泼尼松与促皮质素致未成熟脑损伤机制的初步探讨.pdf

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1、第3 0 卷第2 4 期第三军医大学学报v 0 1 3 0 ，N o 2 4 2 31 62 0 0 8 年1 2 月 A C I AA C A D E M I A EM E D I C I N A EM I L I T A R I S I E R T I A E D e c 2 0 0 8 誓论著薹 泼尼松与促皮质素致未成熟脑损伤机制的初步探讨 王晓宇，曹洁，蔡方成( 重庆医科大学附属儿童医院神经内科，重庆4 0 0 0 1 6 ) 文章编号：l 0 0 0 - 5 4 0 4 ( 2 0 0 8 ) 2 4 2 3 1 6 - 0 5 摘要：目的对泼尼松与促皮质素导致脑损伤的机制进行初步探

2、讨。方法婴幼大鼠( 7 日龄) 和成年大鼠( 2 月 龄) 各1 9 2 只，分为泼尼松婴幼组、泼尼松成年组、促皮质素婴幼组和促皮质素成年组共4 个大组( 凡= 9 6 ) ，每大组再分为 长、短程治疗剂量组以及相应用药后停药4 周组，长、短程小剂馈组以及相应用药后停药4 周组，及对照组等共计1 2 个观 察组( n = 8 ) 。对各组血清中N S E 水平、脑内B 默与B c l - 2 蛋白表达以及神经细胞进行检测。结果短、长程治疗剂量给 予婴幼鼠泼尼松或促皮质素后，血清神经元特异性烯醇化酶( N e u r o s p e c i f j cE n o l 鼬e ，N S E ) 水平

3、较对照组显著升高，其幅度 达5 0 6 1 0 3 2 ；长程小剂量给药后其增高幅度为3 8 3 一6 0 3 ( P O 0 5 ) ，但这些N s E 升高的组同时伴有B “蛋 白表达显著增强( J P 0 0 1 ) 、B 彬B c l - 2 比值增高( 1 9 1 2 4 0 倍之间) 和T u N E L 阳性细胞表达的增多。而成年鼠仅在治 疗剂量泼尼松或促皮质素长程给药后见血清N s E 及免疫组化、T u N E L 等各项指标有显著异常。停药4 周后婴幼鼠或成 年鼠各组的各项指标与对照组相比均不再有显著差异。结论过度凋亡与坏死过程的激活是导致婴幼期激素脑损伤的 重要机制。 关

4、键词：泼尼松；促皮质素；未成熟脑；大鼠 中图法分类号：R - 3 3 2 ；R 7 4 3 8 0 2 ；R 9 7 7 1 l文献标识码：A P a t h o g e n e s i so fb r a i nd a m a g ei ni n f h n tr a t si n d u c e db yc o r t i c o s t e r o i d s W A N GX i a o - y u ，C A OJ i e ，C A IF a n g - c h e n g ( D e p a I t m e n to fN e 啪l o g ) r ，C h i l d r e n

5、BH p j t a l ，C h o 嗍吨M e d i c a lU n i v e r s i t y ， C h o n 阴i I l g4 0 0 0 1 6 ，C h i 啊) A b s t r a c t ：O b j e c t i V e 7 r oe x p l o r et h ep o s s i b l ep a t h o g e n e s i so fb r a i nd a m a g ei nr a t si n d u c e db yp r e d n i s o n e o rc o r t i c o t I 。o p h i n M e t h

6、O d sT h ed o s e so fp r e d n i s o n eo rc o r t i c o n o p h i nw e I d e t e 瑚i n e db yap r i m a r ye x p e r i m e n tt oo b t a i nc o r r e s p o n d j n gp l a s m ac o n i s o lo rc o n i c o s t e m n el e v e 】硇船m e 鹊t h a ti ns j c kc h j l d r e na n e rd r u g t a k i n g T h e n1

7、9 2h e a l t h yi n f 抽t ( a tt h ea g eo f 7d ) a n d1 9 2a d u l t ( a tt h ea g eo f 2m o n t h s ) m a l eS DI j a t sw e l e d i v i d e di n t 0 4g m u p sa si n f a n tp r e d n i s o n eg m u p ，a d u l tp r e d n i s o n eg r o u p ，i n f a n tc o r t i c o n o p h i ng r o u pa n da d u l

