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1、第 15 卷第 5 期 2005 年 10 月 江 苏 大 学 学 报 （医 学 版） Journal of Jiangsu University （medicine） Vol. 15No. 5 Oct. 2005 汗防已甲素联合塞来昔布逆转白血病细胞耐药的体外研究 顾红兵1， 2，许文林3，王法春3，江云伟3， 缪竞诚1 （1. 苏州大学医学院基础医学系， 江苏 苏州 215007； 2. 江苏大学附属人民医院检验科； 3. 江苏大学附属人民医院中心实验室， 江苏 镇江 212002） 摘 要 目的：通过汗防已甲素联合塞来昔布逆转白血病细胞耐药的实验研究， 探讨有关多药联合逆转肿瘤细胞 的耐
2、药机制。方法：噻唑蓝 （MTT） 比色法检测汗防已甲素联合塞来昔布对 K562 细胞的细胞毒试验； 用流式细胞技术 （FCM） 检测各组 K562 细胞内的药物浓度； 用 FCM 检测各组的早期凋亡 （Annexin V） ； 用 RT-PCR 检测各组 COX-2/ COX-1 的表达。结果：汗防已甲素联合塞来昔布对 K562 细胞的抑制作用与其他组相比有显著性差异 （P 0. 05） ； 细 胞内的药物浓度高于其他实验组； 诱导凋亡率 （17. 67%） 高于其他实验组； COX-2/ COX-1 的表达明显低于其他实验 组。结论：汗防已甲素联合塞来昔布逆转 K562 细胞的效果明显， 能
3、够增加 K562 细胞内药物浓度， 诱导细胞凋亡， 降 低 COX-2/ COX-1 的表达。 关键词 汗防已甲素；塞来昔布；耐药性；多药；细胞系；K562 细胞；凋亡 中图分类号 R -33 文献标识码 A 文章编号 1671 -7783 （2005） 05 -0390 -04 In Vitro Study of the Reversal Effect of Tetrandrine Combining with Celecoxibon Multidrug Resistance in Leukemia Cell Line GU Hong-bing1， 2，XU Wen-ling3，WANG F
4、a-chun3，JIANG Yun-wei 3，MIAO Jing-cheng1 （1. Department of Celluar and Molecular Biology，Medical School of Suzhou University，Suzhou Jiangsu 215007； 2. Clinic Lab； 3. Central Laboratory，the Affiliated People s Hospital of Jiangsu University，Zhenjiang Jiangsu 212002， China） Absract Objective：To invest
5、gate whether tetrandrine combining with celecoxib can reverse multidrug resistance in leukemia cell line K562 and explore its possible mechanism. Methods：Cytotoxic effect of tet- randrine alone and tetrandrine combining with celecoxib on K562 cell line was detected using MTT colori- metry；apoptosis
6、and intracelular drug concentration were determined by flow cytometry （FCM） ；the expres- sion of COX-2/ COX-1 was detected using RT-PCR. Result：Compared with other groups，combination of tetrandrine and celecoxib had stronger inhibition effect on K562 cell line and higher intracelular drug con- centr
7、ation and apoptisis percentage （17. 67%） ，however，the expression of COX-2/ COX-1 was lower than other groups. Conclusin：Tetrandrine combining with celecoxib can reverse the multidrug resistance，the underlying mechanism may attribute to increaseing intracelular drug concentration、 induction of apopto
8、sis and down-regulation of mRNA expression of COX-2/ COX-1。 Key words Tetrandrine；Drug resistance；Multiple；Celecoxib；Cell line， K562；Apoptosis 白血病细胞多药耐药 （Multidrug resistance， MDR） 的出现是化疗失败的主要原因， 是多因素和 多种机制共同作用的结果。某些研究表明， 白血病 获得性 MDR 的主要机制与多药耐药基因 mdr1 及 其蛋白 P-糖蛋白 （P-gp） 高表达相关， 他们能将细胞 内的化疗药物主动泵出细胞外，
