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1、*基金项目：军队 “十五” 指令性课题 （01L051） 作者单位：1. 暨南大学药学院药理教研室， 广州 510632；2. 暨南大 学生命科学技术学院；3. 南方医科大学高温医学研究 室 作者简介：聂红 （1970 - ） ， 女， 贵州人， 副研究员， 硕士生导师， 博士 后， 主要从事中药药理研究。 通讯作者：罗炳德 文章编号：1001-0580 （2006） 03-0286-03中图分类号：R 34 文献标识码：A 【论著】 热毒平抗脂质过氧化及对腹腔巨噬细胞凋亡影响* 聂红1， 王通2， 李文3， 杨光3， 罗炳德3 摘要：目的研究热毒平抗脂质过氧化以及对腹腔巨噬细胞 （macro
2、phage， M） 凋亡的影响， 为热毒平治疗重症 中暑提供实验依据。方法昆明种小鼠 50 只， 随机分为常温对照组、 热毒平组、 西黄芪胶组、 生理盐水组和中暑模型 组。在干球温度 （34.5 0.5） ， 相对湿度 （60 5） %的条件下建立中暑模型， 测定用药组和对照组小鼠肝组织超氧化 物歧化酶 （SOD） 活力、 丙二醛 （MDA） 含量； 提取动物腹腔巨噬细胞 DNA 并行凝胶电泳； 用流式细胞仪检测各组小鼠腹 腔 M凋亡情况。结果 热毒平均小鼠肝组织 SOD 活力升高， MDA 含量降低； DNA 电泳图中热毒平组无梯状条带； 热 毒平组腹腔 M凋亡百分率比其他组低且接近正常组。
3、结论 热毒平能有效的防止高温所致的脂质过氧化、 减少其 腹腔 M凋亡， 对重症中暑有着良好的治疗作用。 关键词： 高温； 热毒平； 超氧化物歧化酶； 丙二醛； 凋亡 Effect of Reduping on lipid over oxidation and apoptosis in peritoneal macrophages of mice under hyperthermiaNIE Hong， WANG Tong， LI Wen， et al . Pharmacy College of Jinan University （Guangzhou 510632， China） Abstract
4、：ObjectiveTo investigate the protection effect of Reduping against lipid over oxidation and apoptosis in peritoneal macrophages of mice in heat stroke and to provide experimental evidence for the treatment of heat stroke.MethodsTo establish the heat stroke model under circumstances of dry bulb tempe
5、rature（34.5 0.5） and（60 5） % relative humidity and 50 mice were randomly divided into five groups （nomal， Reduping， escipient， control and heat strock model groups） ， superoxide dismutase （SOD）and malondialdehyde （MDA）gel electrophoresis and the apoptosis in peritoneal macrophages were measured by D
6、NA gel electrophoresis and flow cytometer.ResultsSOD and MDA of Reduping group were higher and lower redpectively than those of any other groups whose difference was significant but similar to normal group； DNA gel electrophoresis of Reduping group had not the ladder of apopto- sis； the percentage o
7、f apoptosis of Reduping group was lower than that of any other groups but similar to normal group.Conclusion Reduping which can against effectively lipid over oxidation and decrease apoptosis of peritoneal macrophages caused by hyperthermia is an effective medicine against heat stroke. Key words： hy
