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1、8 实用临床医学2 0 0 9 年第1 0 卷第3 期P r a c t i c a l C l i n i c a lM e d i c i n e ，2 0 0 9 V o l1 0 ，N o3 应用表皮干细胞、间充质干细胞 构建复合皮肤及移植实验 林尊文，刘德伍，毛远桂 ( 南昌大学第一附属医院烧伤科，南昌3 3 0 0 0 6 ) 摘要：目的探讨应用表皮千细胞、间充质干细胞构建复合皮肤修复全层缺损皮肤的可行性。方法选择新西兰 大白兔1 8 只，在每只兔背上用常规手术方法切去3 个大小相同的全层皮肤缺损创面，面积约2c m X 2c m 。将经处 理的脱细胞真皮( a c e l l u
2、 l a rd e r m a lm a t r i x ，A D M ) 接种骨髓问充质干细胞( m e s e n c h y m a ls t e mc e l l s ，M S C s ) 和表皮干 细胞( e p i d e r m a ls t e mc e l l s ，E S C s ) 制成复合皮肤。实验分A 、B 、C3 组，A 组移植复合皮肤；B 组移植脱细胞真皮；C 组用油纱布敷盖创面。观察各组移植后l 3 周内创面愈合、肉芽组织生长及上皮化等情况，并进行创面组织H E 染色。结果术后A 、B 、C3 组创面愈合时间分别为( 1 4 6 1 1 ) 、( 1 8 3 士
3、1 2 ) 、( 2 3 0 土1 4 ) d ，组间比较差异有统 计学意义( P O 0 5 ) 。术后1 4d 创面标本H E 染色观察：A 组创面已上皮化，毛细血管、成纤维细胞数量增加，胶 原合成增多，肉芽组织形成丰富；B 、C 组创面卜皮化不全，仍可见许多炎性细胞，肉芽组织中毛细血管、成纤维细胞 数量不如A 组。结论表皮干细胞、问充质干细胞接种于脱细胞真皮构建复合皮肤，可加速新生血管形成及创面 上皮化，可用于全层皮肤缺损创面的治疗，提高创面愈合质量。 关键词：表皮干细胞；间充质干细胞；复合皮肤；全层皮肤缺损；创面修复 中图分类号：R 一3 3 2文献标识码：A文章编号：l 0 0 9
4、8 1 9 4 ( 2 0 0 9 ) 0 3 0 0 0 8 - - 0 2 皮肤是人体面积最大的器官，是机体免于脱水、 损伤、感染的第一道防线。当大面积皮肤缺损时，机 体不能保持正常的自稳状态，甚至导致死亡，因此需 要尽早覆盖创面，恢复皮肤的屏障功能，但自体皮不 足以封闭创面。寻找一种理想的皮肤代用品一直是 临床上急需解决的难题，组织工程学的兴起与发展 为解决这一难题提供了新的途径。目前组织工程学 面临着种子细胞来源不足的问题，本实验应用表皮 干细胞、间充质干细胞接种于脱细胞真皮上分别构 建表皮与真皮结构。 l 材料与方法 1 1 材料与试剂 健康成年新西兰大白兔( 南昌大学医学院动物 科
5、学部) 1 8 只；D u l b e c c o 最低必须培养基 ( D M E M ) 、胰蛋白酶一0 0 2 5 乙二胺四乙酸( E D T A ) ( 美国G i b c o 公司产品) ；1 V 型胶原( 美国G i b e o 公司) ；A I E T E C H 超净台( 苏净集团安泰公司) ； C K 4 0 普通光学显微镜和C K 4 0 倒置相差显微镜 ( 日本O l y m p u s 公司) ；培养瓶、培养皿、培养板( 美 国C o r n i n g 公司) ；T r i t o nX l O O ( 美国进口分装) 。 1 2 方法 1 ) 脱细胞真皮( a c e
6、 l l u l a rd e r m a lm a t r i x ， 收稿日期：2 0 0 8 1 2 2 4 A D M ) 的制备 1 ：切取兔耳内面皮肤，用胰蛋白酶一 E D T A 在4 冰箱中冷消化1 0 1 2h 后去除表皮， 再用0 0 5 的T r i t o nX - 1 0 0 浸泡并持续震荡2 4h 以进一步去除细胞成分，D - H a n k s 液充分浸泡洗 涤，4 保存备用。 2 ) 表皮干细胞( e p i d e r m a ls t e mc e l l s ，E S C s ) 体外分离与培养：取烧伤整形患者植皮手术剩余皮 片或胎儿皮肤，用胰蛋白酶一E