9、致使细胞耐药1， 2。 汗防已甲素 （Tetrandrine， TTD） 是中药汗防己科千金 藤属植物粉防己块根中的主要成分， 是一种非特异 性的 Ca2 +通道阻滞剂， 研究表明他可以调节多种 P- gp 介导的 MDR 细胞株的耐药 3。塞来昔布 （Cele- coxib CELE） 是一种非甾体类的抗炎药， 药动力学研 究显示其为长效药物， 选择性抑制 COX-2 的活性， 基金项目镇江市社会发展资助项目 （SH 2004026） 作者简介顾红兵 （1971 - ） ， 男， 主管技师， 在读硕士研究生， 从事临床生物化学检验。 下调相关基因， 增强化疗药物对肿瘤细胞的杀伤作 用， 逆转
10、肿瘤细胞的多药耐药性 4。我们通过汗防 己素联合塞来昔布逆转白血病细胞耐药的相关研 究， 为多药联合逆转肿瘤细胞耐药机制的探讨奠定 基础。 1 材料与方法 1. 1 细胞系与培养条件 K562 细胞由本科保存， 接种于 10% 灭活小牛 血清的 RPMI 1640 培养液， 置于 37， 5% CO2培养 箱中， 2 3 d 传代一次。台盼蓝染色细胞活性在 95%以上。 1. 2 材 料 汗防己甲素由南京大学血液科提供， 柔红霉素 （Daunorubicin DNR） 为意大利 Famitalia 公司产品， 塞来昔布购于安徽合肥森瑞有限公司， RPMI 1640 购于 Gibco 公司， 小
11、牛血清购于杭州四季青公司， 凋 亡试剂盒购于 BD 公司， MTT 试剂购于华美生物工 程公司， COX-2 和 COX-1 引物由上海生工公司提 供。 1. 3 方 法 1. 3. 1 实验分组 实验时取对数生长期 K562 细 胞， 细胞密度按不同实验要求进行调整。对照组： 为 K562 细胞悬液； DNR 组： 为 K562 细胞悬液中 加入一定剂量的 DNR； DNR + TTD 组： 为 K562 细 胞悬液中加入一定剂量的 DNR 和 TTD； DNR + CELE 组： 为 K562 细胞悬液中加入一定剂量的 DNR 和 CELE； DNR + TTD + CELE 组： 为 K
12、562 细胞悬 液中加入一定剂量的 DNR， TTD 和 CELE。 1. 3. 2 汗防己甲素和塞来昔布的浓度选择 用 MTT 法测定不同浓度的 TTD 和 CELE 的细胞毒试 验。经灭菌处理的 96 孔细胞培养板， 加入对数生长 期的 K562 细胞 100 l， 终浓度为 5 105/ ml， 对照 孔加入等量的生理盐水， 每组三孔， 每个实验孔加入 不同浓度的 TTD， CELE 5 l， 对照组加入等量的生 理盐水， 震荡混匀， 置 37， 5% CO2饱和湿度的细 胞培养箱中培养 48 h。加入 12. 07 mmol/ L 的 MTT 磷酸盐缓冲液 10 l/ L， 继续培养
13、4 h， 加入终止液。 在酶标仪上用 570 nm 读出吸光度。以细胞抑制率 = （1 - 试验组 A 值/ 对照组 A 值） 100% 来判断 结果， IC5050% 时体外敏感， C50 50% 时体外耐 药。 1. 3. 3 MTT 法检测汗防己甲素联合塞来昔布对 K562 细胞的细胞毒试验 按实验分组， 在加入不同 浓度的 DNR 48 h， 加入 12. 07 mmol/ L 的 MTT 磷酸 盐缓冲液10 l/ L， 继续培养4 h， 加入终止液。测定 各组对 K562 细胞的抑制。 1. 3. 4 细胞内药物浓度的测定 按实验分组， 在加 入 0. 625 mol/ L DNR
14、后， 用对照组作为空白对照， 分别在 12 h， 24 h， 48 h 收集 2 105细胞在 490 nm 用 FMC 上测定 1 105的相对荧光强度， 细胞的相 对荧光强度与 DNR 的浓度成正比， 细胞内的药物浓 度， 在 Cell-Quest 软件下采用直方图进行统计。 1. 3. 5 磷脂酰结合蛋白 （AnnexinV） 检测早期凋亡 根据实验分组， 在加入 0. 625 mol/ L DNR 24 h 后收集 1. 2 106细胞， 用 4 预冷的 PBS 洗涤两 次， 用 1 ml blotbuffer 重悬细胞， 各加入 Annexin V- FITC 10 l， PI 20
15、 l， 另外设空白对照， FITC 对照， PI 对照， 常温避光 15 min， 洗涤细胞后在 FMC 上检 测凋亡。在 Cell-Quest 软件下采用直方图进行统 计。 1. 3. 6 COX-2/ COX-1 基因的表达 根据实验分 组， 在加入 2. 5 mol/ L DNR 的 72 h 后收集 1 107 细胞进行 RT-PCR， 总 RNA 提取及逆转录 PCR 方应 按本室方法进行， COX-1 的上游引物序列为 5 - AAGTACCAGGTGCTG GATGG-3 ； 下游引物序列为 5 -GATGCTCCTCCTTCAGCAAG-3 。 变 性 94， 45 s； 退火
16、 56， 45 s； 延伸 72， 60 s。30 个循环， 扩增产物为 214 bp。COX-2 的上游引物序列为 5 - ATGGCTGCAGAGTTGAAAGC-3 ； 下游引物序列为 5 -CTCTTACAGCTCAGTTGAACGC-3 。变性 94， 45 s； 退火 56， 45 s； 延伸 72， 60 s。30 个循环， 扩增产物为 430 bp。 1. 4 统计学方法 运用 SPSS10. 0 统计软件进行分析和两组资料 进行 t 检验。 2 结 果 2. 1 汗防己甲素和塞来昔布的浓度选择 TTD 在 3. 5 mol/ L， CELE 在 15. 0 mol/ L 时对
17、 K562 细胞无明显毒性， 抑制差异不显著。故 选择 TTD， CELE 分别在 3. 5 mol/ L， 15. 0 mol/ L 作为实验浓度。 2. 2 汗防己甲素联合塞来昔布对 K562 细胞的抑 制效果 K562 细胞的抑制效果见表 1。 193第 5 期 顾红兵等： 汗防已甲素联合塞来昔布逆转白血病细胞耐药的体外研究 表 1 汗防己甲素联合塞来昔布对 K562 细胞的抑制效果 - x s， % 组别 柔红霉素 （DNR） 剂量 （g/ ml） 0. 31250. 6251. 252. 55 柔红霉素 （DNR） 组33. 55 3. 4849. 64 2. 6661. 42 3.