8、t c o n i c o t r o p h i ng r o u p ( ，l = 9 6i ne a c h ) t h e ne V e r yg m u pw a sf h r t h e rs u b d i V i d e di n t ol2s u b g m u p s ( 几= 8i n e a c h ) T h es u b g m u p sw e I ed i V i d e da c c o r d i n gt ot h ed o s e ( t h e I a p e u t i co rl o wd o s e s ) ，t l l ec o u r s e

9、 s h o r t ( 1 0d ) o rl o n g ( 3w e e k s ) ，t h es a c r i f i c e dt i m e ( 2 4ho r4w e e k s 出e rw i t h d m w a l ) ，a n dt h e i rc o 丌e s p o n d i n gc o n t r o l s S e m mn e u m n s p e c i f i ce n o l 鹪e ( N S E ) c o n c e n t r a t i o nw 船q u a n t i f i e db yE L I S A E x p r e s

10、 s i o n so f 印o p t o s i s r e l a t e d p r o t e i n s ，B a 】【a n dB c l - 2i nt h eb m i nw e r ed e t e c t e db yi m m u n o h i s t o c h e m i c a l 鹊s a y s N e u m n a l 印o p t o s i sw 鹊d e - t e c t e db yT U N E L R e s u I t SO u rp r i m a r ye x p e r i m e n ti n d i c a t e dt h a

11、 tt h et h e m p e u t i cd o s ew a s4m g k g 一d 一1 o r1 5 0U m 一2 d 一1f o rp I e d n i s o n eo rc o r t i e o t r o p h i n ，a n dt h es m a l ld o s ew a s2m g k g 一1 d 一1o r3 8U m 一2 d 一1f o rt h e m I ni n f a n tr a t st r e a t e dw i t hp r e d n i s o n eo rc o r t i c o t m p h i na tt h

12、e r a p e u t i c d o s ef o rs h o r to rl o n g t e 咖，t I I e i rs e r u mN S Ec o n c e n t r a t i o nw e r ei n c r e 鹊e ds i 印i f i c a n t l yb y5 0 6 t 01 0 3 2 A n d m mN S Ew 羽 i n c r e a db y3 8 3 t o6 0 3 i ni m n ta f t e rl o w d o s et r e a t m e n tf o rl o n gt e 珊O v e 卜e x p r e

13、 s s i o no fB a xp r o t e i n ( P 0 0 1 ) ，i n c r e a o fB 彬B c l 2 眦i o ( 1 9 lt o2 4 0t i m e s ) a n dm o r e I U N E L p o s i t i v en e u r o c y t ew e r ed e t e c t e di nt h e s ea b o v eg m u p s I na d u l tg m u p so m yt I l o s et 1 e a t e d 诵t ht I I e m p e u t i c d o 眈p r e d

14、 n i s o n eo rc o r t i c o t r o p h i nf o rl o n gt e 瑚d i s p l a y e da b o V em e n t i o n e df e a t u I _ e s C 0 n c I u s i o n E x c e s s i v e 印o p t o s i sa n di n i t i a t i o no f p r o c e s sd e a t ha r et l l ei m p o n a n tm e c h a n i s mo fb r a i nd a m a g ei n d u c e

15、 db yp r e d n i s o n eo rc o n i c o t m p h i n K e yw O r d s ：p r e d n i n e ；c o r t i c o t r o p h i n ；i m m a t u r eb r a i n ；r a t s 作者简介：乇晓宇女，重庆市人硕士医师，主要从事抗囊瘸药物方面的研究，现在重庆市第五人民医院工作。E - m a i l ：o q w n g I i B 0 y I I e 而1 6 3 通信作者：蔡方成，E - r r I a i l ：c a i f h 舻 1 2 6 c o m 收稿日期：2 0

