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1、2 4 应用 生垦塞旦医煎垫! Q 生兰旦复! 鲞筮! ! 塑坐塾璺匦丛鲤：血垫! Q ：! 生：! ，：! ! 自体细胞因子诱导杀伤细胞治疗肝硬 化对肝功能影响的研究 吕世长桑爱军 【摘要】目的观察自体细胞月子诱导杀伤细胞( C I K 细胞) 治疗慢性H B VD N A 阳性肝硬化患者 对肝功能的影响。方法C I K 细胞在体外培养前后以及回输体内后检测C D ；、C D ；C D 4 + 、C D ；C D s * 、 C D ；、c D 妄细胞以及m D C 和p D C 。治疗肝硬化患者，比较治疗前后病毒学指标及肝脏功能的变化。结果 培养结束以及回输体内后，C D ；细胞、C D
2、；C D ；细胞、C D ；、c D 矗细胞细胞较培养前显著升高，m D C 和 p D C 在回输后也明显增高，肝脏功能较治疗前有所好转。所有患者均能耐受治疗。结论C I K 细胞可明 显提高免疫效应细胞数量，具有一定的抗病毒效应作用，毒副作用低。没有加重肝脏损伤，而对于肝功 能有一定的改善作用。 【关键词】C I K 细胞；乙型肝炎肝硬化；肝功能 【A b s t r a c t 】O b j e c t i v e T oo b s e r v et h ea u t o l o g o u sc y t o k i n e - i n d u c e dk i H e rc e l l
3、 s ( C I Kc e l l s ) i nt h et r e a t - m e n to fc h r o n i c 咖VD N A - p o s i t i v ep a t i e n t sw i t I Ic i r r h o s i so ft h eh v e rf u n c t i o n M e t h o d sB e f o r ea n da f t e rC I K c e U si nv i t r oa n di nv i v od e t e c t i o no ft r a n s f u s i o nC D 3 ，C D 3 + C D
4、 4 + ，C D ；C D s “ ，C D ；，C D 盂c e l l sa n dm D C ，a n dp D C T r e a t m e n to fp a t i e n t sw i t hl i v e rc i r r h o s i sc o m p a r e db e f o r ea n da f t e rt r e a t m e n tv i r o l o g i c a li n d i c a t o r sa n df i v e rf u n c - t i o nc h a n g e s R a “ u l t s r e s u l t s
5、o fc u l t u r ee n da n dr e i n f u s i o ni nv i v o ，C D ；e e l s ，C D ；C D ；c e l l s ，C D ；，c D 未 c e l l s ，c u l t u r e dc e l l sw e 弛s i g n i f i c a n t l ye l e v a t e dc o m p a r e d ，m D Ca n dp D Ci ns i g n i f i c a n d yi n c r e a s e da f t e rt r a n s f u s i o n ，l i v e r
6、f u n c t i o nh a si m p r o v e dc o m p a r e dw i t hb e f o r et r e a t m e n t A l lp a t i e n t sc a nt o l e r a t et h et r e a t m e n t C o n d u - s i o nC I Kc e l l sc B ns i g n i f i c a n t l yi n c r e a s et h en u m b e ro fi m m u n ee f f e c t o rc e H s w i t hac e r t a i
7、na n t i v i r a le f f e c t o f t h er o l eo fl o wt o x i c i t y T h e r ea r e n oa g g r a v a t i n gf i v e rd | l l 学，f i v e rf u n c t i o na n df o rac e r t a i nd e g r e eo fi m p r o v e - m c n t 【K e yw o r d s 】 C I Kc e l l s ；H e p a t i t i sB ；C i r r h o s i so ff i v e rf u
