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1、急性心肌梗死心源性猝死 KCNJ11 基因 第 635 位点的多态性* 熊陈岭1 郑芳1 周新1 万军2 孙小波1 摘要 目的 研究急性心肌梗死 （AMI） 伴心律失常性猝死与 KCNJ11 基因的相关性。方法 应用聚合酶链式 反应 （PCR） 方法对一猝死家系从基因组 DNA 中扩增 KCNJ11 基因的全部外显子以及内含子与外显子交界部分， 并 将 PCR 产物进行测序， 以期发现与猝死相关的突变点， 并通过限制性内切酶对测序结果进行验证。结果 从测序 结果中发现了位于基因保守区的两个突变位点 A635G 和 C655T， 经证实仅 635 位点的突变存在并属于该位点的基 因多态性现象。结
2、论 KCNJ11 基因第 635 位点存在多态性， 其编码的离子通道在 AMI 诱发的心律失常猝死中可 能有重要作用。 关键词 心血管病学； 急性心肌梗死； 心源性猝死； 基因诊断 中图分类号 R542. 2 +2 R394 文献标识码 A 文章编号 1007 -2659 （2006） 01 -0035 -03 * 国家自然科学基金资助项目 （批号： C30200107） 作者单位： 1 武汉大学中南医院基因诊断中心 （湖北武汉 430071） 2 武汉大学人民医院心内科 作者简介： 熊陈岭 （1982 - ） ， 女 （汉族） ， 湖北麻城人， 硕士研究生， 研 究方向为遗传相关性疾病的基因
3、诊断。 通讯作者： 郑芳， 电话： 02761155235； E - mail： zhengfang whu. edu. cn The A635G polymorphism in KCNJ11 gene and its relation with sudden cardiac death of acute myocardiac infarc- tion. XIONG Chen-ling1， ZHENG Fang1， ZHOU Xin1， WAN Jun2， SUN Xiao-bo1. 1 The Gene Diagnosis Center，Zhongnan Hospital of Wuhan
4、University Wuhan 430071，China； 2 Department of Cardiology，Renmin Hospital of Wuhan University， Wuhan， China Corresponding author： ZHENG Fang Abstract Objective To study the relationship of the sudden cardiac death（SCD）in acute myocardiac infarction （AMI）and the KCNJ11 gene. Methods The complete codi
5、ng region and the intron-exon boundaries of KCNJ11 were am- plified from genomic DNA by the polymerase chain reaction. The products were then sequenced by standard methods. The restrictive endoenzyme was used to identify the mutated sequences. Results In sequencing reports，we found two mutation poin
6、ts（A635G &C655T）in a highly conserved region of the gene. Only A635G was identified and belonged to the gene polymorphism phenomenon. Conclusion There is polymorphism phenomenon in A635G gene region， which maybe play an important role in AMI SCD. Chinese Journal of Cardiac Pacing and Electrophysiolo
7、gy， 2006， 20 （1） ： 35 37 Key words Cardiology； Acute myocardiac infarction； Sudden cardiac death； Gene diagnosis 心源性猝死最常见于冠心病急性心肌缺血所导 致的致死性快速心律失常， 这可能与编码心肌离子 通道蛋白的基因突变导致心肌细胞膜离子通道功能 障碍有关。KCNJ11 基因编码心脏 ATP 敏感性 K + 通道亚单位 Kir 6. 2。有文献报道 KCNJ11 基因的变 异可能与冠心病猝死的发生有关 1。因此笔者对 一个猝死家系通过先证者的临床表现及心电图对其 进行鉴别诊断， 然
8、后通过家族史调查， 对该家系 KC- NJ11 基因进行扫描， 以期发现与猝死相关的突变 点。 1 资料与方法 1. 1 研究对象 此家系来自中国武汉， 家系 3 代人中突发 猝死者均为心肌梗死男性， 发病年龄均为 55 岁左右， 有长期 吸烟史， 冠心病家族史， 发病前无明显诱因， 发病时均伴有胸 前区剧烈疼痛。据调查得知先证者的父亲和长兄均因急性 心肌梗死 （AMI） 诱发猝死， 家族成员中女性目前未见任何明 显症状， 该家系图谱见图 1。先证者急诊入院时神志丧失， 心跳骤停， 立即予以胸外叩击， 胸外按压以及心肺复苏术。 同时心电监护提示室性心动过速， 随即演变成心室颤动， 以 200
9、J 非同步直流电除颤无效， 立即改用 300 J 进行， 心室颤 动终止， 患者恢复窦性心律后心电图显示为前壁心肌梗死。 1. 2 方法 1. 2. 1 血样标本的收集与处理 病例包括此家系的先证者 及家系成员， 取此家系成员外周静脉血 2 5 ml， 经 EDTA 抗 凝，- 20 保存。 其中先证者采血时间为急诊入院当天1h 53 中国心脏起搏与心电生理杂志 2006 年第 20 卷第 1 期 图 1 家系图 方块代表男性， 圆圈代表女性， 斜杠表示该成员 已去世， 黑色填充代表猝死， 空心代表未发病， 箭头所指 为先证者 以内完成， 而家系中其他成员则为清晨空腹采血。 1. 2. 2 模
