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1、J o u rna l o f Ma t h e m a t i c a l Me d i c in e Vo l . 2 1No . 12 0 0 8 文章编号: 1 0 0 4 - 4 3 3 7 ( 2 0 0 8 ) 0 1 -00 3 8 - 0 2中图分类号: R - 3 3 2文献标识码: A基础医学研究 小鼠肾脏发生发育中神经型一氧化氮合酶的定量分析 刘 霞包 翠芬张晓明 ( 辽宁医学院组织胚胎学教研室 穆长征 锦州 1 2 1 0 0 1 ) 摘 要: 目 的: 对生后小鼠肾脏发生发育不同阶段中神经型一氧化氮合酶( n N O S ) 的表达进行定量分析， 探讨n N O S
2、 在小鼠生 后肾脏发育中的意义。 方法: 分别取新生( 出生小于2 h ) 、 生后3 , 5 , 7 , 1 4 , 4 0 天昆明小鼠各8 只， 共6 组， 用免疫印迹技术和光密度分 析 方法 对 各组小鼠 生 后肾 神经型 一氧 化氮合酶进行定量检测， 以 测得的一氧 化氮合酶最大量为 1 ( 1 0 0 %) ， 计算蛋白 相对含量， S P S S i o . 0 统计软件包统计分析。结果: 新生组酶含量最高为1 0 0 %， 随年龄增长酶含量逐渐减少， 至成年达到最低水平为4 4 . 8 士 2 . 4 %。 结论: 这一趋势表明n N O S 可能在小鼠 生后肾 脏发育的 早期阶
3、 段起重要调节作用。 关键词: 小鼠 ; 肾 ; 神经型一氧化氮合酶 一氧化氮( N O ) 作为体内 重要的信使分子和效应分子， 在 调节肾 脏血流动力学方面具有重要的作用。肾脏中的N ( ) 主 要由 一氧化氮合酶( N O S ) 催化产生。 N O S 有三个亚型， 即神 经型一氧化氮合酶( n N O S ) 、 内皮型一氧化氮合酶( e N O S ) 和 诱导型一氧化氮合酶( i N O S ) 1 1 。目 前对肾发生发育过程中 N O和N O S 的研究还刚刚起步 ， 本实验通过定量方法检测生 后小鼠的发生发育不同阶段n N O S的含量， 旨在探讨 n N O S 在小鼠肾
4、脏发生发育中的意义。 1 材料和方法 1 . 1 实验动物与分组 成年健康昆明小鼠( 辽宁医学院实验动物中心提供) 。 根 据小鼠孕程确认仔鼠出生时间， 取新生( 小于2 h ) , 3 , 5 , 7 , 1 4 , 4 0 天小鼠各8 只， 共6 组。 1 . 2 主要试剂 n N O S 兔抗鼠多克隆抗体( 北京中杉公司) ; 细胞裂解液、 丙稀酞胺、 N , N - 亚甲基双丙稀酞胺、 甘氨酸、 T w e e n 2 0 , T r i - t o n X - 1 0 0 , T r i s b a s e , S D S 和P V D F 膜( S I G M A公司) 。 1 .
