库容性CA2内流参与ACH诱导的大鼠远端结肠平滑肌收缩.pdf

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1、生理学报 Acta Physiologica Sinica, April 25, 2006, 58 (2): 149-156 http:/ 149 研究论文 Received 2005-12-08 Accepted 2006-02-13 This work was supported by the Science Foundation of Education Department of Anhui Province (NO. 2005KJ242). * Corresponding author. Tel: +86-551-5161143; Fax: +86-551-5161126; E-ma

2、il: 库容性库容性 Ca2+内流参与内流参与 ACh 诱导的大鼠远端结肠平滑肌收缩诱导的大鼠远端结肠平滑肌收缩 孔德虎1,*，周 华1，宋 洁1，柯道平1，胡金兰1，李忠稳1，马 嵘1,2 1安徽医科大学生理学教研室神经生理实验室，合肥 230032；2美国德州北方大学卫生科学中心生理学系，德克萨斯州 76107 摘摘 要：要：应用生物换能技术和 Ca2+ 通道特异性阻断剂观察并记录大鼠离体远端结肠平滑肌收缩张力的变化，分析库容性 Ca2+内流(capacitative Ca2+ entry，CCE)是否与ACh 诱导的离体远端结肠平滑肌收缩反应有关。结果表明，以无钙的Krebs 液灌流或

3、应用 EGTA螯合细胞外Ca2+后，高 K+及ACh 引起的远端结肠平滑肌收缩几乎完全消失。电压操纵性Ca2+通道阻 断剂verapamil也能减弱高K+及ACh 引起的远端结肠平滑肌收缩，其减弱的程度分别为74% 和41%。在无钙的Krebs 液中， 5 mol/L ACh 可引起离体肠管瞬时性收缩，这是由肌质网(sarcoplasmic reticulum，SR)释放钙所致；然后加入10 mol/L 阿 托品(atropine)，并在此基础上恢复细胞外 Ca2+ (2.5 mmol/L)，结肠平滑肌则出现持续性收缩，待收缩反应达峰值时，加 入5 mol/L verapamil，收缩无明显变

4、化，且该收缩反应对钙库操纵性通道(store-operated Ca2+ channel，SOCC)阻断剂La3+ 敏感，20，50 和 100 mol/L 的 La3+使上述收缩张力分别降低 15%，23% 和 36%，且呈浓度依赖性，但对 Cd2+不敏感。 研究结果提示，细胞外Ca2+内流对高K+及 ACh 介导的离体远端结肠平滑肌持续性收缩是必需的，由ACh 诱导的远端结肠 平滑肌收缩至少包括SR 释放钙引起的短暂性收缩及受体操纵性Ca2+通道(receptor-operated Ca2+ channel, ROCC)、电压操纵 性Ca2+通道(voltage-operated Ca2+

5、 channel, VOCC)和CCE介导的胞外Ca2+内流等途径。这将从通道水平进一步分析消化管平滑 肌收缩的机制和特征，亦将为预防和控制因胃肠动力紊乱所致的消化管疾病寻求有针对性的药物干预和治疗提供理论依据。 关键词：关键词：库容性Ca 2 + 内流；钙库操纵性通道；乙酰胆碱；阿托品；镧；平滑肌；结肠；大鼠 中图分类号：中图分类号：R329.2; R322.4 Capacitative Ca2+ entry is involved in ACh-induced distal colon smooth muscle contraction in rats KONG De-Hu1,*, ZHO

6、U Hua1, SONG Jie1, KE Dao-Ping1, HU Jin-Lan1, LI Zhong-Wen1, MA Rong1,2 1Laboratory of Neurophysiology, Department of Physiology, Anhui Medical University, Hefei 230032; 2Department of Integrative Physiology, University of North Texas Health Science Center, Texas 76107, USA Abstract: Contraction of

7、smooth muscle cells is triggered by an increase in cytosolic Ca2+ upon agonist stimulation. Ca2+ influx across the plasma membrane constitutes a major component of the agonist-induced response in smooth muscle cells. Traditionally, voltage- operated Ca2+ channel (VOCC) is considered as the channel m

8、ediating the Ca2+ entry. However, this view has been challenged by recent discoveries, which demonstrated that other types of ion channels, such as store-operated and/or receptor-operated Ca2+ channels (SOCC and/or ROCC), also participate in Ca2+ response induced by agonists in smooth muscle cells.