8、perthermia； Reduping； superoxide dismutase （SOD） ； malondialdehyde （MDA） ； apoptosis 近年来， 细胞凋亡 （apoptosis） 成为了当今生命科学研究中 最引人注目的领域之一。许多研究显示， 氧自由基及其衍生物 与细胞凋亡密切相关， 高温环境条件下易引起中暑。文献报 道， 热蓄积可以导致机体肌肉、 肝脏等脏器损伤， 其具体损伤机 制尚不清楚。近期研究表明， 内毒素 （endotoxin， ET） 在中暑发病 中起着重要的作用 1 4， 引起组织的脂质过氧化是其主要的作 用机制之一。内毒素与氧自由基均可引起细胞
9、凋亡， 因此对高 温诱导的中暑内毒素血症所致的脂质过氧化的防治极为重要。 热毒平是以治疗高热内毒素血症为目标研制的药物 5。本实 验拟通过测定该药对高温下小鼠作用前后肝组织中超氧化物 歧化酶 （SOD） 和丙二醛 （MDA） 以及腹腔巨噬细胞凋亡百分率的 变化， 探讨其作用机制， 为实际应用提供依据。 1材料与方法 1.1主要材料热毒平药粉系沈阳飞龙制药公司生产， 批 号： 国卫药准字 （1999） Z - 76 号， 每 g 相当于原生药 25 g。淡 黄色极细疏松粉末， 无吸潮性。实验中均以药粉量作为给药 剂量。西黄芪胶系上海试剂厂生产， 批号： F 20040210。SOD 及 MDA
10、试剂盒由南京建成生物制品公司生产。DNA 提取试 剂盒由 V - gene 公司提供。溴化丙碇 （PI） 染液由美国 Sigma 公司提供。 1.2实验动物及分组昆明种小鼠 50 只， 一级， 体重 18 22 g， 雌雄各半， 随机分为常温对照、 热毒平、 西黄芪胶、 生理盐水 和中暑模型组， 每组 10 只。 1.3实验器材人工热气候模拟舱、 玻璃匀浆器、 低温离心 机 （美国） 、 水浴锅 （扬州） 、 752 分光光度计 （上海） 、 流式细胞 仪 （美国） 、 BIO - RAD 电泳仪 （上海） 。 1.4试剂配制全部实验用具均经严格消毒灭菌处理， 全部 溶液均用无热源水于严格无菌
11、条件下配制， 所有操作均采取 严格防菌及防内毒素污染措施。称取西黄芪胶 1 g 用双蒸水 配成 0.5%胶体液备用， 精密称取热毒平 1 g 用西黄芪胶液溶 解至 10 ml， 煮沸 30 min 灭菌。 1.5实验方法 1.5.1动物模型组常温下做为常温对照组一组灌服热毒 平， 按 0.05 ml/ （g bw） 给药， 一组给与等体积的西黄芪胶液灌 胃， 一组灌服等体积生理盐水组不给任何药物， 做为中暑模型 组。给药 30 min 后将后 4 组动物同时放入人工热气候模拟舱 温度 （34.5 0.5） ， 湿度 （60 5） % 。热暴露 2 h 取出。 1.5.2腹腔巨噬细胞的提取与鉴定
12、将动物取出后， 断髓处 死。用常规方法提取腹腔巨噬细胞。用台盼蓝染色计数， 瑞 士染色鉴定巨噬细胞。 1.5.3肝匀浆的制备打开腹腔取出肝脏， 除去肝脏外层的 脂防及结缔组织后， 用冰冷的生理盐水洗去血液， 再用滤纸吸 干。准确称取肝组织 0.2 g， 剪碎， 加入 2 ml 生理盐水， 用匀浆 器在冰浴中制成肝匀浆。将匀浆倒入离心管中， 4 下 4 000 r/ min 离心 15 min， 取上清备用。 1.5.4SOD 活力、 MDA 含量的测定按试剂盒说明书进行。 682中国公共卫生 2006 年 3 月第 22 卷第 3 期Chin J Public Health Mar 2006
13、Vol . 22 No . 3 1.5.5凋亡检测流式细胞术： 提取的巨噬细胞， 每个样品 取 1 106个细胞。按常规方法制样， PI 染色， Elite 流式细胞 仪采集数据 （激发光波长 488 nm， 发射光波长 633 nm） ， 并用 Multicycle 分析软件分析， 通过计数凋亡区 （亚二倍体区） 细胞 数量得出凋亡率。 1.5.6腹腔巨噬细胞 DNA 的提取按 DNA 提取试剂盒说明 书进行。 1.5.7DNA 琼脂糖电泳取 20l DNA 样本加上样缓冲液 2 5l 上样； 1.5% 琼脂糖凝胶电泳 （电压 30 V， 时间 3 h， 三羟 甲基氨基甲烷 - 硼酸盐 -
