氨基胍对胶原酶诱导脑出血大鼠模型的影响.pdf

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1、实用预防医学2 0 0 6 年2 月第 1 3 卷第 1 期P r a c t ic a l P r e v e n t i v e Me d i c i n e , F e b . 2 0 0 6 , V o l 1 3 , N o . I 文章编号: 1 0 0 6 一 3 1 1 0 ( 2 0 0 6 ) 0 1 一 0 0 0 1 一 0 3【 论著 】 氨基呱对胶原酶诱导脑出血大鼠模型的影响 唐涛， ,2 罗团连， ， 罗杰冲 ， 梁清华， ， 黎杏群 扭 要:目 的 研 究 氨 基 肌 对 脑出 血 的 影 响 。 方 法 以 A 胶 原酶 诱导 脑出 血 大鼠 模型， 观 察

2、动 物行 为 学和 脑内 血 肿的变化， 用We s t e rn b l o t 检测诱导型一氧化氮合酶蛋白表达的变化。结果氨基肌能明显加快脑出血大鼠行为缺陷 的恢复， 但对于血肿吸收没有明显影响; We s t e rn b lo t 显示: 氨基肌能明显抑制脑出血大鼠患侧皮质和基底节诱导型一氧 化氮合酶蛋白表达。结论通过广泛抑制脑内诱导型一氧化氮合酶的表达， 氨基肌能促进脑出血大鼠的运动功能 恢复。 关键词: 氨基孤; 诱导型一氧化氮合酶; 脑出血; 大鼠 中图分类号: R一 3 3 2文献标识码: A E f f e c t s o f A m i tl o g u a n i d i

3、 n e o n Mo t o r F u n c t i o n o f R a t s Wi t h C o l l 扣 g e n a s e I n d u c e d I n t r a c e re b r a l H e m o r r h a g e T A N G T a o ， L U O T u a n 一 L i a n ， L U O J i e 一 K u n ， e t a l . ( 1 . I n s t i t u t e o f I n t e g r a t i v e Me d i c i n e ， X i a n g y a H o s p i t

4、 a l ， C e n t r a l S o u t h U n i v e r s i - t y ， C h a n g s h a 4 1 0 0 0 8 ，H u n a n ，C h i n a ; 2 . I n s t i t u t e o f N e u r o l o g y ， X i a n g y a H o s p i t a l ，C e n t r a l S o u t h U n i v e r s i t y ， C h a n g s h a 4 1 0 0 0 8 ， 月u n a n， C h i n a ) A b s t r a c t :

5、O b j e c t i v e T o s t u d y t h e e ff e c t s o f a m in o g u a n i d in e ( A G ) o n r a t s w i t h c o l le g e n a s e V I I in d u c e d e x p e r i m e n t a l i n - t r a c e r e b r a l h e m o r r h a g e ( IC H ) .Me t h o d s T h e m o t o r d e f i c i t a n d h e m a t o m a d i

6、a m e t e r in c o l l a g e n a s e孤 i n d u c e d IC H r a t m o d e l w e r e e v a l u a t e d a f t e r a m in o g u a n id i n e t r e a t m e n t , a n d We s t e r n b l o t a s s a y o f t h e in d u c ib le n it r ic o x id e s y n t h a s e ( i N O S ) e x p r e s s io n a lo n g t h e t

7、i m e c o u r s e w a s p e r f o r m e d . R e s u l t s A G m a r k e d l y e n h anc e d r e s t o r a t io n o f m o t o r f u n c t i o n , b u t s h o w e d in s ig n if ic a n t in f lu e n c e o n h e m a t o m a a b s o r p t io n . W e s t e r n b lo t r e v e a le d d o w n r e g u la t e

8、 d N O S e x p r e s s io n in t h e ip s ila t e r - a l in j u r e d c o r t e x a n d b a s a l g a n g l i o n . C o n c l u s i o n A G f a c i l it a t e s t h e m o t o r f u n c t io n r e s t o r a t io n o f I C H r a t s t h r o u g h e x t e n s i v e i n h ib i t i o n o f c e r e b r a

9、 l NO S e x p r e s s i o n . K e y w o r d s : . A m in o 之 u a n id in e ; In d u c ib le n it r ic o x id e s y n t h a s e ; In t r a c e r e b r a l h e m o r r h a g e ; R a t 脑血管疾病是神经系统常见病和多发病， 根据最新的流行 病学资料表明: 我国的脑血管疾病在人口死因中居第二位， 仅 次于恶性肿瘤， 在不少城市中已占首位川。而脑出血是脑血管 病中的危重类型， 其发病急剧、 凶险， 早期的死亡率达到5 0