16、吣0 2 2 7 ：修回日期：2 8 一0 4 - 刃 万方数据 第2 4 期 王晓宇，等泼尼松与促皮质素致未成熟脑损伤机制的初步探讨 2 3 1 7 治疗哮喘、婴儿痉挛等儿科疾病常需要中、长期使 用肾上腺皮质激素。早在2 0 世纪8 0 年代，影像学即 发现婴儿痉挛患儿经激素治疗后出现脑萎缩。其 他疾病治疗中也有类似报道嵋J ，如Y e h 等“ 1 发现早产 儿接受地塞米松治疗后会导致头围减小。M e r k e 等【4 1 发现大剂量糖皮质激素导致库欣综合征的患儿存在脑 萎缩。哮喘儿童经糖皮质激素治疗1 年后出现认知能 力下降和反应速度减慢”6J 。但这些患者几乎都存在 各种基础性疾病，

17、临床上很难排除这些因素的干扰，独 立地研究激素对脑发育的影响，更不可能在健康婴幼 儿身上进行用药观察。本研究以健康大鼠为实验对 象，对激素导致脑损伤的相关机制进行初步探讨，为进 一步探索该损伤的防治措施提供实验依据。 l 材料与方法 1 1 激素大鼠模型剂量的选定 先经预实验测得1 0 例患儿，重庆医科大学附属儿童医院 同期住院患儿( 2 岁以下，无内分泌系统相关疾患，连续服用 2n l g k g d “治疗剂量泼尼松5d 以上) 的血清皮质醇浓 度，其平均值为正常儿童的1 5 7 9 。分别以O 、2 、3 、4I I I g k g d “剂量泼尼松加赋型剂( 0 5 羧甲基纤维素钠)

18、对2 4 只7d 龄雄性S D 婴幼鼠( 4 组，n = 6 ) 清晨8 ：0 0 灌胃连续7d ， 第8 天清晨将动物麻醉后取血，测得4m g k g d “剂量将 使皮质酮浓度抑制为正常值的1 5 1 7 ，接近前述临床测试值 1 5 7 9 。故确认4I l l g - l 【g 一d 1 为匹配l 临床婴儿用药的治 疗剂量组用量，又取其半量，即2 l l g k g d 。作为婴幼鼠小 剂量组用量。对照组给予赋形剂0 5 羧甲基纤维素钠，给药 方式为每日药量清晨1 次灌胃。 在预实验中，我们以3 8 、3 8 、1 5 0U m d “3 个不同剂 量促皮质素分别对大鼠腹腔注射，发现3

19、 0m i n 后其皮质酮水平 均达同一峰值，升高程度与促皮质素剂量无关。因而确认将临 床治疗婴儿痉挛的促皮质素最大剂量1 5 0U m d “和最 小剂量3 8u m d 。直接作为本研究促皮质素的治疗剂 量和小剂量组用量。对照组给予生理盐水，给药方式为每日药 量分2 次腹腔注射。 1 2 实验动物及分组 清洁级健康S D 雄性大鼠3 8 4 只，按照动物年龄与给药种 类分为泼尼松婴幼组( 7d 龄，1 3 一1 8g ) 、泼尼松成年组( 2 月 龄，1 8 0 一2 2 0g ) 、促皮质素婴幼组和促皮质素成年鼠组，共计4 个大组( 凡：9 6 ) 。以泼尼松婴幼组为例，按照给药的剂量大

20、小、 疗程长短以及观察时间的不同，再分为1 2 个小组( 厅= 8 ) 。其 余3 个大组的分组与泼尼松婴幼组类似，也分别被分为相似的 1 2 个观察组。长疗程组给药时间为3 周，短疗程组给药时间为 1 0d 。 1 3 标本收集 分别于停药后2 4h 或停药后4 周清晨8 ：0 0 予乙醚吸入并 追加l O 水合氯醛3I 彬k g 麻醉大鼠，经股动脉取血后将大鼠 断头处死，快速解剖分离出完整大脑，4 多聚甲醛固定，再分 别切取含额叶皮层以及视交叉与乳头体间海马组织标本。将 所取血清静置lh 后以30 0 0r I I l i n 速度离心1 0r n i n 并分离血 清，一2 0 冻存备用