8、 n c t i o n 在H B V 持续复制的肝硬化患者中，肝脏炎性纤维化持续 进展并且坏死特别严重。C I K 细胞治疗H B V 时可诱导激活 作者单位：2 6 0 0 1 0 山东省济南市惠仁中医院( 吕世长) ；山东省 究矿集团东滩医院( 桑爱军) 特异性细胞免疫反应。用于治疗慢性乙型肝炎报道有一定疗 效，本文观察C I K 细胞治疗慢性H B VD N A 阳性肝硬化对 肝功能的影响报告如下。 1 资料与方法 1 1 入选病例6 6 例住院患者，年龄3 6 6 7 岁( 4 7 2 岁) 所 结果显示实验组各时间段的成骨效果均优于对照组。单纯的 B M G 虽然可以对缺损局部正常
9、存在的M S C s 提供支架和生长 的空间，并在B M G 中含有的B M P 的诱导下定向分化为成骨 细胞，但是此类存在的干细胞数量太少，无法满足成骨要求， 成骨与材料的吸收速率失调。骨组织的重建是一个系列性的 复杂过程，首先需要把种子细胞植入或者招募到缺损部 位“，在局部微环境的成骨诱导下，向成骨性细胞分化，然后 成骨细胞进一步发生至成骨细胞钙盐沉积到基质上“。本 实验的实验组大量复合到载体中的M S C s 在B M P 和缺损局 部一些生长因子的诱导下，基本能够满足修复骨缺损的要求。 参考文献 1 G r e e nM T B e h a v i o ro fr a b b i tc
10、 h o n d r o c y t e sd u r i n gt i s s u ee u h r ea n d s u b s e q u e n ta l l o g m f t i n g C l i nO r t h o p 1 9 7 7 ，1 2 4 ：2 3 7 2 U r i s tM R B o n ef o r m a t i o nb ya u t o i n d u c t i o n S c i e n c e ，1 9 6 5 ， 1 5 0 ：8 9 3 3 J u nY a o ，S h u l aR a d i n ，G w e n d o h nR e
11、i l l y 。e la 1 S o l u t i o n m e d i a t e d e f f e c to fb i o a c t i v eg l 8i np o l y ( 1 a c t i c c o g l y c l i ea c i d ) - b i o a c t i v eg l s c o m p o s i t e so no s t e o g e n e s i so fI n S a T O Ws t r s m a lc e l l s JB i o m e dM a t e r R e sA ，2 0 0 5 ，7 5 ( 4 ) ：7 9 4
12、 - 8 0 1 4 G a r yD B ，V i c t o rM G 。，A m o l dE P T h ee f f e c to fh i s t o c e m p a t i b i l i t y m a t c h i n go nc a n i n ef l D s e nb o n ea l l o g r a f t s B o n eJ i o n tS u r g ( A M ) 。 1 9 8 3 ，6 5 ：8 9 5 T s u c h i d a ，H ，H a s h i m m oJ ，C r s w f o r dE 。e ta 1 E n g i
13、n e e r e dA l l o g e - n e i cM e s e n c h y m a lS t e mC e l l sR e p a i rF e m o r a lS e g m e n t a lD e f e c ti n R a t s J O r t h o pR e s ，2 0 0 3 ，2 1 ( 1 ) ：“- 5 3 6 V a c a m iC A ，K i mW ，U p t o nJ ，e la 1 T i s s u e - e n g l n e e r e dg r o w t ho f b o n ea n dc a r t i l a g
14、 e T r a n s p l a n tP r o c ，1 9 9 3 ，5 ( 1 ) ：1 0 1 9 - 1 0 2 1 7 P e r k aC ，S c h u l t zO ，S p i t z e rI t S ，e la 1 S e g m e n t a lb o n er e p a i rb yt i s f l u e - e n g i n e e r e dp e r l e * t e a lc e l lt r a n s p l a n t s I r i t hb i o r e s o r b a b l ef l e e c e a n df i