10、%, 是急性缺血性中风的十倍川， 所以探索有效的药物对于脑出血 的治疗意义重大。 氨基肌( A m in o g u a n id in e A G ) 是一种有多种药理学作用的 分子， 由于能延缓糖基化终产物的产生而被引人临床试验治疗 糖尿病 3 1 ， 但它同时是诱导型 一氧 化氮合酶( I n d u c i b le n i t r ic o x - id e s y n t h a s e , i N O S ) 的选择性抑制剂， 缺血性中风研究表明A G 具有神经元保护， 减轻学习行为和海马长时程增强受损的作 用4 .5 1 。既往工作表明， 脑出血大鼠 脑组织N O增加， i N

11、 O S 表达 基金项目: 国家自然科学基金( 3 9 8 0 0 1 8 9 ) 作者单位: 1中南大学湘雅医院中西医结合研究所( 湖南长沙 4 1 0 0 0 8 ) ; 2中南大学湘雅医院神经病学研究所 作者简介: 唐涛( 1 9 7 2 一) ， 男， 湖南祁东人， 博士， 主治医师， 神经病学 在站博士后， 主要从事中药对脑血管病所致的神经元损伤及修复相关机 制的研究。通讯作者: 罗团连。 上调， 提示iN O S 参与了脑出血的病理过程 6 1 。本研究试图结 合行为学观察、 We s t e r n b l o t 等方法以研究A G对脑出血大鼠的 影响作用。 1 材料与方法 1

12、 . 1 材料与试剂健康雄性清洁级 S D大鼠5 5只， 重 2 5 0 - 3 0 0 g ， 中南大学动物学部提供; V 1 型胶原酶( c o l la g e n a s e V I( )、 氨 基肌( A m in o g u a n i d i n e ) 系S ig m a 公司产品; i N O S兔抗鼠多克隆 抗体系 S a n t a C r u z 公司产品; 化学发光试剂盒系 K P L公司产 品， 购自晶美生物工程有限公司; 丙烯酞胺等电泳试剂及设备 系B i o - R a d 公司产品。 1 . 2方 法 1 . 2 . 1 脑出 血模型 根据 大鼠 脑立体定位图

13、谱 定位 7 l ， 选 择前自后 1 . 4 0 m m， 矢状缝向右3 . 2 0 m m， 深 5 . 6 0 m m为注射 点， 位于近内囊的苍白球内。水合氯醛4 0 0 m g - k g 经腹腔麻 醉大鼠， 俯卧固定于鼠脑定位仪( S T O E L T I N G T L 一 2型， 美国 产) ， 经注射点注人2 闪含0 . 4 UV 1 型胶原酶的生理盐水溶液。 假手术大鼠注人2 j l 生理盐水。 实用预防医学2 4 0 6 年2 月第1 3 卷第I 期P r a c t ic a l P r e v e n t iv e Me d ic i n e , F e b . 2

14、 0 0 6 , V o l 1 3 , N o . I 7 d 时血肿进一步吸收; 给服A G的动物血肿变化与模型组动物 相似， 而且各时间结果比较没有明显差异; 假手术组动物除皮 质有针道外， 基底节未见明显血肿形成。见图2 0 已日崔侧孟昌 图2氨基肌对脑出血大鼠血肿的影响 与模型组比 较P 0 . 0 1 ; 与本组前一时间点结果比 较P 0 . 0 1 , 0 与本组前一时间点结果比较 P 0 . 0 1 , 与本组前一时间点结果比较 P 0. 0 5 0 000500姗500000500 ，J，山，.二.1 侧却米月邵扭阴50之拼矍溯毕瓣 1 . 2 . 2 动物分组与给药7 5只

15、动物随机分成假手术组、 手术 组2 组。各组分别为2 5 只和5 0只， 其中手术组造模后又随机 分为 模型组和A G治疗组， 各为2 5 只。动物给药: 麻醉清醒即 按 1 0 0 m g / k g 腹腔注射， 一天二次。 1 . 2 . 3 动物行为学观察参照文献( 8 ) ， 根据大鼠出现旋转、 前 爪的抓力偏差及爬杆能力三方面进行 0 - - 4计分， 总分为 1 2 分， 分数越高表示其神经症状越严重。实验过程中无动物 死亡 。 1 . 2 . 4 组织取材各组分别于术后 1 2 h , 2 4 h , 2 d , 4 d , 7 d随 机抽取各组大鼠， 断头处死取脑， 一 7 0