21、。 1 4 血清N S E 检测和脑切片免疫组化检测 E L I S A 法( 检测试剂盒购自北京福瑞生物工程公司，使用 美国H u m a r e a d e r 公司生产的全自动酶标仪进行检测) 测血清 神经元特异性烯醇化酶( N e 啪一s p e c i f i cE n o l a s e ，N S E ) 含量。按 照试剂盒说明书进行操作。以光密度值D ( 4 8 8 ) 为纵坐标，标 准品浓度为横坐标，绘制标准曲线，根据样品光密度值D ( 4 8 8 ) 在标准曲线上查出各样品浓度。 免疫组织化学方法检测脑组织凋亡相关基因B c l - 2 、B 戤蛋 白表达( 兔抗大鼠B c

22、l 2 单抗、兔抗大鼠B 眠单抗、D A B 显色试 剂盒、即用型s A B c 免疫组化试剂盒均购自北京中山生物技术 有限公司) 。按照s A B c 免疫组化试剂盒说明书进行操作。分 别在海马C A 3 区、大脑额叶对应区域各取5 个视野( 2 0 l O 倍) ，应用北航C M 绷B 型生物医学图像分析系统测定其平 均光密度。 原位末端标记( T d T - m e d i a t e dd U T PN i c kE n dI J a b e l i f l g ， T U N E L ) 法检测凋亡神经细胞( 原位细胞凋亡检测试剂盒购自 美国R o c h e 公司) 。按照T u

23、N E L 试剂盒说明书进行操作。荧 光显微镜下( 激发波长为4 8 8 砌) 观察细胞染色情况。 1 5 统计学处理 采用S P s S1 1 5 统计软件。计量资料以孟s 表示，采用双 侧显著性检测，多组之间比较采用单因素方差分析。 2 结果 2 1血清N s E 变化 。 连续1 0d 短程给药后，仅在婴幼鼠( 泼尼松及促皮质素) 的治疗剂量组血清N s E 均值有显著增高，分别高于对照组 5 0 6 2 与5 7 3 4 ( P 0 0 5 ) 。其余婴幼组及成年组的N S E 值无明显改变。3 周长程给药后，婴幼鼠泼尼松及促皮质素治 疗剂量组N s E 值增高更明显，其均值较对照分别

24、增高达 1 0 3 2 3 与1 0 0 0 4 ( P 0 0 1 ) ，成年鼠治疗剂量组仅有轻度 增高，超过对照6 6 8 1 与6 0 4 0 ( P O 0 5 ) 。表明激素诱导 的神经元坏死过程因年龄和疗程不同而显示明显差异( 表1 ) 。 无论短程或长程给药，停药4 周后，婴幼及成年鼠各组血 清N s E 值均较对照组无显著性差异，表明激素引起的脑损伤过 程在停药4 周后处于基本静止。 2 2 脑片B c l 2 和B a 】【蛋白的表达 B c l 2 和B a x 免疫组化光密度半定量分析显示：短程给予 泼尼松或促皮质素后，婴幼鼠各组额叶皮层及海马B c l 一2 蛋白 表达

25、与对照组相比均无显著差异，仅在泼尼松及促皮质素的治 疗剂量组有B a x 蛋白表达显著增加( P 0 0 1 ) ，伴B a B c l 2 比 值明显升高，其比值在额叶分别为相应对照组的1 9 9 倍与 2 o o 倍( 1 - 2 1 5 伪O 6 1 0 ，1 2 9 7 似O 6 4 8 ) ，在海马皮层分别为 1 9 l 倍与2 2 9 倍( 1 4 0 9 掷O 7 3 8 ，1 4 5 7 埘O 6 3 7 ) 。而成年鼠 各组的B c l - 2 、B 缸及B a x B c l 2 比值均无明显改变( 表2 、3 ，图 1 A 、B ) 。 万方数据 2 3 1 8 第三 军

26、 医大学 学 报 第3 0 卷 裹l 大鼠血清N S E 浓度( = 8 ，n g I l l l 。i J ) 组别丽丽堂塑丽而广一丽丽堂咝L 丽而r 一 墨绝基! 望查堕生匦! 翌垄墨垫塾! 望坐垩些堡堕盟里查垩墨绝墼! 堑查垩堕笙垦堕望查垩墨绝垦堕垩查垩盛兰垦! 望查 治疗剂量组 8 3 3 7 士2 4 4 5 43 4 2 5 I 9 3 2 8 8 6 3 3 1 4 6 b c6 2 6 7 1 4 9 9 - 9 J 0 7 1 7 1 2 h 4 1 6 7 1 9 3 3 9 1 0 4 2 7 6 6 “ 6 4 7 2 l ，5 3 3 4 小剂b 组 6 3 3 6