9、SOCC is defined as the channel activated in response to the depletion of the internal Ca2+ stores, an event secondary to G protein coupled receptor or receptor tyrosine kinase stimulation. The Ca2+ flow mediated by SOCC is termed as capacitative Ca2+ entry (CCE). Previous study from other group has

10、demonstrated that VOCC played a predominant role in ACh-induced contraction of distal colon smooth muscle in guinea pig. However, whether SOCC participates in the agonist-induced contractile response in this particular tissue is unknown. The present study was performed to investigate the role of CCE

11、 in ACh-induced mechanical activity of distal colon smooth muscle in rats. The contractile function of the smooth muscle was assessed by measuring isometric force of isolated rat distal colon rings. We showed that both high extracellular K+ (40 mmol/L) and ACh (5 mmol/L) evoked striking contraction

12、of the smooth muscle. The contractile responses were almost abolished by removal of extracellular Ca2+ with ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N,N tetraacetic acid (EGTA), 生理学报 Acta Physiologica Sinica, April 25, 2006, 58 (2): 149-156 150 suggesting a critical contribution of extracellular s

13、ource of Ca2+ to the contraction. Verapamil (5 mol/L), an L-type VOCC blocker, significantly attenuated, but didnt completely eliminate the high K+- and ACh-induced contraction (74% and 41% for high K+ and ACh, respectively), indicating that additional channels might be involved in the contractile m

14、echanism. Furthermore, ACh only induced transient contractions in the absence of extracellular Ca2+. Readmission of Ca2+ into the extracellular compartment resulted in a significant and sustained increase in the tension of the smooth muscle. This response was not affected by verapamil (5 mol/L) and

15、Cd2+ (5 mol/ L), both of which efficiently block VOCC at the doses. However, La3+, a known inhibitor of SOCC, significantly suppressed the Ca2+ readdition-induced contraction in a dose-dependent manner. On the basis of these results, we conclude that contraction of smooth muscle in the distal colon

16、is regulated by multiple Ca2+ channels. In addition to VOCC-mediated Ca2+ influx, SOCC-mediated CCE participates in agonist-induced contractile response of distal colon smooth muscle in rats. Key words: capacitative Ca2+ entry; store-operated Ca2+ channel; ACh; atropine; lanthanum; smooth muscle; co

17、lon; rat 在平滑肌收缩过程中，胞内Ca2+浓度的变化是 肌细胞收缩的诱导因素，而胞内Ca2+来源于钙库释 放和细胞外Ca2+内流。在平滑肌细胞，Ca2+主要贮 存于肌质网(sarcoplasmic reticulum, SR)内，但其容 量有限，仅能维持平滑肌短暂性收缩，而胞外Ca2+ 内流则是维持平滑肌持续性收缩及内贮钙库再充盈 的重要来源。目前已知，平滑肌中的Ca2+通道至少 可分为：电压操纵性钙通道(voltage-operated Ca2+ channel, VOCC)、受体操纵性Ca2+通道(receptor-op- erated Ca2+ channel, ROCC)、牵张

18、敏感性钙通道 (stretch-sensitive Ca2+ channel)和钙库操纵性通道 (store-operated Ca2+ channel, SOCC)1，其中ROCC 目前研究较多。由于 ROCC 分型较多，且每一种 细胞又包含不同的ROCC亚型，每一种ROCC的生 理功能、结构和激活机制及电生理特性又表现各 异，因此，到目前为止对ROCC的功能、特性还了 解得不够清楚。在对ROCC的研究中，SOCC是目前 研究较多亦较为引起人们关注的一种ROCC的亚型。 1986年Putney对受体操纵性Ca2+内流提出以下 假说：当细胞外的信号激活了细胞膜上的受体后， 通过兴奋性G 蛋白激

19、活磷脂酶C (PLC)，后者水解 磷脂酰肌醇二磷酸 (phosphatidylinositol biphosphate， PIP2)，生成 1,4,5- 三磷酸肌醇(1,4,5-triphosphate inositol, IP3)和二酰甘油(DG)。IP3作用于内质网(en- doplasmic reticulum, ER)或SR，引起钙库释放Ca2+。 当钙库耗竭，诱发细胞膜上SOCC开放而促进胞外 Ca2+内流，钙库重新充盈，这种Ca2+内流的方式称为 库容性Ca2+内流 (capacitative calcium entry，CCE)2,3。 目前研究发现，CCE的作用不仅是充盈耗竭的