15、b r i ns c a f f o l d si nr a b b i t s ，JB i o m a t e r i a l ，2 0 0 0 ，2 1 ( 1 1 ) ： 1 1 4 5 1 1 5 3 8 O r i iH ，S o t o m eS ，C h e nJ ，W a n gJ ，S h i n o m i y aK B e t a tr i c a l c i u m p h o s p h a t e ( b e l a - T C P ) g r a nc o m b i n e dw i t hb o n em w s t r o m a lc e i l s (
16、M S C s ) f o rp o s t e r o l a t e r a ls p i n ef u s i o n JM e dD e n tS c i ，2 0 0 5 ，5 2 ： 5 l _ 5 7 9 S h e aL D ，W a n gD ，F r a n c e s c h iR T ，e la 1 E n g i n e e r e db o n ed e v e l o p - m e n tf r o map r e - o s t e o b l a s tc e l ll i n eo nt h r e e - d i m e n s i o n a ls c
17、 a f f o l d s T i s s u eE n g 。2 伽1 0 。6 ：6 0 5 - 6 1 7 1 0 S h a n gQ ，W a n gz ，U uW ，e la 1 T i s s u e - e n g i n e e r e db o n er e p a i ro f s h e e pc r a n i a ld e f e c e sw i t ha u t o l o g o u sb o n em r o ws t r o m a lc e i l s C r a n i o f a cS u r g 。2 0 0 1 1 2 ( 6 ) ：5 8 6
18、 - 5 9 3 1 1 D o m i n i q u eP P i o l e l t i 。M a r cO l i v i e r ，M o n t j o v e n t ，e la 1 B o n et i s s u e e n g a 。n e e r i n gu s i n gk t a lc e l lt h e r a p y S w i s sM e dW l d y ，2 0 0 6 ， 1 3 6 ：5 5 7 - 5 6 0 1 2 D S Z h o u 。K B Z h a o ，Y L i ，e la 1 R e p a i ro fS e g m e n
19、 t a lD e f e c t s w i t h N a n o h y d r o x y a p a t i t e C o l l a g e n P L AC o m p o s i t eC o m b i n e d w i t hM e s e n c h y m a lS t e mC e l l s J o u r n a lo fB i o a c t i v ea n dC o m p a t i b l e P o l y m e r s 2 0 0 6 2 1 ：3 7 3 - 3 8 4 万方数据 生国塞厦医药垫! Q 生堡旦箜i 鲞筮! ! 塑g 坠坠堕必：
20、纽垫! Q ：型：。盟! ：! ! 有病例符合2 0 0 0 年西安学术会议制定的病毒性肝炎防治方案 诊断标准心 ，诊断为肝硬化，全部病例H B s A g 、H B c A g 、H B V D N A 阳性持续6 个月以上，H B e A S 阳性4 2 例，阴性2 4 例，其中 肝功能正常的5 例，肝功能异常的6 l 例。A L T 波动于正常至5 倍，T B i L 5 lp x n o l L ，肝脏功能c h i l d p u g h 评分为A 或B 级。 1 2 排除病例肝性脑病、消化道出血、重度感染或大量腹 水等严重并发症，半年内未使用过其他抗病毒药和其他免疫 调节剂；其他病
21、毒感染、酒精性、药物性肝病。 1 3 治疗方法与检测项目 1 3 1C I K 细胞的培养在患者签署知情同意书后，使用采 血机( S p e c 虹av6 11 ) 采集患者外周血单个核细胞，采集细胞数 约( 1 4 ) 1 0 9 ，容积4 0 7 0 “。在符合G M P 实验室条件 下，用无血清培养基调整细胞浓度至( 1 2 ) X1 0 0m l ，置于透 气性培养袋中，于不同时间加入一定剂量的r h I F N r ，I L 2 、a l l t i C D 3m A b ( 美国B D 公司) 等各种细胞因子，3 7 ，5 C 0 2 悬 浮培养。 1 3 2C I K 细胞悬液的
