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1、基础研究 左旋多巴诱发异动症大鼠模型的制作 及其行为学评估 徐岩 孙圣刚 曹学兵 【摘 要】 目的 探讨左旋多巴诱发异动症 （LID） 大鼠模型的行为学特点， 以及探寻有效评估异动症大 鼠行为学特点的客观方法。方法 对 6-羟多巴胺损毁致帕金森病 （PD） 大鼠给予左旋多巴治疗 21 d， 观察其 行为学改变， 并对其异常不自主运动 （AIM） 进行评分。采用免疫组织化学方法观察大鼠黑质 （SN） 及腹侧被 盖部 （VTA） 区域酪氨酸羟化酶 （TH） 免疫阳性细胞的数量。结果 PD 大鼠在慢性左旋多巴治疗过程中， 会逐 渐出现 AIM， 各个体间 AIM 开始出现的时间、 表现形式及严重程度
2、等差异较大。LID 组与非 LID 组比较， 前者 VTA 部位 TH 阳性神经元数量明显减少， 而 SN 部位则减少不显著。NMDA 受体拮抗剂 MK-801 能明显抑制 大鼠刻板动作的发生， 而对其旋转行为无明显影响。经左旋多巴治疗后， PD 大鼠损毁灶对侧前肢运动功能明 显增强， 且经左旋多巴持续治疗后， 大鼠逐渐出现 AIM 并呈进行性发展， 对侧前肢运动功能亦逐渐减退。结 论 由慢性左旋多巴治疗 PD 大鼠诱导其产生的 AIM 与人类左旋多巴诱导的异动症 （LID） 具有相似的特点， 为人类 LID 的研究提供了有效、 经济、 实用的动物模型； 同时发现 AIM 评分方法及动物前肢功
3、能实验是评估 PD 大鼠异动症及运动功能减退的有效方法。 【关键词】 左旋多巴； 异动症； 异常不自主运动； 大鼠 Preparation and assessment of the behavior of the rat model of levodopa-induced dyskinesias XU Yan， SUN Sheng-gang， CAO Xue-bing. Department of Neurology，Union Hospital， Tongji Medical College，Huazhong University of Science and Technology，Wuh
4、an 430022，China 【Abstract】 Objective To study the behavioral characteristics of a rat model of the levodopa-induced dyski- nesia（LID）and the related factors，and to define clinically the relevant methods for assessing akinesia and dyskine- sia in LID rats.Methods Unilaterally lesioned rat model of Pa
5、rkinsons disease using 6-hydroxydopamine were treated by levodopa and benserazide once daily for 3 weeks，on the 21st day the acute systemic administration of MK- 801 was performed 15 min prior to levodopa treatment to observe the behavior （abnormal involuntary movement，rota- tion behavior and foreli
6、mb stepping）and to estimate the quality of AIM by using the rat AIM rating scale. Immuno- histochemical technique was used to measure the number of TH-positive neurons in the substantia nigra（SN）and ventral tegmental area（VTA） ，which was then correlated to the AIM scores.Results Pulsatile treatment