16、冻存。 1 . 2 . 5 血肿直径测量动物处死时， 沿针道切开手术组大鼠 脑冠状平面， 用钢尺测量血肿坏死区的直径。 1 . 2 . 6 蛋白质印迹法和光密度扫描取患侧皮质、 基底节组 织匀浆后， 紫外分光光度计检测蛋白 浓度， 取1 0 0 u g 总蛋白质， 在7 . 5 9 6 S D S - P A G E 胶电泳后， 转膜， 余按化学发光试剂盒说 明完成( i N O S 浓度 1 : 4 0 0 ) 。结果用 Q a n t is c a n 软件分析， 获得 光密度值。 1 . 3 统计学处理各组数据均以均数士 标准差( 妥士 :) 表示， S P S S 1 0 . 0 做统

17、计分析， 同组不同时间点均数比较采用方差分 析， 同一时间点两组均数比较采用 t 检验。用 E x c e l 9 7 做统计 图形。 2 结果 2 . 1 氛基孤对脑出血大鼠行为学的影响大鼠在手术后 1 - - 2h 相继开始清醒， 表现出行动迟缓， 少动， 不同程度的偏瘫， 前 爪抓力下降。模型组的行为缺陷从术后2 d 开始明显改善( P 0 . 0 1 ) ， 而后随着时间的延长不断好转; A G治疗组动物的行为 从术后2 4 h 就有明显恢复， 而且从 2 -7 d的恢复程度均好于 模型组( P 0 . 0 5 ) ; 假手术组除 1 2 h时有少数动物活动稍迟缓 外， 后续时间都没有

18、明显异常， 这可能与水合氯醛对中枢系统 影响有关。 2 0 0 0 1 8 0 0 1 6 0 0 1 4 0 0 1 2 0 0 1 0 0 0 8 0 0 6 0 0 4 0 0 2 0 0 0 侧蜘米姐姻50之迎侧 李彩解教劣 圈 1 权共皿对摘出血大鼠行为学的影响 与模型组比较P 0 . 0 1 , 与本组前一时间点结果比 较 P 0 . 0 1 , 与本组前一时间点结果比 较P 0 . 0 1 , 与本组前一时间点结果比较 P 0 . 0 5 . 2 . 2 氛基孤对脑出血大鼠 血肿的影响 脑出 血后， 1 2 h 到2 d 血肿大小没有明显变化， 到4 d 血肿明显缩小， 局限(

19、P 0 . 0 1 ) , 图3氨基脆对脑出血大鼠脑内i N O S表达的影晌 与模型组比较 P 0 . 0 1 ; 与本组前一时间点结果比较 P 0 . 0 1 , 0 0 与本组前一时间点结果比较 P 0 . 0 1 , 与本组前一时间点结果比较 尸0 . 0 5 2 . 3 熟基孤对脸出血大鼠脑内i N O S 表达的影响取患侧皮 质租血种周围基底节组织检测， 发现: i N O S 信号在 1 3 0 k d 处， 实用预防医学2 0 0 6 年2 月第 1 3 卷第 1 期P r a c t ic a l P r e v e n t iv e Me d ic i n e , F e

20、b . 2 0 0 6 , V o l 1 3 , N o . 1 脑出血后基底节组织信号从 1 2 h 到2 4 h 逐渐增强， 4d 达峰值 ( P 0 . 0 1 ) , 7 d 的信号减弱( P 0 . 0 1 ) ; 皮质组织阳性信号的 时程特点与基底节的相似， 但信号稍弱; A G治疗组两个部位的 信号均明显弱于模型组， 而且没有明显峰值; 假手术组动物未 测到明显阳性信号。 力的， 当然进一步的工作还应从给药的剂量、 时间窗等方面探 索， 以保证该药的安全和高效。 参考文献 3 讨论 自上世纪末， 一氧化氮( N i t r i c o x i d e N O ) 作为一个广泛参