7、D T A 在4 冰箱中冷 消化1 0 1 2h ，分离表皮与真皮后制备成单细胞悬 液，将型胶原快速粘附分离法、纯化人表皮干细 胞。 3 ) 人骨髓间充质干细胞( m e s e n c h y m a ls t e m c e l l s ，M S C s ) 的体外分离和扩增：取骨髓穿刺所得人 健康骨髓，用D M E M 培养液稀释混匀后，加入到含 淋巴分离液的试管中，22 0 0r m i n 离心3 0m i n ，试 管出现4 层，用吸管提取第2 层的单个核细胞，n H a n k 液洗涤细胞2 次后加入含1 0 肽牛血清的 D M E M 液制成细胞悬液，接种在培养瓶中，置于 3
8、7 、5 C O 。饱和湿度恒温培养箱( 美国F o r m a n S c i e n t i f i c nI n c ) 培养。3d 后换液，弃去全部未贴壁 的细胞，保留贴壁细胞继续培养。待细胞长满瓶底 8 0 9 00 4 时消化传代培养。 4 ) 复合皮肤的制备：将制备好的脱细胞真皮 万方数据 实用临床医学2 0 0 9 年第l O 卷第3 期P r a c t i c a lC l i n i c a lM e d i c i n e ，2 0 0 9 ，V o l1 0 ，N o3 平铺培养皿中，置于3 7 、5 C O ：饱和湿度恒温 培养箱中4h 使其干燥，取传代培养至4 代
9、的间充 质干细胞制成单细胞悬液接种于脱细胞真皮培养 2 4h ；将分离培养的表皮干细胞收集制成单细胞悬 液接种于含有间充质干细胞的脱细胞真皮上培养 2 4h 制成复合皮肤。 5 ) 兔背部全层皮肤缺损模型的建立与移植： 1 8 只兔采用自身对照法，在每只兔背上用常规手术 方法切去3 个大小相同的全层皮肤缺损创面，面积 约2c m 2e m 。实验分A 、B 、C3 组，A 组：移植复 合皮肤至皮肤缺损创面上；B 组：移植脱细胞真皮至 创面；C 组：单纯油纱布敷盖创面。分别对各组动物 行手术覆盖创面，使移植物与创面贴合紧密，创面四 周丝线间断缝合，并打包固定。术后动物单笼常规 饲养，间断换药。
10、1 3 观察指标 1 ) 术后大体观察：( 1 ) 用I m a g e - p r o 图像分析 9 法测算术后不同时间点各组创面实际面积。计算创 面愈合率；( 2 ) 记录各组创面完全愈合时问( d ) 。 2 ) 组织形态学观察：分别于术后7 、1 4 、2 1d 在各移植区边缘取全层皮肤标本，行H E 染色，组 织切片。 1 4 统计学方法 采用S P S S1 3 0 软件进行统计学处理。所有数 据以均数土标准差( j s ) 表示，单因素多样本均数 比较采用方差分析，组间比较采用口检验，率的比较 用卡方检验。P O 0 5 为差异有统计学意义。 2 结果 2 1 创面愈合情况 3
11、组术后不同时间点愈合面积百分率及创面愈 合时间比较见表1 。 表1各组术后不同时间点创面愈合面积百分率与创面愈合时间比较( i 士s ) 与A 组相比：* P 0 0 1 ，* * P 0 0 5 ；与B 组相比，P 0 0 5 2 2 组织形态学观察 各组术后1 4dH E 染色比较：A 组创面已上皮 化，表皮细胞层增厚，细胞分层明显，出现角质细胞 层、颗粒细胞层、棘细胞层和基底细胞层，出现少量 皮钉，真皮层梭形成纤维细胞排列与表皮层平行，创 面组织内毛细血管、成纤维细胞数量增加，胶原合成 增多，肉芽组织形成丰富；B 组和C 组创面仍可见炎 性细胞浸润，肉芽组织中毛细血管含量少，胶原沉积 不
12、明显。各组术后2 1dH E 染色比较：B 组可见新 生上皮覆盖创面，胶原沉积趋多；A 组胶原趋于成 熟，排列趋于规则；B 、C 组胶原不成熟，排列不规则。 3 讨论 皮肤是人体面积最大的器官，当大面积皮肤严 重缺损时，机体不能保持正常的自稳状态，极易引起 系列并发症甚至导致死亡。因此需要尽早覆盖创 面，恢复皮肤的屏障功能。但是自体皮皮源不足难 以封闭创面。1 9 7 5 年，R h e i n w a l dJ G 等 2 3 建立了表 皮细胞培养技术，标志着皮肤组织工程的开端。随 后O C o n n e rA F 等【3 。将体外扩增的自体表皮细胞 膜片应用于临床并获得成功。但这种单纯移
