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1、I C S 6 5 . 0 2 0 . 3 0 B 4 4 臀鹭 中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准 G B / T 1 4 9 2 6 G B / T 1 4 9 2 6 G B / T 1 4 9 2 6 G B / T 1 4 9 2 6 . 1 一1 4 9 2 6 . 6 -2 0 0 1 . 8 -1 4 9 2 6 - 1 7 - 2 0 0 1 . 4 1 - 2 0 0 1 . 4 4 一 1 4 9 2 6 . 4 9 -2 0 0 1 实验动物微生物学检测方法(2) L a b o r a t o r y a n i m a l -Mi c r o b i o l
2、 o g i c a l e x a m i n a t i o n m e t h o d s 2 0 0 1 一 0 8 一 2 9 发布 2 0 0 2 一 0 5 一 0 1 实施 中华人民共和国 国 家 质 量 监 督 检 验 检 疫 总 局 发 布 目录 1.刁0门白咋才1尸刁门斗0口口户卜州J峪009户6Q八j洲门乃7曰 11n几八八八乃八JA占八峪叹UL门:Jhh户匕门了月了口U只Q G B / T 1 4 9 2 6 . 1 -2 0 0 1 实验动物沙门菌检测方法 G B / T 1 4 9 2 6 . 2 -2 0 0 1 实验动物单核细胞增生性李斯特杆菌检测方法 G B
3、 / T 1 4 9 2 6 . 3 -2 0 0 1 实验动物 耶尔 森菌检 测方法 G B / T 1 4 9 2 6 . 4 -2 0 0 1 实验动物皮肤病原真菌检测方法 G B / T 1 4 9 2 6 . 5 -2 0 0 1 实验动物多杀巴斯德杆菌检测方法 G B / T 1 4 9 2 6 . 6 -2 0 0 1 实验动物支气管鲍特杆菌检测方法 G B / T 1 4 9 2 6 . 8 -2 0 0 1 实验动物支原体检测方法 。 GB / T 1 4 9 2 6 . 9 -2 0 0 1 实验动物鼠棒状杆菌检测方法 G B / T 1 4 9 2 6 . 1 0 -2
4、0 0 1 实验动物泰泽病原体检测方法 G B / T 1 4 9 2 6 . 1 1 -2 0 0 1 实验动物大肠埃希菌 。 1 1 5 a , c : K( B ) 检测方法 G B / T 1 4 9 2 6 . 1 2 -2 0 0 1 实验动物 嗜肺巴斯德杆菌检测方法 G B / T 1 4 9 2 6 . 1 3 -2 0 0 1 实验动物肺炎克雷伯杆菌检测方法 G B / T 1 4 9 2 6 . 1 4 -2 0 0 1 实 验动物 金黄色葡萄球菌检测方法 G B / T 1 4 9 2 6 . 1 5 -2 0 0 1 实 验动物 肺炎链球菌检测方法 G B / T 1
5、4 9 2 6 . 1 6 -2 0 0 1 实验动物乙型溶血性链球菌检测方法 G B / T 1 4 9 2 6 . 1 7 -2 0 0 1 实验动物绿脓杆菌检测方法 G B / T 1 4 9 2 6 . 4 1 -2 0 0 1 实验动物无菌动物生活环境及粪便标本的检测方法 G B / T 1 4 9 2 6 . 4 4 -2 0 0 1 实验动物念珠状链杆菌检测方法 G B / T 1 4 9 2 6 . 4 5 -2 0 0 1 实验动物布鲁杆菌检测方法 G B / T 1 4 9 2 6 . 4 6 -2 0 0 1 实验动物钩端螺旋体检测方法 G B / T 1 4 9 2 6
6、 . 4 7 -2 0 0 1 实验动物志贺菌检测方法 G B / T 1 4 9 2 6 . 4 8 -2 0 0 1 实验动物结核分枝杆菌检测方法 G B / T 1 4 9 2 6 . 4 9 -2 0 0 1 实验动物空肠弯曲杆菌检测方法 G B / T 1 4 9 2 6 . 8 -2 0 0 1 前言 本标准是对G B / T 1 4 9 2 6 . 8 -1 9 9 4 实 验动物 肺支原体检验方法 的修订。 本标准取消了用于支原体种鉴定的生长抑制试验， 将盲传次数减至 1 次， 增加 了E L I S A法作为初 步检测的选用方法。 本标准由中华人民共和国科学技术部提出并归口。