20、胞内 钙库，且作为平滑肌收缩的激活信号Ca2+的来源4。 大量研究已证明5-7，有些递质或激素如 ACh、5- HT、苯肾上腺素(L-phenylephrine，PE)等可作为一 类激动剂，通过激活ROCC或SOCC 诱导胞外Ca2+ 内流，CCE在这些激动剂诱导的血管平滑肌舒缩活 动中起重要作用。至于CCE在激动剂诱导的结肠平 滑肌收缩反应中是否也发挥类似于在血管平滑肌上 的作用，目前尚不清楚。本研究在以往对结肠动力 研究的基础上，针对上述问题进行初步的探讨。 1 材料与方法材料与方法 1.1 动物和药品 动物和药品 Sprague-Dawley 大鼠，体重 150250 g，雌雄不拘，由安

21、徽医科大学实验动物 中心提供。ACh为上海禾丰制药有限公司生产；阿 托品( atropine)、verapamil、EGTA、LaCl3、CdCl2 均购自Sigma 公司。所用药品依文献和实验的要求 配成适宜的浓度，经微量移液器滴加在浴槽的 Krebs 液中。 Krebs 液成分(mmol/L): NaCl 114.0、KCl 4.7、 MgCl2 1.2、CaCl2 2.5、NaH2PO4 1.8、glucose 11.5、 NaHCO3 18.0，pH (7.40.5); 无钙Krebs 液为正常 Krebs 液去除 CaCl2，其它成分不变。 1.2 仪器 仪器 HSS-1B 数字式超

22、级恒温水浴泵、离 体器官浴槽(成都仪器厂)，BT-100 恒流输液泵(上 海沪西分析仪器厂)，JZ-100 肌肉张力换能器(北京 新航兴业科贸有限公司)， ML110桥式生物电放大器 和Powerlab 4/25T数据采集分析系统 (Australia AD Instruments)。 1.3 方法 方法 实验前动物禁食12 h，自由饮水。颈 椎脱臼处死，剖开腹腔，距肛门 4 cm 处，迅速 取出远端结肠约2 cm，在盛有Krebs 液的培养皿中 漂洗，去除周围组织及肠内容物，并用浸有Krebs 液的棉签擦拭肠管腔内表面，尽可能去除内皮细 胞。用手术线将肠管两端扎紧打结，置于容量为40 ml、

23、温度(370.5)的离体器官浴槽中，将肠管的 一端固定在浴槽底部的挂钩上，另一端通过连线与 张力换能器相连，以 95% O2和 5% CO2充分饱和 151 孔德虎等: 库容性Ca2+内流参与ACh 诱导的大鼠远端结肠平滑肌收缩 的Krebs 液持续恒速(5 ml/min)灌流，并维持基础张 力(basal tension)为1 g，每隔20 min更新Krebs 液， 平衡 1 h 后开始实验。结肠平滑肌收缩张力的变化 通过张力换能器经桥式放大器 输送到Powerlab 4/25T 数据采集系统适时监测、记录和处理。实验中用结 肠平滑肌引起的收缩张力的变化作为观察指标，并 按以下公式计算收缩

24、反应的抑制率8: (应用拮抗剂前 收缩张力-应用拮抗剂后收缩张力)/ 应用拮抗剂前收 缩张力 100%。 1.4 统计学处理 统计学处理 结肠平滑肌收缩张力变化由 Chart 5.0 软件进行处理，通常用给药后3 min 的平 均值作为效应值。实验数据用 meanSD 表示，统 计学处理采用配对 t 检验。 2 结果结果 2.1 细胞外细胞外 Ca2+对高对高 K+及及 ACh诱导的结肠平滑肌 收缩的影响 诱导的结肠平滑肌 收缩的影响 远端结肠标本经Krebs 液持续恒速灌流1 h 后， 向浴槽内加入40 mmol/L KCl或5 mol/L ACh，可 见离体肠管明显收缩。待诱发的收缩反应稳

