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1、实验研究 异种角膜基质异位植入后免疫病理学研究 陈根云 吴 静 徐锦堂 赵松滨 Immunopathologic study on fresh and dehydrated xenografts in porcine- to-mouse model of corneal stroma hetertopic xenotransplantation Chen Genyun， Wu Jing， Xu Jintang， Zhao Songbin. Department of Ophthalmology， Medical College of Jinan University， Guangzhou 51
2、0632， China Abstract Objective To observe the immunopathologic alterations of the fresh and dehydrated xenografts in a porcine-to- mouse model of corneal stroma hetertopic xenotransplantation and assess its immunocompatibility. Methods Twenty-four mice were randomly divided into 4 groups. The fresh
3、and dehydrated corneal stroma from porcine corneas were subcutaneously implanted into the mice of experimental groups， and xenogeneic dermas implantation mice and sham operation mice served as positive control and negative control group， respectively. Grafted corneal stroma was excised 30 days after
4、 grafting for histopathologic study， and the changes of total T lymphocyte and its subset counts in the xenografts were observed using the direct immunofluoresecent technique. Results No edema and ulceration were seen in the graft area in experiment groups 1 month after surgery by clinical observati
5、on. A small quantities of lymphocyte， macrophages， CD3 （ + ）T cells， CD4 （ + ）T cells and CD8 （ + ）T cells infiltrated into both of the fresh and dehydrated xenografts at month 1 in postimplantation， but number of infiltrated cells （79. 00 9. 78 in fresh xenograft group， and 71. 83 9. 54 in dehydrat
6、ed xenograft group） was less than that of xenogeneic dermas group （134. 50 19. 71） （P 0. 05） ；（3） 3 个组的 CD4 + / CD8 + 的统计学处理结果与 CD4 + 淋 巴细胞数的处理结果一致。 91 眼科研究 2006 年 2 月第 24 卷第 1 期 表 1 术后 1 个月植入材料内浸润 的淋巴细胞计数结果（x s） Table 1 Numbers of T cells infiltrated into three kinds of xenografts 1 month in postop
7、eration （x s， n =6） GroupCD4 +CD8 +CD4 + / CD8 + Xenogeneic dermas134.50 19.7165.67 8.122.05 0.17 Fresh xenografts79.00 9.78b59.33 10.37a1.35 0.20b Dehydrated xenografts71.83 9.54b61.50 6.47a1.17 0.12b F36.840.8746.30 P0.000.440.00 aP 0. 05，bP 0. 05 vs Xenogeneic dermas group （one-way ANOVA， SNK-q t