27、士2 0 0 33 8 3 3 土l ，5 3 2 6 ，0 3 3 土J 3 4 25 0 9 9 士2 4 6 76 5 4 6 土2 4 5 24 7 0 9 2 0 2 l7 2 9 3 3 2 6 7 5 ，3 5 l 1 9 5 5 对照组 5 5 3 5 1 3 3 9 3 1 4 7 1 5 9 04 3 6 l 1 6 5 l3 7 5 7 1 1 3 45 7 踮1 7 3 23 5 6 l 1 8 3 44 5 5 l I - 8 4 74 0 3 5 1 6 6 l ，4 2 4 30 3 3 28 6 1 8 3 9 3 76 咖O 7 明5 舳l 3 9 9 8 P

28、 0 0 2 8 O 7 2 lO 0 0 20 0 3 50 0 0 80 5 0 40 0 1 00 0 3 4 a ：P O 0 5 ，与对照组比较；b ：P O O l 。与对照组比较；c ：P O 0 5 。与小剂量组比较 表2 短程用药后大鼠额叶及海马皮层表达的B a x 蛋白平均光密度值 n = 8 ，D ( 4 8 8 ) ，i 5 治疗剂量组O 1 9 8 土O 0 4 2 丑b0 2 1 7 0 0 3 7 一bO 0 6 5 土O 0 2 20 0 8 5 O 0 3 30 2 2 3 O 0 4 I b0 2 5 5 0 0 4 2 I b0 0 7 3 O 0 3 1

29、O 0 8 9 0 0 2 l 小剂量组 0 1 2 4 0 0 2 6 O 1 2 4 0 0 3 50 0 8 l O 0 2 9O 0 8 3 土O 0 2 60 1 1 2 0 0 1 5 0 1 0 7 O 0 2 lO 0 9 3 0 0 3 SO 0 9 4 0 0 4 5 对照组 0 鹏3 0 0 1 7 O 0 9 3 0 0 2 90 0 6 4 0 0 2 l0 0 6 7 O 0 2 40 0 9 2 土O 0 2 60 0 9 3 0 0 1 9O 0 8 7 士O 0 3 40 0 6 8 0 0 2 7 ，3 2 9 0 72 9 2 1 41 2 2 41 0

30、3 44 6 1 3 07 5 1 7 60 7 1 01 4 3 2 P 0 0 ( ) o O 0 0 00 3 1 3O 3 7 6O 0 0 00 0 0 0O 5 0 30 2 6 2 a ：P 0 叭与对照组比较；b ：P 0 0 1 ，与小荆量组比较 襄4 长程用药后大鼠额叶及海马皮层B 舡蛋白表达的平均光密度值 n = 8 ，D ( 4 8 8 ) ，孑s 组别瓦型坐1 百一画矿堂塑可百一 额叶 海马 额叶 海马额叶海马额叶海马 治疗剂量组 O 2 1 9 O 0 5 l4 0 2 2 2 0 0 5 6 1 0 0 7 6 0 0 3 8 0 1 7 6 O 0 3 8 |

31、b0 2 4 5 O 0 5 9 O 2 3 0 0 0 5 9 O 0 7 3 0 0 2 20 1 8 8 0 0 5 2 b 小剂量组 0 2 0 6 0 0 4 6 40 1 8 9 O 0 3 l -0 0 7 8 0 0 2 30 0 9 8 O 0 3 3 O 2 2 3 0 0 4 7 -O 2 衄士0 0 4 7 8 0 0 6 6 O 0 2 60 1 1 0 O 0 2 6 对照组 O 0 8 3 0 0 2 l O 0 7 4 O 0 3 50 0 6 8 0 0 2 30 0 7 4 O m B0 0 9 6 0 0 2 8O 册6 0 0 1 8O 0 5 7 0