13、植自体 表皮细胞膜片的方法由于缺乏真皮的支持，成活率 低，预后质量差。1 9 9 5 年W a i n w r i g h tD J H o 研制的 异体无细胞真皮在临床应用效果较好，但在其表面 仍需要自体皮肤的覆盖，以及由于血管化不足致皮 片成活率不高。 本实验采用间充质干细胞、表皮干细胞作为种 子细胞与脱细胞真皮构建复合皮肤的方法，可以在 许多方面克服单纯表皮细胞膜片或单纯真皮移植的 不足。理想的皮肤替代物应该含有真皮与表皮结 构f 6 。虽然表皮干细胞由于具有多向分化特性，可 以形成含有皮肤附属结构的皮肤，但是V a n D o r p A G 等 7 3 研究表明自体表皮细胞膜片治疗皮
14、肤缺 损，其创面愈合后质地及组织学结构欠佳，创面愈合 后瘢痕增生严重，抗感染能力差，且太薄易磨损和破 溃，因此自体表皮细胞膜片不适用于修复全厚皮肤 缺损创面。刘德伍等【8 3 将间充质干细胞作为种子细 胞构建组织工程皮肤可用于全层创面缺损的修复， 加速血管化形。本实验选用自体M S C s 、表皮细胞 ( 下转第1 3 页) 万方数据 实用临床医学2 0 0 9 年第1 0 卷第3 期P r a c t i c a lC l i n i c a lM e d i c i n e ，2 0 0 9 ，V o l1 0 ，N o3 随访中，主要心血管事件发生率较V A S P 控制组明 显减少，出
15、血发生率没有不同。本研究采用随机对 照方法对比1 5 0m g 与7 5m g 氯吡格雷维持量早期 疗效，2 组术后第2 、7 、3 0 天的P A 、P A I 和s P s 均 明显低于同组术后1d ，说明氯吡格雷对血小板的抑 制作用呈时间和剂量依赖一J 。并且1 5 0m g 组C R 发生率下降幅度较7 5m g 组明显( 3 0 0 一3 3 v s2 6 7 一1 3 3 ) ，体现了生化抵抗与药物剂量 成负相关。2 组组间术后第2 、7 、3 0 天的P A 、P A I 和s P - s 较术后第1 天有显著性差异，且本组资料中 无严重出血情况出现，平均3 个月的随访结果表明
16、1 5 0m g 维持剂苗氯吡格雷治疗3 0d 可显著降低术 后早期心血管事件发生率，这与上述研究推论一致， 提示可通过提高氯吡格雷维持量抑制血小板功能， 进而减少临床缺血事件的发生率。 本实验结果提示高维持量氯吡格雷治疗在高危 A C S 中的临床应用具有可行性，但其对非A C S 或 低危A C S 患者是否有益还有待证实。本研究的局 限性在于样本量有限及随访时间不长，未能证实高 维持量氯吡格雷治疗的远期有效性，尚需进一步大 量临床研究予以证实。 参考文献： 1 S t e i n h u b lSR ，B e r g e rPB ，M a n nJT ，e ta 1 E a r l ya
17、 n dS u s t a i n e d D u a lO r a lA n t i p l a t e l e tT h e r a p yF o l l o w i n gP e r e u t a n e o u sC o r o n a r yI n t e r v e n t i o n ：aR a n d o m i z e dC o n t r o l l e dT r i a l J J A M A ， 2 0 0 2 ，2 8 8 ：2 4 1 l - 2 4 2 0 2 3M a t e t z k yS ，S h e n k m a nB ，G u e t t aV C
18、 l o p i d o g r e lR e s i s t a n c ei s A s s o c i a t e dw i t h1 n c r e a s e dR i s ko fR e e u r r e n tA t h e r o t h r o m b o t i c E v e n t si nP a t i e n t sw i t hA c u t eM y o c a r d i a lI n f a r c t i o n J C i r e u l a t i o n ，2 0 0 4 ，1 0 9 ：3 1 7 1 - 3 1 7 5 3 3M o r e l
19、O ，O h l m a n nP ，J e s e lL V a r i a b l eE x t e n to fP l a t e l e tR e s p o n s i v e n e s st oC l o p i d o g r e lI n h i b i t i o n ：“C l o p i d o g r e lR e s i s t a n c e 蚪 J A n nC a r d i o lA n g e i o l ，2 0 0 5 。5 4 ：19 4 2 0 0 4 3 G a v i nJB ，R i d k e rPM N o v e lC l i n i