8、est） 3 讨论 关于异种角膜基质的免疫原性和免疫相容性， 有资 料表明其对受体外周血淋巴细胞干扰程度小 2。但是， 曾经有学者认为， 外周血淋巴细胞测定虽可以较好地反 应机体免疫功能紊乱， 但在抗原性较低的基质移植中有 一定的局限性， 结合局部组织中淋巴细胞的变化更能准 确地反应移植后的免疫状况 3。由于角膜基质组织结 构特殊、 重量较小， 植入体内后对全身免疫状态的影响 程度可能相对较小， 所以在评价其免疫相容性的实验中 更应该关注其植入的部位、 受体局部免疫功能状态的变 化以及角膜基质组织本身的免疫病理变化。 在取材时机的选取上， 本研究通过临床观察， 发现 异种皮肤植入后 1 个月时
9、受体的组织反应和免疫反应 较重。所以， 在术后 1 个月时取材进行病理学和免疫 荧光细胞化学检测应能较好地观察到植入材料的免疫 病理变化， 客观地评价其免疫原性和免疫相容性。在 本研究中， 新鲜的和甘油脱水的猪角膜基质内有少量 的淋巴细胞、 巨噬细胞浸润， 表明此两种猪角膜基质均 诱发了小鼠一定程度的组织反应和免疫反应， 但是反 应的程度既明显轻于异种皮肤， 也轻于其他学者观察 到的异种角膜三层组织植入到皮下的反应程度 4。 在淋巴细胞亚群的分类上， 主要以 CD4 + 淋巴细胞浸 润为主， CD4 + / CD8 + 有改变， 但也未达到异种皮肤 CD4 + 淋巴细胞的浸润程度。结合临床观察
10、结果， 可 以认为新鲜的和甘油脱水的猪角膜基质皮下植入 1 个 月时未引发小鼠的局部排斥反应。这和 Tanaka 将猪 角膜基质和内皮组织植入到小鼠前房所得到的结 论 5一致。综合上述横向、 纵向对比分析， 可以得出 以下结论：（1） 新鲜的、 甘油脱水的异种角膜基质并不 是完全缺乏免疫原性， 只是较弱， 未达到引起排斥反应 的阈值。 （2） 异种角膜基质相对于角膜的完整三层组 织来说， 局部免疫干扰程度小， 这和其他学者从外周血 检测得到的结论 2一致。角膜基质的这些免疫学特 性可能主要和其结构构成和免疫细胞相对稀少有关。 因为有研究表明起抗原递呈作用的郎格罕斯细胞主要 存在于上皮层 6。
11、病理学观察显示， 甘油脱水猪角膜基质部分发生 了坏死， 而新鲜猪角膜基质未见坏死， 只表现为胶原纤 维变性， 表明甘油脱水材料引起的组织反应重于新鲜 材料， 而且易于降解。究其原因可能和甘油脱水工序 对材料的组织结构造成一定程度的损伤有关。蓝平的 研究提示有这方面的原因 7。从淋巴细胞亚群的变 化程度上分析， 尚不能认为新鲜的和甘油脱水的猪角膜 基质的局部免疫干扰程度有差异， 表明甘油脱水工序在 本研究中并没有起到减弱材料免疫原性的作用， 原因可 能为：（1） 新鲜角膜基质的免疫原性只占角膜总细胞免 疫原性的1. 62% 2， 在如此低的数量级上， 采用甘油脱 水减弱材料的免疫原性， 其作用微
12、乎其微。 （2） 材料内 的甘油对机体局部免疫状态可能产生一定程度的干扰， 影响甘油脱水材料的免疫相容性。结合组织病理学观 察结果， 提示新鲜异种角膜基质的早期组织相容性和免 疫相容性要优于甘油脱水异种角膜基质。 评价异种角膜基质免疫相容性的目的是尝试将它 用作角膜体外重建的载体材料。本研究中采用异位植 入的方法虽然能够较好地反映异种角膜基质自身的免 疫相容性和受体致敏的相关信息， 但是也可能一定程 度地放大了异种角膜基质的免疫效应和组织效应。换 言之， 异种角膜基质正位植入产生的免疫反应和组织 反应可能更为轻微， 表明其免疫相容性好， 具有作为角 膜体外重建载体材料的免疫学基础。 参考文献
13、1 郝念， 吴静， 李姝燕， 等. 角膜体外重建异种生物载体材料生物相容性 研究 J . 眼科研究， 2004， 22 （2） : 113 -116 2 王智崇， 葛坚， 徐锦堂， 等. 角膜不同组织免疫原性分析 J . 中华眼科 杂志， 2002， 38 （9） : 535 -538 3 孙新君， 王正国， 朱佩芳， 等. 不同处理异种骨植入后受体 T 淋巴细胞 亚型的变化 J . 中国临床康复， 2004， 8 （11） : 2044 -2045 4 吴京， 周国筠， 傅瑞， 等. 角膜移植排斥反应的实验研究 模型的建 立及组织病理学观察 J . 眼科新进展， 1995， 15 （4） :
14、 11 -13 5 Tanaka K， Streilein JW. Immunobiology of xenogeneic cornea grafts in mouse eyes. II. Immunogenicityofxenogeneiccorneatissuegrafts implanted in anterior chamber of mouse eyes J . Transplantation， 2000， 69 （4） : 616 -623 6 Hori J，Joyce N，Streilein JW. Epithelium-deficient corneal allografts display immune privilege beneath the kidney capsule J . Invest Ophthalmol Vis Sci， 2000， 41 （3） : 443 -452 7 蓝平， 高明宏， 阎玲， 等. 长期甘油保存角膜的光镜和电镜观察及临床 应用 J . 解放军医学杂志， 2001， 26 （3） : 206 （收稿： 2005 -10 -11 修回： 2005 -11 -28） （本文编辑： 胡纯钢） 02 Chin Ophthal Res， February 2006， Vol. 24， No. 1