7、 本标准起草单位: 中国实验动物学会。 本标准主要起草人: 李红。 本标准于1 9 9 4 年 1 月首次发布。 中 华 人 民 共 和 国 国 家 标准 GB/ T 1 4 9 2 6 . 8 -2 0 0 1 实验动物支原体检测方法 代替GB / T 1 4 9 2 6. 8 一1 9 9 4 L a b o r a t o r y a n i ma l -Me t h o d f o r e x a mi n a t i o n o f My c o p l a s ma s p . 范 围 本标准规定 了 实验动物支原体的检测方法 本标准适用于小鼠、 大鼠的支原体检测。 2 引用标准
8、下列标准所包含的条文， 通过在本标准中引用而构成为本标准的条文。本标准出版时， 所示版本均 为有效。所有标准都会被修订， 使用本标准的各方应探讨使用下列标准最新版本的可能性。 G B / T 1 4 9 2 6 . 4 2 - - 2 0 0 1 实验动物细菌学检测标本采集 G B / T 1 4 9 2 6 . 4 3 - - 2 0 0 1 实验动物细菌学检测染色法、 培养基和试剂 G B / T 1 4 9 2 6 . 5 0 -2 0 0 1 实验动物酶联免疫吸附试验 3原理 对实验动物具有致病能力的支原体主要寄居其上呼吸道， 支原体在半流体培养基和固体培养基上 可形成特殊菌落， 菌落
9、可被D i e n e s 染色液染成蓝色而不褪色， 据此可进行病原学鉴定。 动物感染支原体 后血清中可产生相应抗体， 使用 E I A S A法可进行抗体检测， 但由于动物 自然感染后血清抗体水平较低， 亦有可能因与其他病原微生物存在共同抗原而导致的交叉反应， 故血清学方法仅作为初步检测的选用 方法 。 4 主要设备和材料 4 . 1 普通恒温培养箱。 4 . 2 实体显微镜。 4 . 3 蜗旋混匀器。 4 . 4 毛细吸管， 每份样品 I 支 4 . 5 恒温水浴箱。 4 . 6 高速离心机。 4 . 7 超声波细胞粉碎器。 4 . 8 酶标仪。 4 . 9 聚苯乙烯板， 4 0孔、 5
10、5 孔或 9 6 孔( 可拆或不可拆) ， 用前洗净晾干， 紫外光照射 1 h , 4 . 1 0 微量加样器， 容量 5 - 5 0 K L和 5 0 2 0 0 p L 5 培养基和试剂 5 . 1 支原体半流体培养基。 中华人民共和国国家质且监督检验检疫总局2 0 0 1 一 0 8 - 2 9 批准 2 0 0 2一 0 5 一 0 1实施 GB / T 1 4 9 2 6 . 8 -2 0 0 1 52 支原体液体培养基。 5 . 3 支原体固体培养基。 5 . 4 D i e n e s 染色液。 5 . 5 E LI S A 抗原 5 . 5 . 1 支原体培养: 肺支原体、 关
11、节支原体和溶神经支原体标准株接种支原体液体培养基， 3 6 C 摇动培 养 2 -3 d , 5 . 5 . 2 已明显混浊的培养液按 8 0 0 0 r / m i n离心 3 0 mi n ， 沉淀用 P B S在相同条件下洗 3 次。 5 . 5 . 3 上述沉淀用 P B S悬浮， 超声波打碎后. 上清即为E L I S A抗原。 5 . 6 酶结合物 辣根过氧化物酶标记羊或兔抗小鼠、 大鼠I g G抗体， 用于检M相应动物血清抗体; 辣根过氧化物酶 标记葡萄球菌蛋白A( S P A) ， 用于检测小鼠血清抗体。 5 . 了阳性血清 支原体抗原免疫清洁级或 S P F级小鼠或大鼠所获得
12、的抗血清。 5 . 8 阴性血清 无支原体感染的清洁级或 S P F级小鼠和大鼠血清。 5 - 9 其他试剂溶液的配制见G B / T 1 4 9 2 6 . 4 9 - - - 2 0 0 1 e 6检测方法 6 . 1 分离培养法 61 . 1检测程序 Gs/ T 1 4 9 2 6 . 8 -2 0 0 1 6 . 1 . 2 操作步骤 6 门. 2 . 1 采样 取包括咽部及以下气管约 5 - 1 0 mm左右放人装有 。 . 6 -0 . 7 mL酵母浸液的试管中， 用蜗旋混匀 器制成洗脱液。 6 . 12 . 2 分离培养 按G1 3 / T 1 4 9 2 6 . 4 2 -2