7、with a subthreshold dose of levodopa gradually induced abnormal involuntary movement（AIM） ，including stereotypy（limb dyskinesia， axial dystonia and masticatory dyskinesia）towards the side contralateral to the dopamine-denervated stria- tum and increased rotational behavior. The onset of AIM and moto
8、r pattern of each subtype was highly stereotypic across individual rats，and the proportion of each subtype was not consistent among individual rats. The number of TH-positive neurons in the VTA，but not in the SN，was significantly decreased in the LID rats compared with the non-LID rats. MK-801 preve
9、nted stereotypy but not rotational behavior. Contralateral forepaw performance was signi- ficantly improved after levodopa treatment，but gradually reduced with more and more severe AIM following repeated levodopa therapy.Conclusion Levodopa-induced rat AIM model of PD demonstrated similar properties
10、 with the levodopa-induced dyskinesia（LID）in PD patients，and provided an effective tool for LID study. AIM rating and forelimb stepping test are useful for evaluating the dyskinesia and akinesia of PD rats. 【Key words】 Levodopa； Dyskinesia； Abnormal involuntary movement； Rats 作者单位： 430022 武汉， 华中科技大学
11、同济医学院附属协和医院神 经内科 由左旋多巴诱导的异动症 （levodopa-induced dys- kinesia， LID） 是左旋多巴长期治疗帕金森病 （Parkinson disease，PD） 过程中普遍出现的并发症之一， 主要表现 为舞蹈症及手足徐动症， 严重影响了 PD 患者的日常 生活质量， 目前对 LID 的发生机制仍不完全清楚， 其临 床治疗也比较棘手， 故解决这一难题已成为 PD 研究 工作中的一项重要课题。由于任何实验研究均需要可 靠的动物模型支持， 目前 MPTP 灵长类模型因其行为 学与人类相似已成为研究 LID 的最佳动物模型， 但其 价格昂贵、 操作复杂、 来
12、源困难限制了 LID 的研究进 展； 而 6-羟多巴胺立体定向损毁 PD 大鼠模型是目前 主要的 PD 动物模型之一， 该方法稳定、 操作简单， 已 946中华物理医学与康复杂志 2005 年 11 月第 27 卷第 11 期 Chin J Phys Med Rehabil，November 2005，Vol. 27，No. 11 广泛用于 PD 研究中， 但因其不能产生与人类异动症 相似的表现形式， 所以限制了在 LID 研究中的应用。 近年来国外研究表明， 大鼠经长期左旋多巴治疗后也 会出现一些异常不自主动作 （ abnormal involuntary movement， AIM） ，
13、与人类 LID 在许多方面具有相似之 处。因此， 我们在上述基础上研究了大鼠经慢性左旋 多巴治疗后的 AIM 行为学特点， 并探讨用于评定大鼠 AIM 及运动迟缓等行为学改变的客观方法， 为 PD 大 鼠在 LID 研究中的进一步应用提供理论依据。 材料与方法 一、 LID 大鼠模型制备及分组 共选取成年雌性 SD 大鼠 60 只， 体重 200 250 g， 采用改良 Thomas 方法 （6-羟多巴胺立体定向注射术） 1 损毁其左侧黑质多巴胺能神经元， 制作偏侧 PD 大鼠模 型； 于2 周后用阿普吗啡 （0. 5 mg/ kg 体重， 腹腔注射） 诱导其向对侧旋转， 记录 30 min