32、0 2 IO 0 8 4 0 0 2 9 ，2 6 5 6 02 7 2 5 70 2 6 82 2 6 铂2 4 0 8 42 3 8 3 6 0 9 6 91 6 7 0 9 PO 0 0 0 O O 0 7 7 20 0 0 0O 0 0 00 0 0 00 4 1 00 0 0 0 a ：P ( O 0 1 与对照组比较；b ：J P O 0 l ，与小剂量组比较 A ：长程灌胃对照组婴幼鼠额叶皮层；B ：长程治疗荆量给强的松婴幼鼠额叶皮层；C ：长程治疗剂量A C T H 给药成年鼠海马c A 3 区；D ：长程治疗剂 量A C 7 r H 给药后再停药4 周成年鼠海马c A 3 区

33、 图l 免疫组化示脑组织B 觚蛋白表达( S A B C 4 0 0 ) 接受长程治疗剂量泼尼松或促皮质素后，婴幼鼠及成年鼠 的额叶及海马皮层B c l - 2 蛋白表达与对照组相比依然无显著性 差异。然而。与短程用药不同之处是长程用药后，不仅是治疗 剂量，而且小剂量的泼尼松或促皮质素，也将引起婴幼鼠额叶 及海马皮层B a ) 【蛋白表达的显著增高( P O 0 1 ) ，B a B c l - 2 比 值亦升高至对照组的1 9 2 倍至2 4 0 倍问。而成年鼠仅在两 药的治疗剂量长程给药后，海马皮层B a x 蛋白表达出现显著增 加( P O 0 1 ) ，伴B a x B c l 2 比

34、值明显升高。不仅提示海马皮 层町能较额叶对激素的脑损伤作用更敏感，同时也再次显示长 疗程激素会更加激活脑内的细胞凋亡进程( 表4 、5 ，图l C ) 。 停药4 周后，无论婴幼鼠或成年鼠，所有组额叶及海马皮 层的B 积、B c l - 2 蛋白表达与对照组均不再有明显差异说明即 使长疗程用药，停药4 周后激素对各年龄鼠脑内B 瓤与B c l 2 蛋白的表达亦不再有持续影响( 图l D ) 。 表3 短程用药后大鼠额叶和海马皮层B 锻与B d _ 2 蛋白比值( n = 8 ) 泼尼松组促皮质素组 组别要幼鼠成年鼠耍幼鼠 成年鼠 额叶海马额叶海马 额叶海马额叶海马 治疗剂量组1 2 1 5 1

35、 4 0 90 6 0 70 7 0 2 1 2 9 71 4 5 7O 6 2 90 7 3 0 小剂量组 0 7 O 8 3 8 0 6 黼0 6 5 40 6 9 l O 6 9 9O 6 9 40 6 9 I 型墅望 ! ：! ! ! ! ：! ! ! ! ：! 翌! ：堡! ：竺! ! ：竺! ! ：丝! ：! 竺 裹5 长程用药后大鼠额叶和海马皮层B 舡与B d 2 蛋白比值( n = 8 ) 泼尼松组 促皮质素组 组别要幼鼠成年鼠 要幼鼠成年鼠 额叶海马额叶 海马额叶 梅马 顿叶海马 治疗剂量组1 2 5 l 1 4 7 0O 6 7 3 1 2 0 51 3 3 91 4 5

36、6O 6 2 91 2 4 5 小剂量组1 2 2 61 3 0 30 7 3 6O 7 2 61 船2I 3 5 9O 5 “0 彻 对照组 0 6 0 10 5 4 4 0 6 3 6 0 6 5 5O 6 6 70 6 9 40 5 5 9 0 7 万方数据 第2 4 期 王晓宇，等泼尼松与促皮质素致未成熟脑损伤机制的初步探讨 2 3 1 9 A ：长程灌胃对照组婴幼鼠额叶皮层：B ：短程治疗剂量强的松给药婴幼鼠额叶皮层；C ：长程治疗剂量A c T H 给药成年鼠海马；D ：长程治疗刑量给 A C T H 再停药4 周后成年鼠海马 图2免疫荧光示脑组织凋亡神经细胞表达( r U N E