22、制备及回输：，于培养后的第1 0 天， 每次取C I K 细胞悬液的1 3 体积，离心、洗涤和重悬浮后制备 成容积为4 0 0 一5 0 0m l 的C I K 细胞悬液，将诱导培养成的C I K 细胞分3 次于培养的第l O 、1 3 、1 5 天回输给患者。 1 3 3 检测项目治疗前后询问病史，进行系统的体格检 查，检测血液生化指标、血液学指标、H B V 标志物以及H B V D N A 定量。 1 4 疗效判定对A L B 、T B I L 、A L T 、& S T 及A 分别进行疗 效判断。 好转：T B I L 、A L T 、A S T 、A L p 由异常转为正常和或数值下
23、 降5 0 ，A L B 由异常转为正常或升高5g 。 无变化：T B I L 、A L T 、& S T 、A L P 治疗前后均正常或数值变 化不超过5 0 ，A L B 均为正常或变化不超过5g 。 恶化：T B I L 、A L T 、A S T 、A L P 由正常转为异常或数值升高 超过5 0 ，A L B 由正常转为异常或下降5g L 。 1 5 统计学分析采用s t a t a7 0 软件，两组数据间的比较采 用配对t 检验。 2 结果 2 1 培养过程中C I K 细胞功能变化特点培养1 0d 后，采 用流式细胞仪对C O ；、c D fC D ；、C D ；C D s *
24、、C D ；、c D 未、c D 未 细胞进行测定和分析。发现细胞表型发生了变化，主要表现 在C D ；T 细胞、C D 3 C D s + T 细胞以及c D 未T 细胞比例增高，尤 其以C D ；、c D 未细胞升高为显著。 2 2 治疗前后血液生化和血常规指标变化C I K 细胞治疗 前后观察T P 、A L B 、G L O 、T B I L 、D B I L 、A L T 、A S T 、A L P 以及血常 规中W B C 和P L T 的变化( 表1 ) 。 表1C I K 细胞治疗前后血液生化及血常规指标变化( 舅4 - s ) 指标 治疗前治疗后P 值 1 1 P ( g P
25、 L ) 6 5 1 7 5 7 1 34 - 5 70 0 0 A L B ( g P L ) 3 5 9 4 53 9 6 4 70 0 0 G L O ( g P L ) 2 9 4 6 13 1 9 5 20 0 0 T B I L ( p , m o l P L ) 2 2 6 1 4 21 8 1 1 2 20 0 3 D B I L ( p m o I P L ) 9 7 8 I8 5 8 3 0 2 9 A L T ( U P L ) 7 7 24 - 5 4 74 8 2 4 4 20 0 1 A S T ( U P L ) 8 4 1 + 5 6 1 5 7 3 3 4 8
26、0 0 2 A L P ( U P L ) 1 3 7 6 5 7 9 1 3 3 2 6 8 4 0 6 3 w s c ( 1 0 9 P L ) 5 1 1 7 5 1 1 30 6 1 坚( ：! Q ：堕2 11 1 ：! 圭! ! ：! 兰! ：! 圭塑：!Q ：i 1 2 3 治疗前后肝脏功能疗效判断为了进一步分析C I K 细 胞治疗后对于肝脏功能的影响，对每例患者进行了疗效判断， 治疗后好转的T P 、A L B 、G L O 、T B I L 、A L T 以及& S T 各指标中 A L T 好转率最高，有3 4 例好转( 5 1 5 ) ，6 例恶化( 9 0 9 )
27、。 其余各指标以无变化的患者为多。 2 5 2 4C I K 细胞治疗后对于病毒学指标的影响 C I K 细胞治 疗后。4 2 例H B e A g 阳性的患者有3 1 例阴转，其中8 例出现 H B e A g ，抗H B e 转换，6 6 例H B VD N A 阳性的患者2 6 例阴转， 部分患者拷贝数降低。 2 5 不良反应免疫活性细胞回输后患者可出现一过性类 流感样症状，如发热( 体温3 7 5 3 9 5 ) ，轻度头痛、乏 力、关节酸痛，持续时间均不超过1 2h ，可自行缓解，所有患者 均能很好耐受治疗。 3 讨论 慢性乙型肝炎患者中，肝硬化失代偿的年发生率约3 ， 5 年累计发
28、生率约1 6 【3J 。失代偿期肝硬化的5 年病死率为 7 0 8 6 。经抗病毒治疗后H B e A g 血清转换，H B V D N A 持 续转阴和A LT 持续正常者的生存率较高HJ 。由于a _ 干扰素 的不良反应和拉米夫定的高耐药病毒突变，对这类患者还没 有很有效的、可耐受的抗病毒治疗。J 。C I K 细胞是经多种细 胞因子诱导培养的一群异质性杀伤细胞，可分泌I I 。- 2 、I L - 6 、 I F N - 1 等多种细胞因子，激活机体免疫系统，提高机体的免疫 功能。其抗病毒作用可能是多种细胞因子和抗体协同作用， 通过促进T 淋巴细胞高表达I L - 2 受体，产生大量I