14、乙二胺四乙酸缓冲液） ， 紫外线下观 察并拍照。 1.6统计分析所得数据用 SPSS 10.0 统计软件进行统计学 处理。 2结果 2.1腹腔巨噬细胞的鉴定 （图 1） 台盼蓝染色显示细胞活力 在 98%以上， 瑞士染色鉴定为巨噬细胞。 图 1 巨噬细胞瑞士染色 2.2热毒平对中暑小鼠肝组织中 SOD 活力及 MDA 含量的影 响 （表 1） 热毒平可明显的提高中暑小鼠肝组织中 SOD 活 力， 降低小鼠肝组织中 MDA 含量。 表 1 高温下热毒平对小鼠肝组织 SOD 活力、 MDA 含量的影响 （-x s） 组别剂量 （g/ kg）SOD （U/ ml）MDA （nmol/ mgprot）
15、 热毒平组5115.59 12.817.84 0.045 常温对照组-122.09 14.777.79 0.07 西黄芪胶组1 ml69.46 9.34* 8.96 0.38* 生理盐水1 ml70.46 4.00* 8.72 0.11* 中暑模型组-30.43 7.83* 9.14 0.07* 注： 与热毒平组比，*P 0.05） ； 而治疗组、 正常组与模型组差异有统计学意 义 （P 0.05） 。 （3） 肺脏外观的变化： 正常组大鼠肺脏外观肺叶轮廓 清晰， 呈淡粉红色； 模型组大鼠肺脏地质变实， 肺叶轮廓不清， 整个肺脏萎缩， 外观有大小不等的灰白色结节状物及串珠状 充气空泡， 呈灰褐
16、色； 治疗组肺外观与正常组相同。 （4） 肺组 织病理改变： 在光学显微镜下观察， 正常组大鼠的肺支气管、 终末细支气管结构正常。28 d 时模型对照组大鼠肺泡壁显著 增厚， 肺泡结构紊乱， 肺泡间隔显著增厚， 部分肺泡腔扩张成 囊状， 肺泡壁断裂， 部分肺泡腔萎陷， 腔内可见渗出物淤积， 部 分肺泡沿终末细支气管、 细支气管周边可见大量纤维增生。 治疗组炎症及纤维化均轻。表明阿奇霉素有抗炎、 减弱纤维 积聚、 抗纤维化作用。 表 1 各组大鼠体重、 肺系数变化 （-x s， n = 10） 组别 体重 实验前实验后 肺系数 正常组 180 16.21a248 21.37a1.07 0.65a
17、 治疗组 182 14.35a243 17.66a1.14 0.53a 模型组 181 18.62a223 11.783.43 0.82 注： 与模型组相比， a P 0.01 讨论博莱霉素诱导的大鼠肺间质纤维化模型与人类 肺间质纤维化相近， 其病理变化经过肺组织损伤水肿、 肺泡 炎、 间质增生、 肺纤维化等几个阶段， 肺泡炎阶段是肺间质纤 维化形成的关键所在 5。本研究结果表明， 阿奇霉素有明显 地改善大鼠的一般状况、 体重、 肺系数、 肺脏外观的效果， 并有 减轻大鼠肺纤维化形成的作用。近年研究发现， 阿奇霉素 （十 五圆环大环内酯类抗生素） 除抗菌作用外， 还具有抗炎作用。 研究表 明，
18、 阿 奇 霉 素 能 影 响 巨 噬 细 胞 生 长、 趋 化 及 吞 噬 功 能 1， 2， 从而减轻了炎性期的损伤， 这种较轻的损伤在肺泡炎向 纤维化发展过程中可以得到修复， 所以能够保持肺泡结构完 整， 肺纤维化显著减轻。提示阿奇霉素可减轻肺间质纤维化。 参考文献 1 Kobayashi H， Take da H， Sakayori S， et al. Study on azithromycin in treatment of diffuse panbronchionlitis J . Kansenshogaku Zasshi， 1995， 69： 711 - 722. 2Xu G， F
19、ujita J， Negayama K， et al. Effect of macrolide antibiotics on macrophage funcitons J .Microbiol Immunol， 1996， 40： 473 - 479. 3Oda J， Kadota J， Kohno S， et al. Erythromycin. diffusepanbronchiolitis J .Chest， 1994， 10： 1116 - 1123. 4 Szaoiel S V， E lson N A， Fulmer J D， et al.Bleomycin-induced imtersti- tial pulmonary disease in the nude， athymic J . AM Rev Respir Dis， 1979， 120： 893. 5 马万里， 李元桂 .基质金属蛋白酶与肺纤维化 J . 国外医学呼吸 系统分册， 1999， 19 （4） ： 195 - 196. 收稿日期：2005-07-02 （文涛编辑赵淑艳校对） 882中国公共卫生 2006 年 3 月第 22 卷第 3 期Chin J Public Health Mar 2006 Vol . 22 No . 3