13、0 0 1 4 . 1 8 进行接种后放( 3 6 士1 ) 培养箱培养。 6 . 1 . 2 . 3 鉴定 a )支原体在半流体培养基中经 3 - 7 d培养， 在培养基的上部可形成小的慧星状、 云雾状或沙粒状 菌落。 b )吸取含可疑菌落的半流体培养物约 。 . 5 mL转种支原体液体培养基， ( 3 6 士1 ) C 培养5 -7 d , 吸 取该培养物约 。 . 1 m L接种于支原体固体培养基， 用I 一 棒涂抹均匀， 待表面干后将培养基放人保鲜袋， 2 8 G B / T 1 4 9 2 6 . 8 -2 0 0 1 密闭， ( 3 6 士1 ) c 培养。 c )支原体在固体培养
14、基培养3 -7 d 后可形成“ 煎蛋状， 或“ 杨墓状” 菌落。 d ) 染色: 将有可疑菌落的固体培养基平皿进行 D ie n e s 染色， 3 0 mi n或更长时间后支原体菌落依然 为蓝色， 而细菌 L型菌落则变为无色。 e )如初代半流体培养 7 d无可疑菌落出现， 应吸取约 1 / 1 0的初代培养基接种于相同培养基进行盲 传， 经( 3 6 士1 ) C培养 7d ， 如仍无可疑菌落出现则判定为阴性; 对出现可疑菌落者则按照“ b ) , c ) , d ) ” 步 骤进行鉴定 6 . 2 酶联免疫吸附试验( E L I S A) 6 . 21 包被抗 原 根据滴定的最适工作浓度
15、， 将抗原用包被液稀释。 每孔1 0 0 I. L , 置3 7 C 1 h 后再4 过夜。 6 . 2 . 2 用洗涤液洗 5 次， 每次 3 m i n , 叩千。 6 . 2 . 3 加样 待检血清和阴性、 阳 性血清分别用稀释液做I ， 4 0 稀释， 每孔1 0 0 爪, 3 7 C 1 h ， 洗涤同上。 6 . 2 . 4 加酶结合物 用稀释液将酶结合物稀释至适当浓度， 每孔加人 1 0 0 1, L , 3 7 0C 1 h ， 洗涤同上。 6 . 2 - 5 加底物溶液 每孔加人新配制的底物溶液 1 0 0 k L， 置 3 7 C, 避光显色 1 0. 1 5 m i n
16、, 6 - 2 - 6 终止反应 每孔加人终止液5 0 rL L , 6 . 2 - 7 测 A值 在酶标仪上， 于 4 9 0 n m处读出各孔 A值 6 . 2 . 8 结果判定 在阴性和阳性血清对照成立的条件下， 进行结果判定。 6 . 2 . 8 . 1 同时符合下列 2 个条件者， 判为阳性。 a ) 待检血清的A值乒0 . 2 ; b ) 待检血清的A值/ 阴 性对照血清的A值异2 . 1 0 6 . 2 - 8 . 2 均不符合上述 2 个条件者， 判为阴性。 6 . 2 - 8 . 3 仅有 1 条符合者， 判为可疑， 需重试。 6 . 2 - 8 - 4 对阳性结果需重试，
17、如为阳性则判为阳性。 7结果报告 E L I S A法结果阳性者应抽取相同动物群动物进行支原体分离培养， 符合上述培养、 染色特征者作 出阳性报告， 不符合者作出阴性报告。 *草庐一苇草庐一苇*提供优质文档， 如果 你下载的文档有缺页、 模糊等现象或 者遇到找不到的稀缺文件， 请发站内 信和我联系！我一定帮你解决！ 提供优质文档， 如果 你下载的文档有缺页、 模糊等现象或 者遇到找不到的稀缺文件， 请发站内 信和我联系！我一定帮你解决！ 本人有各种国内外标准 20 余万个， 包括全系 列 GB 国标国标及国内行业行业及部门标准部门标准，全系列 BSI EN DIN JIS NF AS NZS GOST ASTM ISO ASME SSPC ANSI IEC IEEE ANSI UL AASHTO ABS ACI AREMA AWS ML NACE GM FAA TBR RCC 各国船级 社 船级 社 等大量其他国际标准。豆丁下载网址：豆丁下载网址： http:/