14、内的旋转圈数， 如平均 转速 7 转/ min则视为 PD 模型制作成功。在注射阿普 吗啡3 d 后， 向 PD 大鼠腹腔注射左旋多巴 （10 mg/ kg体 重） 及外周脱羧酶抑制剂苄丝肼 （2.5 mg/ kg体重） ， 每天 1 次， 连续注射21 d。将经上述处理后的大鼠按其行为 表现分为 LID 组、 MK-801 （NMDA 受体拮抗剂） 组及非 LID 组， 每组各12 只， 余下的24 只大鼠则从本次研究中 剔出； 其中 LID 组是注射左旋多巴21 d内出现 AIM 的大 鼠， MK-801 组也是在注射21 d 内出现 AIM 且于第21 d 注射左旋多巴前 15 min
15、腹腔注射 MK-801 （0.1 mg/ kg 体重） 的大鼠， 非 LID 组是注射左旋多巴 21 d 内始终 未出现 AIM 的大鼠。各组大鼠均于第 21 天注射左旋 多巴约 2 h 后处死。 二、 行为学实验方法 （一） 行为学观察与 AIM 评分 各组大鼠于左旋多巴治疗期间每周进行 2 次 AIM 评分， 每次评定结果由经左旋多巴治疗后每间隔30 min 的 AIM 总分数组成， 每次共连续评定 4 组数据 （持续 120 min） 。将 AIM 分为 4 个部分 （前肢 AIM、 口面部 AIM、 轴性 AIM 及运动 AIM） 进行评定， 每部分又根据其 有或无以及严重程度划分为五
16、个等级 （0 4 分） ， 其中 0 分： 无； 1 分： 偶尔出现； 2 分： 经常出现； 3 分： 持续存在， 刺激使之停止； 4 分： 持续存在， 刺激也不能使之停止。 理论上1 只大鼠1 次用药后的 AIM 最高评分为64 分。 （二） 对侧旋转行为评定 各组大鼠于左旋多巴治疗期间每周评定对侧旋转 行为2 次， 观察并记录左旋多巴注射结束 2 h 内的旋转 行为特点， 并计算用药后每 5 min 的旋转圈数， 将大鼠 旋转圈数增至平均旋转圈数一半时的首个 5 分钟与降 至该值时的首个5 分钟之间的时间段视为药效期， 计算 药效期的长短及该时间段内平均每5 min 的旋转圈数。 （三）
17、前肢运动功能测定 （跨步实验） 为测定多巴胺神经元减少及左旋多巴治疗对大鼠 肢体运动功能的影响， 我们采用 Chang 等 2介绍的实 验方法于每次左旋多巴治疗前及治疗 30 min 后进行 大鼠前肢运动功能测定： 实验者一手固定大鼠躯体后 半部及后肢， 使其离地， 另一手则固定一侧前肢并使另 一前肢着地， 以大鼠正手方向斜向一侧移动大鼠 （于 5 s内移动 90 cm） ， 记录移动时大鼠着地侧前肢触、 离 地步数， 交替测量两侧前肢的跨步数。 三、 免疫组织化学染色及图像分析 各组大鼠采用4%多聚甲醛经心脏灌注处死， 取脑 组织修块后置于同一固定液中后固定 6 h， 随后移入 20%蔗糖液
18、中过夜， 待其沉底后用冰冻切片机切取 30 m厚冠状切片， 选取前囟后 5. 0 mm 黑质 （substantia nigra，SN） 层面， 采用 SP 法进行免疫组织化学染色。小 鼠抗酪氨酸羟化酶 （tyrosine hydroxylase， TH） 单克隆抗 体浓度为1:800。采用北航多媒体真彩色病理图文分析 系统对 SN 及 VTA 部位切片图像进行分析， 计算损毁侧 阳性细胞占对侧阳性细胞数量的百分比。 四、 统计学分析 研究所得数据以 （x - s） 表示， 组间差异的显著性 比较采用单因素方差分析， 两两比较选用 q 检验， 两组 间的比较采用 t 检验， P 0. 05）
19、； 对侧旋转行为与刻板动作几乎同时发生， 但当 刻板动作逐渐趋于严重时， 而对侧旋转行为则逐渐减 弱。MK-801 组大鼠平均旋转圈数及药效期长短与 LID 组比较， 差异均无统计学意义 （图 2） 。 图 2 MK-801 对 LID 大鼠对侧旋转行为的影响 （三） 大鼠肢体运动功能测定 各组大鼠经左旋多巴治疗前， 其右前肢步数均较 左前肢明显减少 （P 0. 05） 。MK-801 组大 鼠经左旋多巴治疗后， 其右前肢步数较治疗前明显增 加， 同时也显著多于 LID 组大鼠治疗后的右前肢步数 （P 0. 05） ， 分别为对侧的 （2. 66 0. 94） %及 （3. 17 0. 67）
20、 %。 图 3 左旋多巴治疗期间大鼠右前肢跨步数的变化及 MK801 对跨 步数的影响 注： A 正常侧， B LID 组第 1 天， C LID 组第 7 天， D LID 组第 14 天， E LID 组第 21 天， F MK801 组第 21 天； 与第 1 天左旋多巴治疗后右前肢跨步数比较， #P 0. 05 讨 论 本研究结果表明 PD 大鼠经间断性左旋多巴治疗 后， 大多数动物逐渐出现 AIM， 影响了 6-羟多巴胺损毁 灶对侧躯干、 前肢及口面部肌肉的运动功能。各动物 间 AIM 的易患性、 开始出现时间、 严重程度及表现形式 等均存在明显的个体差异性， 并且随着左旋多巴治疗
