姜黄素抑制淋巴瘤细胞周期蛋白水平的研究.pdf

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1、中国医院药学杂志2 0 0 6 年第2 6 卷第2 期C h i n H o s p P h a r m J , 2 0 0 6 F e b , V o l 2 6 , N o . 0 2 研 究 论 文 1 21 姜黄素抑制淋巴瘤细胞周期蛋白水平的研究 吴青， 陈燕， 李新刚 ( 华中 科 技大 学同 济医 学 院 附 属 协 和 医 院 血 液 病 研 究 所， 湖 北武 汉4 3 0 0 2 2 ) 摘要 目 的: 探讨 姜 黄素 对 淋巴 瘤细 胞 株R a j i 细 胞增殖 和细 胞周 期的 影响。 方 法: 6 . 2 5 - 1 0 0 ji m o l “ L - 的 姜 黄

2、素分 别处 理 R a j i 细胞1 2 - 6 0 h 后， M TT 法检测R a j i 细胞的生长活性; 流式细胞仪( F C M ) 检测细胞凋亡; 蛋白印迹法( W e s t e rn B l o t ) 分析姜 黄素作用前后， 肿瘤细胞中 周期蛋白E以及相应视网膜母细胞瘤基因R b 的表达。结果: 姜黄素可呈时间及剂量依赖性抑制 R a j i 细 胞的增殖， 抑制率为5 9 . 8 3 %- 9 1 . 4 6 %。流式细胞仪检测R a j i 细胞， 凋亡率为1 4 . 3 8 %一 6 1 . 1 8 %。 姜黄素刺激R a j i 细 胞2 4 h内 周期蛋白E 和视

3、网膜母细胞瘤基因R b 蛋白 表达显著增强( P 9 9 %, 溶解于 二甲基亚矾， D M S O ， 分装备用) ; 澳化二甲嚷哇二苯 四氮噢( M TT， 美国S i g m a 公司) ; 培养基R P M I - 1 6 4 0 ( 美国G i b c o 公司) ; 胎牛血清( 中山凌飞公司) ， 淋 巴瘤细胞株R a j i 细胞( 上海科学院细胞中心) ; 在含 有1 0 %的胎牛血清、 青霉素1 0 0 m g “ L - 及链霉素 1 0 0 m g “ L 一 的R P M I - 1 6 4 0 培养基中3 7 , 5 %二氧 化碳条件下培养。 【 甚金项目 国家自 然

4、科学基金项目 ( 编号: 3 0 2 7 1 6 7 2 ) 【 作者简介 吴青， 女， 博士， 主治医师， 电话: 0 2 7 - 6 1 0 2 1 8 3 9 , E - m a i l ; w u g i n g 1 2 2 1 2 1 e n . c o m 通讯作者陈燕， 男， 教授， 主任医师， 博士生导师 1 2 2 2 方法 2 . 1 细胞体外生长活性检测 中国医院药学杂志2 0 0 6 年第2 6 卷第2 期C h i n H o s p P h a r m J , 2 0 0 6 F e b , V o l 2 6 , N o . 0 2 细胞体外生长活跃， 经6 .

5、2 5 一 1 0 0 R m o l - L 一 的姜黄 采用嗅化二甲唆哩 二苯四氮哇( M TT ) 比色法检测， 取对数生长期的 R a j i 细胞进行实验， 将不同浓度的姜黄素6 . 2 5 一 1 0 0 R m o l “ L 一 加人1 0 % F C S 的R P M I - 1 6 4 0 完全培养 液中， 调节细胞浓度为5 X 1 0 个 L - 1 ， 同时取未加 姜黄素的为对照组， 根据实验设计， 分为如下两种细 胞培养方法: ( 1 ) 姜黄素单独处理组， 使其终浓度为 6 . 2 5 , 1 2 . 5 , 2 5 , 5 0 , 1 0 0 L m o l “