37、 Lx4 0 0 ) 2 3 给予不同疗程不同剂量激素后脑片I T U N E L 阳性 细胞的表达 短程给予泼尼松或促皮质素后，仅在婴幼鼠的治疗剂量组 额叶和海马皮层可见较对照组明显增多的1 f U N E L 染色阳性细 胞，伴荧光亮度显著增强。其余各组与对照组均无明显差异。 长程给药后，婴幼鼠的小剂量组和治疗剂量组额叶及海马皮层 均可见显著增多的T U N E L 染色阳性细胞。而成年鼠仅在长程 治疗剂量泼尼松或促皮质素给药下，海马皮层有T u N E L 阳性 细胞的明显增多( 网2 A 、B 、C ) 。无论短程或长程用药，停药4 周后，两年龄组额叶和海马皮层的1 T U N E L

38、 染色结果与正常对 照组均无明显差异( 图2 D ) 。 3 讨论 糖皮质激素对婴幼儿脑发育可能造成的不良影响 早已受到广泛关注。然而，临床病例观察都不可避免 地存在疾病过程影响，难以确认在发生的脑损伤中有 多大程度直接与激素治疗相关，为此，本实验选用健康 动物进行观察。发现给予婴幼鼠短程治疗剂量、长程 治疗剂量或长程小剂量泼尼松或促皮质素后，H E 和 染色观察可见额叶皮层和海马有明显神经细胞变性坏 死表现。给予成年鼠长程治疗剂量的泼尼松或促皮质 素后，可见海马有明显的神经细胞变性坏死表现。而 停药4 周后，无论大鼠的年龄以及给药的种类、剂量与 疗程如何，神经细胞的病理改变均不再明显。在此基

39、 础上本实验对激素导致脑损伤的机制进行了初步探 讨。 N S E 特异性存在于神经元和神经外胚层组织中， 是当前公认的神经元损伤坏死的特异性生物学指 标旧 。在有关促皮质素和糖皮质激素导致脑损伤机 制的文献中，鲜见有激素与血清N S E 水平相关性的观 察报道。本研究表明给予泼尼松或促皮质素后，有明 显组织学损伤的实验组血清N s E 水平增高，证实神经 元坏死也是激素脑损伤的重要机制之一。有关激素导 致神经元坏死的机制尚不清楚，有研究显示 9 ，糖皮 质激素使已受损的海马神经元代谢障碍因而促使其坏 死。对体外培养的神经元进行的实验亦证实 1 0 1 ，激素 可通过加速神经元的岍消耗使神经元对

40、损伤的易 感性大大增加。 从本研究各组脑片7 I U N E L 染色的对比观察中，还 证实了激素脑损伤中的另一重要机制神经细胞的 过度凋亡。B c l - 2 家族是凋亡调控机制中最重要的蛋 白家族，其中，B c l _ 2 分子具有抗凋亡作用，B a x 也为 B c l - 2 家族成员，但功能与B c l - 2 相反，是促凋亡分子， 干扰细胞内c a 2 + 的稳态浓度，激活c a s p 酗e 1 2 ，从而促 进凋亡发生。B 彬B c l _ 2 的比值可反映细胞凋亡的 发展趋势。本研究中所有发生明显凋亡过程的实验 组，均存在B a x 蛋白表达和B 彬B c l _ 2 比值的

41、明显增 高，B c l - 2 却相对无改变，表明B a 】【表达增强可能是本 研究中激素启动神经细胞凋亡过程的重要因素。 A l m e i d a 等【1 2J 对体外培养神经细胞进行研究，发现糖 皮质激素受体激活可使胞内肿瘤抑制因子p 5 3 水平上 调，后者促使B 觚蛋白表达增高3 1 4J ，进而诱导凋亡 发生。 本研究通过多角度的交叉对比分析显示，在临床 用药剂量范围内，泼尼松和促皮质素均易引起婴幼期 大脑，尤其海马皮层神经细胞的凋亡与坏死，且这2 种 损伤随疗程延长而进行性加重。然而，无论短程或长 程给药，停药4 周后脑内均不再继续有凋亡和坏死征 象。因而，本实验结果认为停用激素