10、板 DNA 的提取 采用改良 NaI 法 2提取外周静 脉血白细胞 DNA。 1. 2. 2 引物设计与合成 根据 GenBank NM000525 的参 考序列， 采用 Primer Premier 5. 0 软件进行引物设计， 由上海 基康公司合成。引物序列为：上游引物： 5GACTCTGCA GT- GAGGCCCTA 3， 下 游 引 物： 5 GCCGGGCTACATACCACAT 3。 1. 2. 3 多聚酶链式反应扩增 DNA 片段 25 l 反应体系中 包含 100 ng 基因组 DNA， 10 pmol 引物， 200 mol/ L dNTPs， 1. 5 mmol/ L M
11、gCL2， 10 反应缓冲液 2. 5 l， Taq 酶 1 U。反 应条件为 95预变性 5 min， 35 个循环 95变性 30 s， 65 退火 30 s， 72延伸 45 s， 然后72延伸10 min（Applied Bi- osystems，USA） 。反应结束后扩增产物经 2% 的琼脂糖凝胶 电泳加以验证。 1. 2. 4 聚合酶链式反应 （PCR） 产物直接测序 PCR 产物经 纯化后， 直接进行 DNA 测序， 采用 3700DNA 测序仪正反向 测序。 1. 2. 5 突变位点的确定及验证 应用 GenBank Blast 软件 将测序结果与 KCNJ11cDNA 全长进
12、行比对， 以确定突变位 点。为证实测序结果的可靠性， 采用巢式 PCR 的方法扩增 包含突变位点的序列， 经限制性内切酶酶切， 以核实突变位 点的真实性。 2 结果 PCR 扩增片断长度为 1316bp， 包括 KCNJ11 基 因的全部外显子以及内含子与外显子交界部分 （图 2） 。经测序发现先证者 KCNJ11 基因外显子中包含 两个突变位点： A635G 和 C655T （图 3， 4） ，其中 A635G 经 Ban限制性内切酶核实无误， 并且属于 该位点的基因多态性现象。但 C655T 位点经 Cac8I 限制性内切酶消化后， 其酶切片段与正常人并无差 别。 3 讨论 目前发现的与离
13、子通道基因突变相关的心源性 猝死类疾病有遗传性长 QT 综合征 （LQTS） 和 Bruga da综合征 （BS） 3 5。 本家系病例从临床表现和心 图 2 KCNJ11 基因部分片断测序结果 （包含两个突变位点） 图 3 KCNJ11 基因扩增产物电泳图 M： DNA Marker； 1： PCR 产物 （1 316bp） ； 2： 阴性对照 电图分析可排除患以上两种疾病的可能， 同时也未 见有任何心脏器质性的病变， 诊断为 AMI 伴急性缺 血性室性心动过速、 心室颤动而诱发猝死。此患者 因及时入院， 采取非同步直流电除颤后， 立即给予溶 栓和抗心律失常药物治疗才得以成功抢救。 KCNJ
14、11 定位于人类染色体 11P15. 1， 全长 3 418bp， 仅包含一个 1 173bp 的外显子， 编码 ATP 敏 感性钾离子通道 （KATP） 的亚单位内向整流钾通道 （Kir 6. 2） 。心脏 KATP是由四个内向整流钾通道 （Kir 6. 2） 和四个调节性磺脲类受体 （SUR2A） 组成 的八聚体， 首先于 1983 年由 Noma 6在心肌细胞上 发现， 其电生理学特性不同于其它类型的钾通道， 它 可产生微弱的内向电流， 通道的开和闭几乎与膜电 位无关， 而与胞内 ATP 浓度密切相关， ATP 的作用 位点位于 Kir 6. 2 上。 由 KCNJ11 基因编码的 Ki
15、r 6. 2 包含两个跨膜 区段， 并且形成钾离子孔道 7， 因此 KCNJ11 基因正 常与否与钾离子通道的功能密切相关。在生理状态 下， 心脏 KATP受高浓度 ATP 抑制， 处于关闭状态； 但 在缺血， 缺氧时通道开放， 介导心肌缺血保护或心肌 缺血预适应 8。大量研究表明， K ATP的开放可明显 改善心肌梗死的程度以及冠心病的预后。另外， 由 于 KATP所调控的 K + 在心肌动作电位的形成过程中 起着重要的作用， 因而 KATP与心律失常也有着密切 的联系 9。 基于以上原因， 德国Jeron等1研究了 63 急性心肌梗死心源性猝死 KCNJ11 基因第 635 位点的多态性
16、图 4 参考序列 NM000525 和 PCR 测序结果比对 KCNJ11 基因多态性与 AMI 并发猝死患者之间的关 系， 在猝死组 KCNJ11 基因上发现了两个错义突变 （P266T 和 R371H） ， 这两个突变均位于基因的保守 区， 并且导致了氨基酸序列的改变， 很可能影响该离 子通道与 ATP 的结合， 导致 KATP通道持续性开放， K + 外流增多， 动作电位时程过度缩短， 从而诱发折 返性心律失常。本实验并未发现 KCNJ11 基因突 变， 这可能与该家系的特殊性有关， 在该家系中男性 患者仅有 1 例因抢救及时而存活， 而第三代又全为 女性， 这给病例的收集造成了一定的困
17、难； 但是值得 注意的是， 在猝死患者中我们发现先证者的 KCNJ11 基因 635 位点的是 “G/ G” 基因型的纯合子， 据文献 报道该位点的单核苷酸基因多态性在人群中普遍存 在， 并且在高加索人群中 “A” 等位基因与 2 型糖尿 病高度相关 10， 11， 那么 “G” 等位基因是否与冠心病 以及猝死有关是一个很值得深入研究的问题。 参考文献 1 Jeron A， Hengstenberg C，Holmer S，et al. KCNJ11 polymorphisms and sudden cardic death in patient with acute myocardial in
18、farction J . J Mol Cell Cardiol， 2004， 36： 287 2 Leparev VN，Cantas MA，Monken CE，et al. An efficient and sim- ple method of DNA extraction from whole blood and cell line to iden- tify infectious agentsJ . J Virol Method， 1990， 34： 105 3 蒋文平. 膜离子通道与心律失常 J . 中华心血管病杂志， 2002， 30 （4） ： 198 4 李翠兰， 胡大一， 李运田
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