6、L 一 ; ( 2 ) 对照组( 未加 姜黄素组) 接种于% 孔板， 每种药物浓度为一组， 每个浓度3 个平行孔， 上述两组处理的R a j i 细胞， 置5 %二氧化碳、 3 7培养箱培养不同时间( 1 2 , 2 4 , 3 6 , 4 8 , 6 0 h ) 后， 每孔加M TT 2 0 IA， 培养4h ， 弃 M TT， 每孔加二甲基亚矾 1 5 0 t ,L ， 充分溶解。选择 4 9 0 n m波长， 酶联免疫检测仪上测定各孔A值。肿 瘤细胞的生长抑制率二 ( 1 一 实验组平均A值/ 对照 组平均A 值) x 1 0 0 %。 2 . 2 流式细胞仪检测细胞凋亡取对数生长期细

7、胞用含 1 0 %的小牛血清的 R P M I - 1 6 4 0培养液将细 胞配成1 x 1 0 9 个 L 一 ， 取2 4 孔板， 每孔加人稀释好 的 细胞5 m L ， 分别按终浓度为6 . 2 5 , 1 2 . 5 , 2 5 N .,m o l L - 加人姜黄素。用7 0 %乙醇4固定2 4 h , P B S 缓冲液洗去固定液， 用缓冲液3 7孵育6 0 m i n ， 用 1 9 5 IA细胞悬液加5 p ,L A n n e x i n - V - F I T C 。混匀， 室 温温浴1 0 m i n 。 用缓冲液洗涤细胞1 次， 在1 9 0 p ,L 缓冲液重悬，

8、然后再加5 L L 碘化丙陡。上流式细胞 仪检测。A n n e x i n - V - F I T C和P I 双阴性为活细胞; A n n e x i n - V - F I T C阳性而 P I 阴性为早期凋亡细胞; A n n e x i n - V - F I T C和P I 双阳性为晚期凋亡细胞; A n - n e x i n - V - F I T C阴性而P I 阳性为坏死细胞。 2 . 3 细胞蛋白质样品制备及蛋白定量经处理后 的细胞立即弃去培养液， 洗涤， 离心。加预冷的细胞 裂解液( 0 . 1 m o l “ L 一 氯化钠， 0 . 0 1 m o l “ L 一

9、T r i s 盐 酸， p H 7 . 6 , 0 . 0 0 1 m o l L 一 E D T A , 1 0 0 m g L 一 P M S F , 2 m g “ L 一 L e u p e p t i n ) 0 . 1 m L ， 裂解3 0 m i n ， 然 后于1 0 0 0 0 g 离心1 0 m i n ， 取上清备用。以上所有 操作均在4下进行。测定蛋白， 并调各组蛋白浓 度一致。 2 . 4 W e s t e rn B l o t 按W e s t e r n B l o t 方法检测细胞 周期蛋白E , R b ， 其中一抗为鼠抗， 二抗用辣根过氧 化 物 酶(

10、 H R P ) 标记羊抗鼠I g G ， 经 化学发 光法 , X 线曝光显影， 软件进行扫描定量， 每个浓度组重复3 次， 取均值代表测定结果。 3 结果 3 . ， 姜黄素对R a p细胞的抑制作用 对照组R a j i 素处理1 2 - 6 0 h 后， R a j i 细胞生长均不同 程度的减 慢， 并呈时间、 浓度依赖性。与对照组相比， 各浓度 姜黄素作用6 0 h 一后 R a j i 细胞生长率在5 9 . 8 3 %- 9 1 . 4 6 %之间， 见图1 0 遥哥茶早 6 . 2 5 1 2 . 5 2 5 5 0 l o o C l u m o I t L 一 图1 不同

11、浓度的姜黄素对R a j i 细胞生长的抑制作用 F i g 1 G ro w t h i n h i b i t i o n p e r c e n t ( %) o f R a j i c e l l o f d if f e r e n t c o n c e n t r a - t i o n a t v a rio us t i me 1 - 1 2 h , 2 - 2 4 h , 3 - 3 6 h , 4 - 4 8 h , 5 - 6 0 h 3 . 2 R a j i 细胞凋亡率的变化R a j i 细胞经6 . 2 5 一 2 5 L m o l - L 一 姜黄素分别作用