21、与 机体病理和生理过程的气体分子一直受到密切关注。 研究表 明， N O的合成须经过一氧化氮合酶( N i t r ic o x id e s y n t h a s e N O S ) 催化; N O S 在脑内至少有三种同工酶， 分别为神经元型 N O S 、 诱 导型 N O S和内皮型 N O S ; 其中神经元型和内皮型为结构型同 工酶， 与维持神经传递和血管舒张等生理功能有关; 诱导型 N O S ( i N O S ) 为诱导型同工酶， 在生理状态表达水平很低， 个体 发育和病理条件下才表达增高， 在个体发育时关系到脑正常的 发育与功能， 病理条件下的高表达将导致 N O大量生成

22、， 后续的 过氧脂质化过程可导致 D N A断裂、 神经元凋亡和血脑屏障开 放1 9 1 。因此， i N O S 可能在中风病理过程担任了重要角色。 本研究运用行为学观察、 We s t e r n b l o t 检测患侧皮质和基底 节i N O S 的表达评价了i N O S的特异性抑制剂 A G对脑出血大 鼠的影响， 结果显示 A G可广泛地抑制脑内 i N O S的表达， 明显 加快模型动物行为缺陷的恢复， 这应与抑制 i N O S 后， 减少 N O 在脑内的生成， 从而切断其下游损伤过程有关; 但结合近年报 道 N O是神经发生的抑制物， 我们推测行为学的较快恢复还可 能是因N

23、 O产生减少而导致的神经发生过程增强的结果 lo 川， 而且我们注意到i N O S的水平虽然很低， 但仍然明显高于正常， 这是否提示小剂量的A G对 i N O S的影响与缺血预处理有类似 效果 12 1 ， 尚须今后工作阐明; 另外研究中注意到A G对于血肿 的吸收没有明显影响， 这可能由于血红蛋白降解的限速酶 一含 铁血 红素氧 合酶一 1 不 受N O 影响 有 关 13 1 总之， 虽然i N O S 和N O的病理生理作用尚在不断揭示中， 本研究工作的结果仍然强烈提示 A G对于脑出血后治疗是有潜 1 杨期东 . 神经病学( 7 年制) M . 第一版 . 北京: 人民卫生出版社，

24、 2 0 0 2 . 1 1 8 . 2 B r o w n R D , Wh is u a n t J P , S ic k s J D , e t a l . S t r o k e i n c id e n c e , p r e v a le n c e a n d s u r v iv a l : s e c u l a r t r e n d s in R o c h e s t e r , Min n e s o t a , t h r o u g h 1 9 8 9 J . S t r o k e , 1 9 9 6 , 2 7 ( 3 ) : 3 7 3 一 3 8 0 .

25、3 M a k i t a Z , V l a s s a r a H , R a y f i e ld E , e t a l . H e m o g lo b in 一 A G E : a c i r c u - la t in g m a r k e r o f a d v a n c e d g ly c o s y la t io n J ，S c i e n c e , 1 9 9 2 , 2 5 8 ( 5 0 8 2 ) : 6 5 1 一6 5 3 4 D a n i e li s o v a V , N e m e t h o v a M, B u r d a J . T

26、h e p r o t e c t iv e e f f e c t o f a m in - o g u a n i d in e o n c e r e b r a l i s c h e m i c d a m a g e in t h e r a t b r a i n J P h y s io l R e s , 2 0 0 4 , 5 3 ( 5 ) : 5 3 3 一5 4 0 . 5 1 Mo r i K 厂I o g a s h i H , U n e n o K I , e t a l . A m i n o g u a n id i n e p r e v e n t e

27、 d t h e i m p a i r m e n t o f l e a r n i n g b e h a v i o r a n d h i p p o c a m p a l lo n g 一t e r m p o t e n t i a - t i o n f o l l o w i n g t r a n s i e n t c e r e b r a l i s c h e m i a J ， B e h a v B r a i n R e s , 2 0 0 1 ， 1 2 0 ( 2 ) : 1 5 9 一1 6 8 . 6 罗团连， 黎杏群. 脑溢安对出血性中风大鼠脑损伤

28、保护作用 J . 湖 南医科大学学报， 2 0 0 0 , 2 5 ( 3 ) : 2 4 5 一 2 4 7 . 7 包新民， 舒斯云. 大鼠脑立体定位图谱 M . 北京: 人民卫生出版 社， 1 9 9 1 . 8 R o s e n b e r g G A , M u n 一 B r y c e S , We s le y M, e t a l . C o l la g e n a s e 一 i n - d u c e d i n t r a c e r e b r a l h e m o r r h a g e i n r a t s j . S t ro k e , 1 9 9 0