5、 3 We s t e r n b lo t 步骤 各组小鼠 麻醉后剖腹取右肾， P I S S 冲洗， 迅速置于液氮冷 冻， 一7 0 冰箱保存。 取冷冻肾 组织， 加人3 倍体积的细胞裂 解液， 。 下剪碎、 匀浆， 将组织匀浆液静置 3 0 m in , 4 0C , 1 2 0 0 0 r p m离心l 0 m in ， 留 取上清液。 用B r a d f o r d 法测定蛋白 含 量， 分 装 成 每 离 心 管中 含I O K g 蛋白 ， - 2 0 冰 箱 保 存。 配 制1 0 % 分 离 胶和5 % 浓缩胶， 取1 0 f r g ( 3 0 户 ) 肾 组织蛋 白 细
6、 胞 裂 解上清液， 加人1 0 川S D S 样品 缓冲 液， 1 0 0 加热 3 m i n ， 离心。 取上述裂解液加人电泳胶样品槽， 1 0 0 V电压下 电泳， 待样品到达合适位置， 停止电泳， 将胶板取下， 转膜液洗 涤1 0 - 3 0 m in 。 将胶与0 . 4 5 f e m P V D F 膜( 用 前置于甲 醇内 浸 透5 m i n 左右， 再放人转膜液中至少5 m i n ) 置于厚滤纸( 已用转 膜液浸泡) 之间， 赶尽气泡， 常温下半干转印， 转印完成后将 P V D F 膜用T B S T ( T B S - 1 0 o T u e e n 2 0 溶液)
7、 冲洗， 5 %脱脂奶粉 溶液室温封闭1 -2 h 。与一抗( 兔抗小鼠n N O S 抗体， 稀释度 为1 ， 4 0 0 ) 4 *C 孵育过夜， T B S T洗脱 3 次， 每次至少 5 m i n ; 再 与二抗( 碱性磷酸酶标记的羊抗兔 I g G抗体， 稀释度为1 ， 2 0 0 ) 室温孵育 1 h , T B S T溶液洗脱 3 次， 每次至少 5 m i n ; N B T J B C I P 显色; 扫描电泳条带， 输人电脑， 用光密度分析软 件分析电泳条带光密度。 - 1 . 4 统计学分析 S P S S I O . 0 统计软件包统计分析， 组间比 较采用4 检验，
8、 以P 0 . 0 5 为有统计学意义， P o . 0 1 为有明显统计学意义。 1 0 4 7 7 - 1 0 4 8 3 . S e o a n e J , L e H V , Ma s s a g u e J . M y c s u p p r e s s io n o f t h e p 2 1 C i p I C d k i n h ib i t o r i n f l u e n c e s t h e o u t c o m e o f t h e p 5 3 r e s p o n s e t o D N A d a m a g e . N a t u r e , 2 0 0
9、 2 , 4 1 9 ; 7 2 9 - 7 3 4 . C h e n WC , Wu H C , H s u C D , e t a l. p 2 l g e n e rad o n 3 1 p o l y m o r - p h is m i s a s s o c ia t e d w i t h b l a d d e r c a n c e r 。U r o l O n c o l , 2 0 0 2 , 7 : 6 3 6 a s s o c ia t io n w i t h h u m a n e - s o p h a g e a l c a n c e r . O n c
10、 o g e n e , 2 0 0 0 , 1 9 ; 3 2 3 3 2 8 . 收稿日 期: 2 0 0 7 - 0 7 - 0 8 辽宁省教育厅资助项目 ( 2 0 0 7 1 1 7 1 ) 作者简介: 刘霞( 1 9 6 9 - ) ， 女， 汉族， 辽宁中医药大学博士研究生， 组织胚胎学副教授。 ，辽宁医学院科学实验中心 3 8 万方数据 数理医药学杂志 2 0 0 8 年第2 1 卷第1 期 2 结果 生后小鼠肾 脏发生发育不同阶段n N O S 含量分析We s t - e rn b l o t 电 泳条带图 显示新生小鼠n N O S 含量最高， 随着肾 脏 发生发育逐渐降
11、低， 到成年降低至最低水平。光密度分析显 示: 以测得的n N O S 最大量为1 ， 计算各组n N O S 表达相对含 量( 百分数) 。 新生小鼠n N O S 含量最高( 1 0 0 %) ， 出生后3 天 降低， 生后5 天进一步降低， 到成年降至最低水平。 见表1 a 表 1 新生组3 天组 小鼠生后不同阶段肾脏n N O S 表达的光密度百分数( 写) 5 天组7 天组1 4 天组 成年组 1 0 0“7 7 . 2 士4 . 2 # 7 1 . 4 士4 . 3 #5 9 . 3 士3 . 3 #4 7 . 7 士3 . 1 # 4 4 . 8 士2 . 4 # 注: 二 与成
12、年组比较尸0 . 0 1 ; #与新生组比 较， P 0 . 0 5 , 3 讨论 本实验表明生后小鼠发生发育不同阶段中， 新生小鼠肾 脏的n N O S 含量最高( P 0 . 0 5 ) , n N O S 是一种结构酶， 其表 达越多， 则可能产生N ( ) 越多， 作为新生小鼠 体内唯一的血管 舒张因子， 通过对抗高活性血管收缩因子特别是血管紧张素 I I 的作用， 可增加肾血流量( R B F ) 及肾小球滤过率( G F R ) ， 调 节肾脏正常的生理活动C 2 3 。 生后小鼠 早期阶段高肾血管阻力 ( R V R ) 、 低R B F 、 低G F R的生理特点是促使 n N