12、2 4 h 后， 随着姜黄素 浓度提高， 早期凋亡率逐渐增加， 两种浓度的药物与 对照组比较均能明显诱导细胞凋亡( P 0 . 0 5 ) ， 见表1 。 表， 不同浓度姜黄素作用2 4 h 诱导R a j i 细胞凋亡 T a b 1 A p o p t o s i s p e r c e n t ( %) i n d u c t e d b y v a ri o u s c o n c e n t r a - t i o n o f c u r c u m i n i n R a j i c e l l a t 2 4 h 姜 黄 素 / C M 0 1 “ L 一 对照品 6 . 2 5

13、 1 2. 5 2 5 2 4 h凋亡细胞率/ % 0 . 0 7 0 1 0 . 0 1 0 1 4 . 3 8士0 . 0 3 4 1 . 1 3 0士 0 . 0 2 0 “ 6 1 . 1 8 0士 0 . 0 1 0 , 注: 与对照组比较， P 0 . 0 5 ) ， 但随着姜黄素浓度的增高c y c l i n E和R b 的 蛋白水平显著下降并呈浓度依赖性。这和文献报道 的 结果 川类似。本研究发现， 姜黄素在体外能显著 抑制淋巴 瘤细胞系R a j i 细胞的生长并呈时间一 剂量 依赖性， 通过下调c y c l i n E和R b 基因的表达来诱导 细胞凋亡， 可能是其重要

14、的机制。 参考文献: 1 M a n T H , Y o u R L , W e i M, e t a l . I n h i b i t o ry e f f e c t o f d i e t a ry c u r c u - m i n o n f o re s t o m a c h , d u o d e n a l a n d c o l o n c a r c i n o g e n e s i s i n m i c e J . C a n c e r R e s , 1 9 9 4 , 5 4 ( 1 ) : 5 8 4 1 - 5 8 4 7 . 2 S c o t t K

15、 A , W a l k e r R A . l a c k o f c y c l i n E i m m u m o r e a c t i v i t y i n m o n a m - l i g n a n t b re a s t a n d a s s o c i a t i o n w i t h p r o li f e r a t i o n i n b r e a s t c a n c e l J . B r J C a n c e r , 1 9 9 7 , 7 6 ( 1 0 ) : 1 2 8 8 - 1 2 9 2 3 梁国栋. 最新分子生物学实验技术【 M .

16、 北京: 科学出版社， 2 0 0 1 . 1 4. 4 P a r k M J , K i m E H , P a r k I C , e t a l . C u r c u i n i n h i b i t s c e l l c y c l e p ro g r e s s i o n o f i m m o rt a l i z e d h u m a n u m b i l i c a l v e i n e n d o t h e l i a l ( E C V 3 0 4 ) c e ll s b y u p - r e g u l a t i n g c y c l i n

17、- d e p e n d e n t k i n a s e i n h i b i - ta r , P 2 1 W A n / c tP I ， P 2 7 K IP a n d P 5 3 J . I n te rn a t io n a l j o u r n a l o f o n - c o lo g y , 2 0 0 2 , 2 1 : 3 7 9 - 3 8 3 . 5 C h o u d h u r i T , P a l S , A g w a r w a l M L , e t a l . C u r c u m i n i n d u c e d a p o p -

18、 t o s i s i n h u m a n b re a s t c a n c e r c e l l s t h ro u g h p 5 3 - d e o e b d e b t B a x i n - d u c t i o n J . F E B S L e t t e r s , 2 0 0 2 , 5 1 2 : 3 3 4 - 3 4 0 . 6 D u v o i x A , M o e e a u F , D e l l h a l l e s , e t a l . I n d u c ti o n o f a p o p to s i s b y c u r c

19、 u m i n : m e d i a t i o n b y g l u t a t h i o n e S t r a n s f e r a s e P I - 1 i n h i b i t io n J . B i o c h e m i P h a r m a c o 1 , 2 0 0 3 , 6 6 ( 8 ) : 1 4 7 5 - 1 4 8 3 . 7 L u n d b e r g A S , W e i b e r g R A . F u n c t i o n a l i n a c t i v a t i o n o f t h e r e t i n o -