20、c a lM a r k e r so fV a s e u l a r W a l lI n f l a m m a t i o n J C i r c u l a t i o n ，2 0 0 1 ，8 9 ：7 6 3 7 7 1 5 G e i s l e rT ，L a n g e rH 。W y d y m u sM ，e ta 1 L o wR e s p o n s et oC I o p i d o g r e li sA s s o c i a t e dw i t hC a r d i o v a s c u l a rO u t c o m ea f t e rC o
21、r o n a r yS t e n tI m p l a n t a t i o n J E u rH e a r t 。2 0 0 6 ，2 7 ( 2 0 ) ：2 4 2 0 2 4 2 5 6 M u l l e rI ，B e s t aF ，S c h u l zC ，e ta 1 P r e v a l e n c eo fC l o p i d o g r e l N o n r e s p o n d e r sa m o n gP a t i e n t sw i t hS t a b l eA n g i n aP e c t o r i s S c h e d u l
22、 e df o rE l e c t i v eC o r o n a r yS t e n tP l a c e m e n t J T h r o m b H a e m o s t ，2 0 0 3 ，8 9 ( 5 ) ：7 8 3 7 8 7 7 3 B e n n e t tMR ，O S u l l i v a nM M e c h a n i s m so fA n q g i o pL a s t ya n d S t e n tR e s t e n o s i s ：I m p l i c a t i o n sf o rD e s i g no fR a t i o n
23、 a lT h e r a p y J P h a r m a e o lT h e r ，2 0 0 1 ，9 1 ( 2 ) ：1 4 9 1 6 6 8 3 B o n e l l oL C a m o i nJ a uL A d j u s t e dC l o p i d o g r e lL o a d i n gD o s e s A c c o r d i n gt oV a s o d i l a t o r - s t i m u l a t e dP h o s p h o p r o t e i nP h o s p h o r y l a t i o nI n d e
24、 xD e c r e a s eR a t eo fM a j o rA d v e r s eC a r d i o v a s c u l a r E v e n t si nP a t i e n t sw i t hC l o p i d o g r e lR e s i s t a n c e ：aM u l t i e e n t e r R a n d o m i z e dP r o s p e c t i v eS t u d y J A mC o i lC a r d i o l ，2 0 0 8 ，5 1 ( 1 4 ) ：1 4 0 4 - 1 4 1 1 9 3 X
25、 i a oz T h e r o u sP C l o p i d o g r e lI n h i b i t sP l a t e l e tL e u k o c y t eI n t e r a c t i o n sa n dT h r o m b i nR e c e p t o rA g o n i s tP e p t i d eI n d u c e d P l a t e l e tA c t i v a t i o ni nP a t i e n t sw i t hA c u t eC o r o n a r yS y n d r o m e J JA mC o l
