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1、作者单位： !“#$ 首都医科大学北京宣武医院神经内科 通信作者： 贾建平， %7 = 组及各自对照组。缺氧 组在缺氧条件下 （?#60， # = 后复氧， 分别于 “、 !0、 0 = 利 用逆转录D聚合酶链反应（5FDG!2 、 12 1； ! I “2 “#、 “2 “$H、 “2 “!） ， 缺氧培养 0 = 后复氧各 时间点 797:!“ 7 = 后复氧!0 = 和0 = 表达上调 （分别较对照组上调$!2 #和 $#2 !； ! I“2 “0H、 “2 “#） 。结论8 缺氧及复氧可以降低 797:!“ 转录水平和增加 ;76=? $#331A“#$ %7!2 -M 12 1（!
2、I “2 “#， “2 “$H， “2 “!）L M(PPORO-L L(7 =4,RK Q4(-LK PLOR RO4+NSO-L(4- .(L= 0 =4,RK =NQ4+(2F7。这些研究提示血 管因素在 79 的发病过程中起协同促进作用，但其 0?中华神经科杂志 0“1 年 0 月第 $? 卷第 0 期8 “? 年 月至 “3 年 A 月采用人神经母细胞瘤 BC4BD3D 细胞缺氧模型， 研究缺氧及复氧对细胞活性和 0102!“、 :0; 和 2G 细胞培养及处理方法： BC4BD3D 细胞用按 !P !比例混合的 H! 和 2的孵养箱内进行培养。细胞 A T ? $ 换液 ! 次，
3、间隔 R $ 左右用 G 3Q胰酶进行消化传代。当 长至 U“Q的汇合度时将细胞置于充有 3Q F和 3Q;N的密闭容器内， 缺氧状态通过无氧检测试纸 验证 R。对照组 BC4BD3D 细胞在正常状态下培养。 AG 实验分组： 分为? 组， 包括缺氧! V 组、 缺氧 ? V 组以及其各自对照组。缺氧组分别设缺氧后 复氧 “、 !、 ? V A 个时间点。对照组与缺氧组在同 一时间点以相同的细胞数接种。每个时间点缺氧组 和对照组有 A T? 个独立的样本。 ?G 2KK 检测： 取对数生长期细胞以 ! W !“A个X 孔接种于 = 孔培养板中， 当细胞长至 U“Q 的汇合 度时缺氧组细胞置于充
4、有 3Q F和 3Q ;N密闭 容器内分别缺氧 ! V 和 ? V， 在复氧 “、 !、 ? V 时 分别取 ! 个孔加 2KK 至终浓度末“G 3 ,*X ,-， ARS 孵育 ? V 后弃去上清， 加入 !“ $- 二甲基亚砜溶解 结晶， 用 1L0IFNBKL;B OY ?“ 酶标仪 （巴斯德， 法 国） 在 33“ , 波长处测吸光度 （!） 值。对照组在相 同时间进行相同处理。 3G 引物序列： 根据 I) :#Z 提供的核酸序 列， 用 Y+%,)+A 软件设计引物。所用引物均由上海 博亚生物技术有限公司合成。引物序列为： 0102 上游： 34;0K000K0;IIK;K;04A
5、； 下游： 34 K0KKK III000;II000II04A， 扩增片段长度为 A? J/。:0;“S储存 备用。每个样本取 ! $- 61F0 在 I)0,/ Y;E S ?“ E 产物在 Q琼脂糖电泳上进行电泳， 用溴化 乙啶染色后在紫外灯下照相。利用 .$#+Z 1%*%(#- B6%)6) L1 图像处理和分析系统 !“（#$#+， 日 本） 对琼脂糖凝胶电泳图像进行吸光度分析。目的 基因相对表达量用目的条带与内参条带的吸光度值 之比来计算， 各组数据用均数 标准误 （!“ !） 来表 示。 RG 统计学处理： 利用 BYBB !G “ 统计软件对数 据进行处理， 各个时间点缺氧组
6、和对照组进行两个 独立样本的 # 检验。 结果 !G 细胞活性： 在倒置相差显微镜下观察， 缺氧 ! V 和 ? V 后复氧 “、 !、 ? V 的细胞发生肿胀， 胞 体轮廓模糊失去折光性， 突起减少， 胞体内可见颗粒 和空泡， 亦可见某些细胞变圆缩小和死亡的细胞从 板壁脱离， 悬浮于培养基中。采用 2KK 分析显示存 活细胞数各个时间点缺氧组均较对照组明显减少， 见表 !。缺氧 ! V 后复氧 “、 !、 ? V 后分别为相应 对照组的 U3G =Q、 U3G =Q、 U“G Q （均 $ _ “G “!） ； 缺 氧? V 后复氧“、 !、 ? V 后存活细胞数分别为相应 对照组的 =G
7、“Q、 =“G Q、 =UG “Q （均 $ _“G “!） 。 G 0102!“ ,EF0表达水平： 0102!“基因 A中华神经科杂志 “= 年 月第 A 卷第 期 ;V% a F)7+.-，H)J+7#+5 “=，b.- A，F.G 表 !“ 缺氧组和对照组各个时间点 !“#!$%$ 细胞 （$ :0） +. - (*. */4“ （$ :-） 缺氧 +, ) 对照 +. 04 (*. *,% （$ :0） ,. ,/ (*. +%/ （$ :0） ,. 02 (*. *4% （$ :0） 缺氧 ,- ) *. 43 (*. *%,“ （$ :-） *. 24 (*. *44“ （$ :
8、-） *. %3 (*. *-/; （$ :-） 缺氧 ,- ) 对照 +. ,3 (*. *-4 （$ :0） +. 0/ (*. *-0 （$ :0） +. *% (*. +,+ （$ :0） 1 1 注： 与各自对照组相比， “#*. *%，;#*. *+； 下表同 “： 缺氧组； 6“） 吸光度值之比来计算， 见表 ,。其结果显 示， 缺氧 +, ) 和 ,- ) 诱导了 565 方有 统计学意义， 可能是因为缺氧后复氧损伤 （包括氧 化应激损伤） 对 4“15) E BFAE FG HEBEIB%A C.HEECFAFMO PBFD ,:， ;3： +6,(+7!D )32， ;： )!*()!0)D )+?%CJ U -E&BFA，REIB&%BO 633+，_FA 70，-FD 6