21、时间的延长， 其 AIM 程度越来越重， 这与 Lee 等 3的研 究结果基本一致。相关临床调查结果表明 4， 约有 30% 80% 的 PD 患者经长期左旋多巴治疗后可出现 LID， 并且随着疾病的加重及治疗时间的延长， 其异动 症程度和发生频率均会增加； PD 患者的 LID 多为单侧 性发作， 主要累及 PD 症状严重侧肢体， 而且各个体间 LID 的易患性、 LID 严重程度、 表现形式、 发生时间等也 均存在显著性差异， 提示 PD 大鼠 AIM 与人类 LID 在 156中华物理医学与康复杂志 2005 年 11 月第 27 卷第 11 期 Chin J Phys Med Reha
22、bil，November 2005，Vol. 27，No. 11 表现特性上具有相似性。近年来有研究表明， AIM 大 鼠纹状体内阿片肽前体 mRNA 及 Fos B 表达增加、 大 脑皮质和基底节区阿片受体结合力改变 5， 6， 这些均与 涉及灵长类动物或人类 LID 的研究结果一致， 表明大 鼠 AIM 与灵长类 LID 具有相似的细胞及分子机制。 Lundblad 等 7研究发现， 长效 DA 受体激动剂不能诱 导 PD 大鼠产生 AIM， 而且对 PD 患者具有明显抗异动 症作用的非 DA 类药物也能减少 PD 大鼠 AIM 的发生。 本研究发现， NMDA 受体拮抗剂 MK-801
23、能明显减少 PD 大鼠 AIM 的发生， 提示大鼠 AIM 与灵长类动物 LID 具有相似的特点。以上研究均提示， 左旋多巴诱导 PD 大鼠出现的 AIM 与灵长类动物 LID 具有许多重要的相 似性， 可以作为研究 LID 的啮齿类动物模型。但本研究 同时也显示， MK-801 仅表现为抑制大鼠刻板动作的发 生， 而对大鼠损毁灶对侧肢体的旋转行为却无明显影 响。Lundblad 等 7研究发现， 溴隐停虽然不能引起 PD 大鼠刻板动作的发生， 但却与左旋多巴一样， 能引起大 鼠对侧旋转行为的进行性加重， 并且旋转行为更加显 著， 所以动物旋转行为与人类异动症之间的关系不甚明 确， 不能作为
24、PD 大鼠治疗结果的疗效评定指标。 动物实验表明， 并不是所有 PD 大鼠经左旋多巴治 疗后均发生 AIM，并且各只大鼠发生 AIM 的严重程度 间也存在较大差异。Westin 等 8研究发现， PD 大鼠发 生 AIM 的严重程度与纹状体区前强啡肽原 mRNA、 苍 白球区 GAD67 mRNA 水平及外侧纹状体 GAD67 mR- NA 水平具有强相关性。本研究结果发现， LID 组与非 LID 组比较， 前者 VTA 部位 TH 阳性神经元数量明显 减少， 而 SN 部位则无显著性变化； 同时相关研究表明， VTA 外侧部的多巴胺神经元投射到尾状核内侧部， 能 阻止损毁 SN 所致的多巴
25、胺受体超敏 1， 本研究也发现 LID 组大鼠多巴胺神经元减少主要发生在 VTA 区外侧 部。因此， 我们推测当 VTA 区多巴胺神经元损毁较少 时， 能部分阻止纹状体区突触后神经元的变化， 从而抑 制 LID 发生； 纹状体区 DA 失神经支配与慢性左旋多 巴治疗联合引发的纹状体神经元突触后改变可能是影 响 PD 大鼠 AIM 易患性及个体间差异程度严重的主要 因素。 本研究参照 Lee 等 3介绍的 AIM 评分标准对大鼠 进行 AIM 评分， 结果发现随着左旋多巴治疗时间的延 长， 大鼠 AIM 越来越严重， 其 AIM 评分也越来越高； 而 MK-801 则能明显减少大鼠 AIM 的发
26、生， 使 AIM 评分 显著下降， 表明根据 AIM 评分能判断大鼠 AIM 的严重 程度及抗异动症药物的治疗效果， 提示 AIM 评分适用 于对 LID 大鼠异动症的定量分析。 PD 患者的主要症状之一是运动减少， 左旋多巴治 疗可有效缓解这一症状， 但长期治疗所诱导的异动症 严重影响了随意运动的执行， 破坏了 PD 患者的正常活 动； 而相关的治疗除了要减少异动症的发生之外， 还应 保持其抗 PD 的功效， 所以在采用 LID 大鼠模型对药 物、 手术及物理因素等治疗手段进行筛选时， 需要一种 用于评定 PD 运动减少的实验方法， 同时这种方法还应 对 DA 神经元损毁及抗 PD 作用敏感