26、lC a r d i o l ，2 0 0 4 ，4 3 ( 1 1 ) ：1 9 8 2 1 9 8 8 ( 责任编辑：况荣华) ( 上接第9 页) 作为组织工程的种子细胞，将M S C s 和表皮细胞种 植于已经制备好的脱细胞真皮上，分别构建皮肤真 皮与表皮替代成分，并将其共同移植于全层皮肤缺 损创面，取得了较好的促愈合效果。本研究结果显 示：( 1 ) 表皮干细胞和M S C s 作为种子细胞具有促进 创面愈合的作用，且愈合质量较高；( 2 ) 脱细胞真皮 接种细胞间充质干细胞、表皮干细胞植人，有利于创 伤愈合；( 3 ) 脱细胞真皮接种细胞间充质干细胞、表 皮干细胞植入后，创面沿表皮移
27、行加速，有利于创面 上皮化覆盖，可防止创面过度纤维化修复。因此，表 皮干细胞、间充质干细胞作为种子细胞构建复合替 代物可用于皮肤缺损，具有促进愈合，减少疤痕的作 用。 参考文献： 1 左金华，徐慧英，李佑成，等曲托通x 1 0 0 对制备脱细胞真皮 基质影响的实验研究 J 山东医药，2 0 0 5 ，4 5 ( 1 1 ) ：1 1 - 1 2 2 3 R h e i n w a l dJG ，G r e e nH S e r i a lC u l t i v a t i o no fS t r a i n so fH u m a nE p i d e r m a lK e r a t i n
28、 o c y t e s ：t h eF o r m a t i o no fK e r a t i n z i n g C o l o n i sf r o mS i n g l eC e l l s J C e l l 。1 9 7 5 ，6 ( 3 ) ：3 3 1 3 4 3 3 3o C o n n e rAF 。C o l m a nBH R y a nM U p t a r ea n dR e l e a s eo f A l c o h o lb yH o m o g r a f tT i s s u e si nT y m p a n o p l a s t y J A c
29、t a O t o l a r y n g o l ，1 9 7 6 ，8 1 ( 3 4 ) ：3 0 0 3 0 3 4 W a i n w r i g h tDJ U s eo fa nA c e l l u l a rA l l o g r a f tD e r m a lM a t r i x ( A l l o d e r m ) i nt h eM a n a g e m e n to fF u l lT h i c k n e s sB u m s J B u r n s 。1 9 9 5 2 1 ：2 4 3 5 3E a g l s t e i nWH ，F a l a n
30、 g aV T i s s u eE n g i n e e r i n ga n dt h eD e v e l o p m e n to fA p l i g r a faH u m a nS k i nE q u i v a l e n t J A d vW o u n d C a r e ，1 9 9 8 ：1 1 ( 4 ) ： 6 汪滋民，焦向阳。邢新皮肤组织工程 J 中国修复重建外科杂 志。2 0 0 0 ，1 4 ( 4 ) ：2 4 1 7 3 v a nD o r pAG ，V e r h o e v e nMC 。K o e r t e nHK ，e ta 1 D e r
31、 m a l R e g e n e r a t i o ni nF u l l t h i c k n e s sW o u n d si n Y u c a t a nM i n i a t u r e P i g sU s i n gaB i o d e g r a d a b l eC o p o l y m e r J W o u n dR e p a i rR e g e n 。1 9 9 8 6 ( 6 ) ：5 5 6 8 3 刘德伍，李国辉骨髓间充质干细胞复合胶原构建组织工程皮 肤修复皮肤缺损 J 中国临床康复，2 0 0 5 。9 ( 2 ) ：9 0 9 2 ( 责任编辑：况荣华) 万方数据