20、b l a s t o m a p r o t e i n r e q u i r e s s e q u e n t ia l m o d i f i c a t i o n b y a t l e a s t t w o d i s t i n e r c y c l i n c d k c o m p l e x e s J . M o l C e l l B i o l , 2 0 0 0 , 1 8 ( 1 1 ) 7 5 3 一6 2 . , r 8 了 S c u d e r i R , Y a s u i W , Y o k o z a k i H , e t a l . F

21、r e q u e n t a m p l if i c a t io n o f t h e c y c l i n E g e n e i n g a s t ric c a r c i n o m a s J ， C a n c e r R e s , 2 0 0 1 , 1 0 ( 6 ) : 3 3 6 0 - 3 3 6 7 . 9 S a u e r b r e y A , S t a m m l e r G , Z i n t l F , e t a l . E x p r e s s i o n o f t h e r e t i n o - b l a s t o m a

22、t u m o r s u p p r e s s o r g e n e ( R b - 1 ) i n a c u t e le u k e m i a J . L e u k L y m p h o m a , 1 9 9 8 , 2 8 ( 3 - 4 ) : 1 3 8 2 - 1 3 9 0 1 0 S c u d e r i R , P a l u c k a K A , P o d r o v s k a j a K , e t a l . C y c l i n E o v e r e x p r e s - s i o n i n r e l a p s e d a d u

23、 l t a c u t e l y m p h o b l a s t i c l e u k e m i a s o f B - c e l l l i n e - a g e J . B l o o d , 1 9 9 6 , 8 7 ( 8 ) : 3 3 6 0 - 3 3 6 7 . 仁 1 1 L i d a H , T o w a t a r i M , T a n m o t o M , e t a l . O v e r e x p r e s s i o n o f c y c l i n E i n a c u t e m y e l o g e n o u s le

24、u k e m ia J . B l o o d , 1 9 9 9 ， 1 1 ( 9 ) : 3 7 0 7 - 3 71 3. 收稿日 期 2 0 0 5 -0 5 -0 7 中国汉族、 维吾尔族、 哈萨克族人群中可溶性细胞钻附分子的表达与 C Y P 2 D 6 基因多态性 李国昌， 杨军， 周婷， 陈志刚 ( 石 河 子 大 学医 学院 第 一 附 属医 院， 新 疆石 河 子8 3 2 0 0 8 ) 摘要 目的: 探讨可溶性细胞钻附分子一 1 在汉族、 维吾尔 族、 哈萨克族正常人血清中的表达水平是否存在民族间差异以及 与C Y P 2 D 6 基因多态性是否有关。方法: E L

25、 I S A双杭体夹心法。结果: 血清中可溶性细胞私附分子一 1 含量: 汉族为3 5 - 1 0 8 6 t g - L - 1 ， 维 吾尔 族为4 0 - 1 0 2 4 N .g - L - ， 哈萨 克 族为4 5 - 9 7 5 p ,g - L - 。 结 论: 可 溶性细 胞钻附 分子 一 1 的 含量 在汉 族与维 吾尔 族、 汉族与哈萨克族、 维吾尔族与哈萨克族之间差异均无显著性。 关键词l 汉族; 维吾尔族; 哈萨克族; 可溶性细胞钻附分子一 1 ; C Y P 2 D 6 ; 多态 性 中图分类号I R 9 6 9 文献标识码 A 文章编号 1 0 0 1 - 5 2 1 3 ( 2 0 0 6 ) 0 2 -0 1 2 3 - 0 3 基金项目 国家自 然科学基金项目 ( 编号: 3 9 9 6 0 0 8 0 ) 作者简介 李国昌， 男， 主任药师， 电话: 0 9 9 3 - 2 8 5 0 5 3 0 , E - m a i l : l i g u o c h a n g 2 0 0 5 1 2 6