ( 1 0 ) ：1 1 3 7 1 1 5 0 1 0 C u l m s e eC ，Z h uC ，L a n d s h a m e rS 。班a A t x , p t i s - i n d u e i n gf a c t o r t r i g g e r e db yp o l y ( A D P - r i b o s e ) p o l y m e r a s ea n dB i dm e d i a l n e u l o h a lc e l ld e a t ha f t e ro

40、 x y g e n - g l u c o s ed e p r i v a t i o na n df o c a lc e r e b r a l i a e , r a , J JN e u r o i ，2 0 0 5 ，2 5 ( 4 4 ) ：1 0 2 6 2 1 0 2 7 2 11 M a t s u y a m aT ，H a t aR ，Y a m a m o t oY ，村a L o c a l i z a t i o no fF a sa n t i g e n m R N Ai n d u c e di np o s t i s c h e m i cn l r

41、i n ef o r e b r a i nb yi n s i t uh y b r i c l i z a - t i o J B r a i nR e sl V l o lB r a i nR e s 。1 9 9 5 ，3 4 ( 1 ) ：1 6 6 1 7 2 1 2 M a r t i n V i l l a l b aA ，H a h n eM ，K l e b e rS ，e ta T h e r a p e u t i cn e u t r a l i r a t i o no fC I ) 9 5 - l i g w la n dT N Fa t t e n u a t

42、e sb r a i nd a m a g ei ns t r o k e J C e l lD e a t hD i f f e r ，2 0 0 1 ，8 ( 7 ) ：6 7 9 - 6 8 6 1 3 M a t s u y a r n aT ，H a t aI t ，T a g a y aM ，da F a sa n t i g e nm R N Ai n d u c t i o n i n p 0 6 t i s c h e m i ci l l l i n eb r a i n J B r a i nR e s ，1 9 9 4 ，6 5 7 ( 1 2 ) ：3 4 2 3 4 6 万方数据