18、 1270. 36 2. 6181. 12 3. 39 DNR + 汗防己甲素 （TTD） 组36. 67 2. 9753. 33 2. 6165. 36 3. 0274. 96 2. 4684. 45 3. 72 DNR + 塞来昔布 （CELE） 组35. 42 2. 7852. 72 2. 5965. 56 2. 7473. 54 2. 6482. 36 3. 13 DNR + TTD + CELE 组42. 74 3. 02*58. 65 2. 87*71. 23 2. 58*79. 35 2. 89*91. 42 2. 65* 与其他组相比， *： P 0. 05 2. 3 K562
19、 细胞内药物浓度测定K562 细胞内药物浓度测定结果见表 2。 表 2 K562 细胞内药物浓度测定 （相对荧光率） 组别 时间 12 h24 h48 h 柔红霉素 （DNR） 组13. 53 2. 4318. 64 2. 5821. 44 2. 65 DNR + 汗防己甲素 （TTD） 组19. 63 2. 3623. 52 2. 6425. 37 2. 98 DNR + 塞来昔布 （CELE） 组17. 48 1. 9622. 57 1. 8623. 36 2. 22 DNR + TTD + CELE 组27. 45 3. 23*34. 33 3. 83*37. 42 3. 75* 与其他
20、组相比， *： P 0. 05 2. 4 Annexin V检测早期凋亡Annexin V早期凋亡情况见图 1。 图 1 Annexin V检测早期凋亡结果 2. 5 COX-2/ COX-1 基因的表达COX-2/ COX-1 基因的表达情况见图 2。 M 为 Marker，A 为对照组， B 为 DNR 组， C 为 DNR + TTD 组， D 为 DNR + CELE 组， E 为 DNR + TTD + CELE 组。 图 2 图 2 COX-2/ COX-1 基因的表达 293 江 苏 大 学 学 报 （医学版） 第 15 卷 3 讨 论 MDR 是目前认为白血病治疗中最大的障碍，
21、 某 些研究表明 5， MDR 的产生与对抗肿瘤药物诱导的 凋亡发生抵抗， 膜糖蛋白介导的耐药， 其中 P-gp 介 导的药物外排泵机制是 MDR 的一个最经典和关键 的因素。汗防己甲素是一种非特异性的钙通道拮抗 剂， 能与肿瘤细胞表面的 P-gp 结合而诱导其功能失 和6。我们的一些实验研究表明 7， 汗防己甲素能 够增加肿瘤细胞内药物浓度， 增加肿瘤细胞的凋亡。 COX-2 在多种肿瘤细胞中高表达 8， 而塞来昔布作 为 COX-2 的抑制剂可以增加化疗药物对肿瘤细胞 的长期作用， 诱导其凋亡。 本次实验发现， 汗防己甲素联合塞来昔布能够 增加 K562 细胞内的药物浓度， 增强了对 K5
22、62 细胞 的抑制， 促进了 K562 细胞的凋亡。联合运用逆转 剂效果明显优于药物组以及单用逆转剂组。诱导肿 瘤细胞的凋亡分三个阶段， 在细胞凋亡早期阶段， 位 于细胞膜内侧的磷脂酰丝氨酸 （PS） 迁移至细胞膜 外侧， 磷脂酰结合蛋白 V （Annexin V） 是一种钙依赖 性的磷脂结合蛋白， 他与 PS 具有高度的亲和力， 因 此检测 Annexin V 是一种检测比较好的方法。在两 种逆转剂的作用后， K562 细胞在 DNR 的存在下， Annexin V 明显增强， 凋亡细胞明显增多， 因此， 凋亡 率的增加， 促进了细胞耐药的逆转。COX-2/ COX-1 表达的降低， 可能是
23、塞来昔布作用了 COX-2 的上游 分子， 抑制诱导了 COX-2 的蛋白分子的上调 9。 目前联合使用逆转剂已经成为耐药逆转研究的 一个新的发展趋势， 使用两种或多种逆转剂， 在对肿 瘤细胞的作用机制不同， 而无累加的不良反应， 且剂 量小， 这是单一逆转剂无法比拟的优点。我们将在 此文的基础上， 将进一步阐述汗防己甲素联合塞来 昔布对 K562 细胞逆转实验中细胞周期， P-gp 含量 的测定， K562 细胞内钙离子浓度的测定， 相关基因 的表达， 以及动物实验。进一步探讨有关的耐药机 制。 参考文献 1 Schdert T，Kurbocher CM， Benzm， et al. Ind
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