27、。本研究结果表 明， 跨步实验是测定 6-羟多巴胺损毁 PD 大鼠脑内组 织， 从而导致其肢体运动功能障碍较敏感的方法之 一 2， 实验发现6-羟多巴胺能显著减少大鼠损毁灶对侧 前肢的跨步数； 而经左旋多巴治疗后， 大鼠前肢跨步数 明显增多， 但随着 AIM 的出现及病情程度加重， 大鼠前 肢跨步数亦逐渐减少， 而 MK-801 在阻止 AIM 发生的同 时， 亦可明显增加经左旋多巴治疗后大鼠的前肢跨步 数， 表明跨步实验可用于评价抗异动症药物的疗效， 对 于抗 PD 药物及抗异动症药物的筛选具有重要意义。 综上所述， 左旋多巴诱导 PD 大鼠出现的 AIM 与 PD 患者 LID 在表现特征
28、、 分子机制及药理学特征等方 面均具有相似性， 可作为探讨人类 LID 的动物模型用 于 PD 及 LID 研究； AIM 评分方法及跨步实验可分别用 于评定 PD 大鼠异动症程度及运动减少， 为筛选具有抗 异动症作用的抗 PD 治疗手段提供理想的行为学实验 方法。 参 考 文 献 1 Thomas J， Wang J， Takuba H， et al. A 6-OHDA induced selective Parkin- sonian rat model： further biochemical and behavioural characterization. Exp Neurol， 19
29、94， 126： 159-167. 2 Chang JW， Wachtel SR， Yong D， et al. Biochemical and anatomical cha- racterization of forepaw adjusting steps in rat models of Parkinsons di- sease： studies on medial forebrain bundle and striatal lesions. Neurosci， 1999， 88： 617-628. 3 Lee CS， Cenci MA， Schulzer M， et al. Embryo
30、nic ventral mesencephalic grafts improve levodopa-induced dyskinesia in a rat model of Parkinsons disease. Brain， 2000， 123： 1365-1379. 4 Nutt JG. Levodopa-induced dyskinesia： review， observation and specula- tions. Neurology， 1990， 40： 340-345. 5 Westin JE， Andersson M， Lundblad M， et al. Persisten
31、t changes in striatal gene expression induced by long-term L-DOPA treatment in a rat model of Parkinsons disease. Eur J Neurosci， 2001， 14： 1171-1176. 6 Johansson PA， Andersson M， Andersson KE， et al. Alterations in cortical and basal ganglia levels of opioid receptor binding in a rat model of L-DO-
32、 PA-induced dyskinesia. Neurobiol Dis， 2001， 8： 220-239. 7 Lundblad M， Andersson M， Winkler C， et al. Pharmacological validation of behavioural measures of akinesia and dyskinesia in a rat model of Parkin- sons disease. Eur J Neurosci， 2002， 15： 120-132. 8 Westin JE， Andersson M， Lundblad M， et al. Persistent changes in striatal gene expression induced by long-term L-DOPA treatment in a rat model of Parkinsons disease. Eur J Neurosci， 2001， 14： 1171-1176. （修回日期： 2005-09-25） （本文编辑： 易 浩） 256中华物理医学与康复杂志 2005 年 11 月第 27 卷第 11 期 Chin J Phys Med Rehabil，November 2005，Vol. 27，No. 11