25、定后， 用无钙Krebs 液灌流以去除细胞外Ca2+，可见高K+ 及ACh 所致的结肠收缩张力明显降低(图1)，冲洗 前后的张力(g)由 2.110.55、1.480.78 分别降至 0.920.33、0.620.15 (n=11，P0.05. 生理学报 Acta Physiologica Sinica, April 25, 2006, 58 (2): 149-156 154 所引起的收缩张力的0.46倍(图3B)，提示在ACh诱 导的远端结肠平滑肌收缩反应中既有SR贮存钙的释 放又有 CCE 介导的钙内流参与。 2.4 钙通道阻断剂对钙通道阻断剂对 CCE 介导的结肠平滑肌收缩 的影响 介导

26、的结肠平滑肌收缩 的影响 2.4.1 Verapamil 对对 CCE 介导的结肠平滑肌收缩 的影响 介导的结肠平滑肌收缩 的影响 肠肌标本用 Krebs液反复冲洗并平衡30 min，用无钙 Krebs 液冲洗并稳定 30 min，加入 5 mol/L ACh。待 ACh 诱发的收缩反应稳定时，向 浴槽内加入 10 mol/L atropine，在此基础上恢复细 胞外 2.5 mmol/L Ca2+，待 CCE 介导的收缩反应达 峰值时，加入 5 mol/L verapamil，肠肌收缩并未 发生明显改变(n=5，P0.05)(图 4)。 2.4.2 La3+和和 Cd2+对对 CCE介导的结

27、肠平滑肌收缩 的影响 介导的结肠平滑肌收缩 的影响 待CCE介导的收缩反应达峰值时，向浴 槽内分别加入20、50、100 mol/L La3+和 5 mol/L Cd2+，发现La3+可明显抑制CCE 介导的结肠肠段的 收缩(n=7, P0.05)。 图 5. La3+和Cd2+对CCE 介导的大鼠远端结肠平滑肌收缩的影响 Fig. 5. Effects of La3+ and Cd2+ on CCE-mediated contraction of rat distal colon smooth muscle. A: A representative trace showing 50 mol/

28、L La3+ was added when CCE-mediated distal colon smooth muscle contraction reached peak. B: Summarized data showing the effects of 5 mol/L Cd2+, 20 mol/L La3+, 50 mol/L La3+, 100 mol/L La3+ on CCE-mediated contraction, respectively. *P0.05, *P0.01, *P 0.001 vs control; #P0.05 vs 20 mol/L La3+. 155 孔德

29、虎等: 库容性Ca2+内流参与ACh 诱导的大鼠远端结肠平滑肌收缩 3 讨论讨论 Ca2+调节平滑肌收缩的重要途径是影响肌球蛋白 ATP酶的活性，又称为Ca2+-钙调蛋白-肌球蛋白轻 链激酶(myosin light chain kinase，MLCK)依赖机 制。当平滑肌细胞受刺激时，伴随胞外Ca2+内流或 肌质网内贮Ca2+释放，使胞浆内Ca2+浓度升高，激 活钙调蛋白(calmodulin，CaM) 并与之结合形成Ca2+ CaM，后者与 MLCK 结合并使之激活，活化的 MLCK使20 kDa的肌球蛋白轻链(MLC20)Ser19磷酸 化并修饰变构与肌动蛋白形成横桥连接，使肌球蛋 白头

30、端 ATP 酶活性增强，触发肌丝滑行，引起平 滑肌收缩9。本实验通过应用M受体阻断剂atropine 以及VOCC 阻断剂verapamil，证明CCE 直接参与 ACh诱导的结肠平滑肌收缩，并观察到SOCC通道 阻断剂La3+可抑制CCE介导的结肠收缩反应，且呈 剂量依赖性。 在无钙Krebs 液中，ACh 通过与平滑肌细胞膜 上的M 受体结合引起细胞内IP3增加，IP3再与其相 应的受体IP3R结合，触发SR贮存Ca2+释放10，使 离体肠段迅速收缩且达峰值水平。当结肠平滑肌的 收缩恢复至基线水平时，加入atropine以终止IP3及 DG的生成，从而阻断DG/蛋白激酶C介导的ROCC 的