13、 O S 表达的主 要因素， 可见n N O S 在肾脏功能发育的早期对肾血液动力学 的调节起着重要作用。 此外n N O S 的表达还与细胞自 身的生 长发育与增殖、 母体较高的雌激素水平相关， 另外生长因子、 低 氧 也 能 上 调n N O S 的 表 达 3 ,4 。 在生后小鼠肾脏发生发育中， 随着肾单位的形成、 集合管 的分化， 肾功能也进一步完善， 体现在R B F 与G F R增加、 肾小 管重吸收功能完善等 诸多方面。 有研究表明: N O S 抑制剂可 以 减少2 5 % 左右的肾 血流量C 5 1 。 可见源于n N O S 的N O对血 流动力学的调节起着关键性作用，
14、仍是维持肾血管低张力的 必要物质和重要调节剂。 但是随着肾脏本身结构与功能日 趋 完善， N O的调节作用较生后小鼠肾脏发育早期有所降低， 表 现为n N O S 表达含量的降低。 在生后小鼠肾脏发育后期， N O 主要通过球旁反馈机制调节肾脏功能。生理学认为动物在成 熟过程中 许多器官和组织都能产生肾素， 有局部的肾素一 血管 紧张素系统存在， 而在成年小鼠肾脏中， 血管紧张素n 可以通 过肾素受体下调n N O S 的 含量而改变肾 动脉血管张力1 6 1 。 这 可以解释免疫印迹中 生后小鼠肾脏中n N O S 表达含量呈降低 趋势的实验结果。 另外， 在生后肾发育过程中肾间质增多， 肾
15、 实质比 例减少， 也使单位体积n N O S 含量降低。总之在生后 小鼠肾 脏发育不同阶段， n N O S 表达呈动态变化， 这种变化不 仅与其结构与功能发育相适应， 而且还受自 身所处环境影响。 新生小鼠的肾 脏 n N O S 表达含量最高， 成年小鼠n N O S 表达 含量最低， 这一趋势表明n N O S 可能在生后小鼠肾脏发育的 早期阶段起重要作用。 参考文献 I Ma t t s o n D L , Wu F . N i t r i c o x id e s y n t h a s e a c t i v i t y a n d i s o f o r m s i n r a
16、 t r e n a l v a s c u la t u r e . H y p e r t e n s io n , 2 0 0 0 , 5 : 3 3 7 -3 4 1 . 2 S o l h a u g NJ, D o n g X , A d e l m a n R D , e t a l . O n t o g e n y o f n e u ro n a l n i t r ic o x i d e s y n t h a s e , N O S l , i n t h e d e v e lo p in g p o r c i n e k id n e y . A m J P h
17、 y s io l R e g u la t o ry I n t e g r a t iv e C o m p P h y s i o l , 2 0 0 0 , 2 7 8 - 1 4 5 3 - 1 4 5 9 . 3 吕 宇涛， 张艳， 秦石成， 等， 正常小儿肾脏血流阻力的研究. 中华小 儿外科杂志. 2 0 0 3 , 3 . 2 3 9 - 2 4 2 . 4 We l c h WJ , Wil c o x C S . Wh a t i s b r a i n n i t r i c o x i d e s y n t h a s e d o i n g in t h e k i
18、d n e y ? C u r r O p i n N e p h r o l H y p e rt e n s , 2 0 0 2 , 1 1 ( 1 ) : 1 0 9 1 1 5 . 5 Ma j i d D S , N a v a r I , G . N i t r i c o x i d e i n t h e c o n t ro l o f r e n a l h e m o d y - n a m ic s a n d e x c r e t o ry f u n c t io n . A m J H y p e r t e n s . 2 0 0 1 , 1 4 ; 7 4
19、5 一 8 2 5 . 8 S o l h a u g , NJ, D o n g X , A d e l m a n R D , e t a l . O n t o g e n y o f n e u ro n a l n i t r ic o x i d e s y n t h a s e , N O S 1 , i n t h e d e v e l o p i n g p o r c i n e k id n e y . A m J P h y s io l R e g u la t o ry I n t e g r a t i v e C o m p P h y s io l , 2 0 0 0 , 2 7 8 : 1 4 5 3 - 1 4 5 9. 。3 9 万方数据