42、4 周后，将不再有 活动性的激素脑损伤。 本研究对激素脑损伤机制的探索发现如下规律： 年龄依赖性。婴幼鼠较成年鼠脑内有更明显凋亡、 坏死过程；剂量依赖性。治疗剂量组引起的凋亡、坏 死过程大多比小剂量组明显；疗程依赖性。无论激 素的种类与剂量，也无论婴幼鼠或成年鼠，长程给药后 导致的脑损伤多比短程给药后更为明显。损伤过程 的自限性。停药后无论大鼠的年龄或激素种类及疗 程，脑内均不再有继续过度凋亡与坏死的明显证据； 通过对比观察显示，成年鼠在长程治疗剂量给药后， 仅发现海马皮层有明显的神经细胞凋亡，表明海马皮 层较额叶的神经细胞对激素的脑损伤作用有更大敏感 万方数据 2 3 2 0 第 三 军医大

43、学学报 第3 0 卷 性。这些规律与本研究对于激素所导致的脑组织病理 学损伤的规律完全吻合，而且在前期组织病理学研究 中发现有明显组织学损伤的实验组，在本研究中也显 示有N s E 的更明显升高和r r U N E L 阳性细胞增多，充 分说明激素所诱导的凋亡与坏死是激素导致脑损伤的 重要机制。 参考文献： 1 G l a 朋D G ，H r 扯h o v yRA 。F r o 乱J DJ r ，盯矗c 咖p u t e d t o m o g m p h y i ni n 胁t i l eB p 咖幛：e d t s0 fh 伽r I a lt l l e r a p y J P e d i

44、 且t rN e u m l ， 1 9 8 6 ，2 ( 1 ) ：2 3 2 7 2 P 撕k hNA ，k k yRE ，K e n n e d yKA ，以耐P 0 8 t n 8 t a ld e x 栅e t l l a - B 帅et I 朗叩y 肌dc e 陀b 糟lt i 柏u ev o l u 嘲i ne x t I 屯m e l yl o wb i I lw e i g h i 血n t B J P e d j a 晡c s ，2 0 0 7 ，1 1 9 ( 2 ) ：2 6 5 2 7 2 3 Y e hTF ，u nYJ ，L i nHc ，e I 口f o u l

45、 c o m 船a t h Ia g ea f t e rp 0 8 t n a t a ld e 】【a l n e t h 咖n e 山e r a p yf 打l u n gd i s e a 鸵o fp 陀叫面t y J NE n - g lJM e d ，2 0 0 4 ，3 5 0 ( 1 3 ) ：1 3 0 4 一1 3 1 3 4 M e r I 【eDP ，G i e d dJN ，K e i lMF ，村面c h i l d 弛n 麟p e r i e n c ec o g l I i t i v e d e c l i n ed 唧i t e 他v e 砌0 fb m i

46、 na t r 叩h y ey 哪a f I e rr e l u 0 f c u s h i n gs y n d m m J Jc l i nE n d o c r i n o lM e l a b 。2 0 0 5 ，9 0 ( 5 ) ：2 5 3 l 一2 5 3 6 5 K o h l e r _ P 耐BA ，P e y T i 岫H ，V i n c e n tD 1 I l h a l e dc o r t i 0 0 i d s 朋ds y s t e m - i cs e c o n d a r ye c 协：c o n 咖e 瑁i J A l l e r gl 姗u n

47、 o l ( P 撕B ) ， 2 0 0 2 ，3 4 ( 9 ) ：3 3 3 3 3 6 6 D i c k s t e i nG ，s p i g e lD ，A r a dE ，d 以0 n er n i c g m mi s 山el o w 曲t A C T Hd et oc a u s eam a x i m a lo 叫t i 8 0 lr e 8 p o n 眈T h e mi sn od i u r I l a l v “a t j 彻0 fc 硎8 0 l 麟p o n 眈t o 刚| b m 日x i m a IA 叫i 鲥埘u l a I i 加 J E JE n d o c r i n o I ，1 9 9 7 ，1 3 7 ( 2 ) ：1 7 2 一1 7 5 7 H r 加吖RA ，F r 嘴tJDJ r ，G l a 髓DG H i g 1 d e ，l o 鸭- d u m t i 帆 v e 珀u BI o w d o 鸵 B h o n d 啪t i o nc o r t i c 咖i nt | I e m p yf 打i 抽t i k s p a 8 m J