29、L - 2 使T 淋 巴细胞活化来实现的。C I K 细胞中的主要效应细胞为 C D ；c D 未细胞，其在正常人外周血中极罕见，仅I 一5 。 在体外经多种细胞因子刺激培养后，C D ；c D 未细胞迅速增多， 可较培养前升高10 0 0 倍以上。C D ；C D s * 细胞也可从培养前 的2 0 上升到6 0 一8 0 J 。本文结果显示C I K 细胞不论 在体外培养过程中，还是在回输体内后，C D ；C D s 细胞、 C D ；c D 未细胞均明显增高。 本文观察了免疫活性细胞治疗对H B V 感染肝病患者肝 功能的影响，结果发现治疗后T P 、A L B 、G L O 、T B
30、I L 、A L T 以及 A S T 均较前明显好转P O 0 5 ) ，这些指标大多与肝脏的活动 性炎症损伤相关。而与肝脏的慢性损伤相关的A L P 、W B C 及 P L T 等指标无明显变化。因考虑到部分患者在治疗前肝功能 指标正常或轻度异常，C I K 治疗后有可能出现在较小范围内 变化，因此进一步针对这些指标分别进行了疗效观察，结果表 明仅有少数患者出现恶化，用C I K 细胞治疗H B V 慢性感染患 者，可能有一定的抗病毒效应并能够改善机体的免疫功能失 调状况，因此没有加重肝脏损伤，而对于肝功能有一定的改善 作用，值得推广应用。 参考文献 1 中华医学会传染病与寄生虫病学分会
31、、肝病学分会病毒性肝 炎防治方案肝脏2 0 0 0 。5 ：2 5 7 - 2 6 3 2 V e m e r i sM R ，K o m a c k e rV 。M a i L a n d e rV ，e ta 1 R e s i s t a n c eo fe xv i - v o e x p a n d e dC D ；c D 品Tc e i l st oF a s 2m e d i a t e da p o p t p o s i s C a n c e r I m m u n o l I m m u n o t h e r 2 0 0 0 4 9 ：3 3 5 3 4 5 3 A l
32、 b e r t iA ，A l t e rM B e n h a m o uY ，e ta 1 E A S LI n t e r n a t i o n a lC o n 酏n S U SC o n f e r e n c eo nH e p a t i t i sB JH e p a t o l ，2 0 0 3 ，3 9 ( S u p p l ) ：3 - 2 5 4 L i a wY F 。S u n gJ J ，C h o wW C ，e t8 1 1 a m i v u d i n ef o rp a t i e n tsw i t h c h r o n i eh e p a
33、t i t i sBa n dM v m c e dl i v e rd i s e a s e NE n g lJ M e d ， 2 0 0 4 ，3 5 1 ：1 5 2 1 1 5 3 1 5 L i a wY F ，C h i e nR N ，Y e hc T ，e ta 1 A c u t ee x a c e r b a t i o na n d h e p 2 a t i t i sBv i r u sc l e a r a n c ea f t e re m e r g e n c eo fY M D Dm o t i fm u t a 2 t i o nd u r i n
34、gl a m i c u d i n eth e m p y H e p a t o l o g y ，1 9 9 9 ，3 0 ：5 6 7 - 5 7 2 6 D u d l e yM E ，W u n d e r l i e hR ，R o b b i n sP F ，e ta 1 C a n c e rr e g r e s s i o na n d a u t o i m m u n i t yi np a t i e n t8a f t e r c l o n a lr e p o p u l a t i o nw i th a n t i 2t u m o r l y m p h o c y t e s S c i e n c e ，2 0 0 2 ，2 9 8 ：8 5 0 - 8 5 4 7 】s c h m i d t - W o I fG D nR s 。S c h m i d t W o f fI G A c t i v a t e dT c e l l s a n de y t o k i n e i n d u c eC D ；C D 五k i l l e rc e l l s A n nH e 2m a t o l ，1 9 9 7 ，7 4 ( 2 ) ：5 1 - 5 6 万方数据