31、激活，在此基础上，恢复细胞外 Ca 2+，结肠平 滑肌仍表现持续性收缩，因为在无钙 Krebs 液中， ACh通过IP3途径已将SOCC激活，新加入的Ca2+通 过这一激活的CCE途径进入胞内。该收缩不依赖于 M受体，因为atropine只是作为M 受体阻断剂，并 不能阻断胞外Ca2+内流引起的结肠平滑肌收缩。实 验中还发现上述收缩活动也不受verapamil的影响， 提示该收缩活动不依赖于VOCC激活。另据文献报 道11，内皮细胞上也存在CCE途径参与平滑肌紧张 性的调节，而在本研究中预先用浸有Krebs 液的棉 签反复擦拭肠管粘膜层，已尽可能去除了内皮细 胞，提示该收缩活动没有内皮细胞的参

32、与。实验结 果提示SR贮存Ca2+的释放及CCE介导的胞外Ca2+内 流均参与ACh 诱导的结肠平滑肌收缩。 我们通过应用经典的VOCC阻断剂verapamil， 观察了VOCC非依赖性机制在ACh诱导的结肠收缩 反应中的作用。结果发现，verapamil 几乎可完全 消除 40 mmol/L K+引起的结肠收缩反应，但仅使 ACh诱导的收缩反应抑制约41%。说明在ACh诱导 的收缩反应中约有半数以上的成分是由非VOCC介 导的胞外 Ca 2+ 内流引起的。因此，ACh 除了激活 VOCC，也可能触发了胞内贮存Ca2+的释放及ROCC、 SOCC介导的胞外Ca2+内流途径。在实验中我们还 发现

33、verapamil不能抑制CCE介导的结肠收缩反应， 而胞外K+从4.7 mmol/L 增至40 mmol/L 时，通过 引起膜的去极化，激活VOCC，因此40 mmol/L K+ 诱导的结肠平滑肌收缩反应几乎可完全被verapamil 抑制。我们推测，至少有三种成分参与由 ACh 诱 导的结肠平滑肌收缩反应，包括SR 贮存Ca2+释放 引起的短暂性收缩，ROCC、VOCC介导的胞外Ca2+ 内流引起的持久性收缩以及CCE介导的幅度较小的 持续性收缩。 另据文献报道12，利用Ca2+通道对La3+、Cd2+ 敏感性的不同，可用于区别细胞Ca2+内流的途径。 业已证明微克分子浓度 La 3+ 是

34、 SOCC 的有效抑制 剂13-15，实验中我们也发现La3+可抑制CCE 介导的 结肠平滑肌收缩，且呈浓度依赖性，进一步证明在 ACh 诱导的远端结肠收缩反应中有 CCE 参与，而 La3+对CCE介导的结肠平滑肌收缩表现出不完全抑 制，提示在结肠平滑肌中存在有镧系元素敏感的和 镧系元素非敏感的CCE通道，这与Riccio等16报道 的CCE通道是由若干个规范瞬时受体电位(canonical TRP，TRPC)蛋白形成同源多聚体或者TRPC 与其 他亚型的 TRP 蛋白形成异源多聚体一致，反映了 CCE 通道的不均一性。而低于10 mol/L Cd2+是L 型 VOCC 的强效抑制剂，我们也

35、观察到 5 mol/L Cd2+并未抑制CCE介导的结肠收缩反应。因此适当 浓度的La3+ (20100 mol/L)及5 mol/L Cd2+可用于 鉴别远端结肠平滑肌中CCE介导的胞外Ca2+内流途 径。实验结果与Ma 等11报道的在肾小球系膜细胞 (mesangial cell，MC)上，一定浓度的 La3+及Cd2+可 用于区别MC 中 Ca2+内流途径一致。 综上所述，CCE 是引起结肠平滑肌收缩反应的 重要机制，并与其它类型的Ca2+通道相互协调，共 同调节胞内Ca2+水平，维持平滑肌收缩。目前已知 有许多消化系疾病及其所表现的症状如肠易激综合 征、Hirschsprungs 症、

36、结肠憩室症、溃疡性结肠 炎、便秘、腹泻等都可能与结肠动力紊乱或异常有 关，因此从离子通道水平进一步分析结肠动力发生 机制，将有助于对多种因结肠动力紊乱所致的消化 道疾病的病理分析，并为寻找有针对性的药物干预 和治疗提供一定的理论依据。 生理学报 Acta Physiologica Sinica, April 25, 2006, 58 (2): 149-156 156 参参 考考 文文 献献 1Sanders KM. Invited review: mechanisms of calcium handling in smooth muscles. J Appl Physiol 2001; 91(

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