29、 , 2 1 ( 5 ) : 8 0 1 一 8 0 7. 仁 9 B o la n o s J P , A l m e i d a A . R o l e s o f n it r ic o x i d e i n b r a in h y p o x ia 一is c h - e m i a J . B io c h i m B io p h y s A c t a , 1 9 9 9 , 1 .4 1 1 ( 2 一 3 ): 4 1 5 一 4 3 6 . 1 0 M o r e n o 一 L o p e z B , R o m e ro一 G r i m a l d i C , N

30、 o v a l J A , e t a l . N i t r i c o x - i d e is a p h y s io lo g i c a l in h i b i t o r o f n e u r o g e n e s is i n t h e a d u lt m o u s e s u b - v e n t r ic u la r z o n e a n d o l f a c t o r y b u l b J . J N e u r o s c i , 2 0 0 4 , 2 4 ( 1 ) : 8 5 一 9 5 . 1 1 L u o C X , Z h u X

31、 J , Z h a n g A X , e t a l . B lo c k a d e o # L 一 t y p e v o l t a g e - g a t e d C a c h a n n e l i n h i b i t s i s c h e m i a 一i n d u c e d n e u r o g e n e s i s b y d o w n 一 r e g u la t i n g iN O S e x p r e s s io n i n a d u l t m o u s e J . J N e u r o c h e m, 2 0 0 5 , 9 4 (

32、 4 ) : 1 0 7 7 一1 0 8 6 . 1 2 J C h o S , P a r k E M, Z h o u P , e t a l . O b li g a t o r y r o le o f in d u c i b le n i t r i c o x id e s y n t h a s e i n is c h e m ic p r e c o n d i t i o n i n g 仁 J ) . J C e r e b B lo o d F lo w Me t a b , 2 0 0 5 , 2 5 ( 4 ) : 4 9 3 一5 0 1 . 1 3 1 K

33、i t a m u r a Y, M a t s u o k a Y , N o m u r a Y , e t a l . I n d u c t io n o f in d u c i b le n i - t r i c o x i d e s y n h a s e a n d h e m e o x y g e n a s e 一1 i n r a t g l ia l c e l ls J . L i f e S c i , 1 9 9 8 , 6 2 ( 1 7 -1 8 ) : 1 7 1 7 一1 7 2 1( 收稿 日期: 2 0 0 5 一0 9 -1 6 ) 第四届环境

34、与职业医学国际学术研讨会征文通知 “ 第四届环境与职业医学国际学术研讨会” ， 将由 环境与职业医学 杂志编委会、 上海市疾病预防控制中心与美 国加州卫生局及昆明医学院等中美多方联合主办， 将于2 0 0 6 年 1 0 月中旬在云南省昆明市召开。 大会主题: 健康环境与和谐社会 征文内容范围: ( 1 ) 生态环境与人类健康; ( 2 ) 健康城市与社会和谐; ( 3 ) 生命质量与健康指标; ( 4 ) 工业卫生与环境化学; ( 5 ) 健康 危害变化趋势及环境与职业流行病学; ( 6 ) 有害健康危险度评价、 污染控制和防治技术; ( 7 ) 毒理学研究和环境、 职业 医学实验检测技术;

35、 ( 8 ) 室内外环境污染、 公害病和环境相关疾病; ( 9 ) 职业病危害因素、 职业病和职业相关疾病; ( 1 0 ) 环境基因组学、 蛋白组学; ( 1 1 ) 突发公共卫生事件与应急救援; ( 1 2 ) 职业相关社会心理问题和环境应急心理危机; ( 1 3 ) 环境与职业卫生事业管理; ( 1 4 ) 公共卫生经济学与社会医学; ( 1 5 ) 公共卫生法制与社会热点问题。 征文的电子版请发至 E m a i l 邮箱: J E O M2 0 0 6 ) y a h o o . c o m. c n和 : a z h i2 s c d c . s h . c n ; 同时， 请将文纸版寄至: 2 0 0 0 7 0 上海市中兴路 及传真: 0 2 1 一 5 6 9 7 0 6 4 4 1 1 0 5 号 环境与职业医学 杂志编辑部收， 联系电话: 0 2 1 一 5 6 6 3 6 6 0 0 一1 3 7 或 1 4 0 分机， 直线 ; 联系人: 洪淇， 丁瑾瑜。接收征文截止时间: 2 0 0 6 年7 月 1日( 以邮戳或电子邮件为准) 第四届环境与职业医学国际学术研讨会组委会