he-ne激光对9号淡水小球藻生物量及总脂含量积累的影响毕业论文.doc

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1、SHANDONG 毕 业 论 文 He-Ne 激光对 9 号淡水小球藻生物量及 总脂含量积累的影响 学 院： 专 业： 学生姓名： 学 号： 指导教师： 201 年 月 中文摘要 I 摘 要 本文通过研究不同光照时间 (0min、1min、2min、4min、8min、12min、16min)的 He-Ne 激光照射对 9 号淡 水小球藻（Chlorella pyrenoidosa）产生诱变，探究其对 9 号小球藻生物量以及 藻细胞总脂含量的影响。在此阶段中定期取样测量其吸光度值以换算细胞密度， 最后对藻细胞进行总脂含量的测定。实验结果表明，1min、12min 和 16min 光 照时间长度

2、的 He-Ne 激光对 9 号小球藻的生物量积累有极其显著的促进作用。 1min、2min、4min 和 8min 光照时间长度的 He-Ne 激光对 9 号小球藻总脂含量 的积累有显著促进作用。综合考虑，可对 1min 的诱导组筛选高产油藻株，为后 期的遗传变异稳定性检测打下基础，以期为生物柴油规模化生产的研究提供优 质藻种。 关键词：9 号淡水小球藻，生物量，生物柴油，He-Ne 激光，总脂量。 Abstract II Abstract This thesis have studied the biologic effects including biomass and lipid con

3、tent of the Chlorella pyrenoidosa which is irradiated with He-Ne laser of different gradient(0min/1min/2min/4min/8min/12min/16min). In this stage,the number of Chlorella cells in nutrient solution was count with the plate method using blood cell counts.A standard curve about the relevance between th

4、e biomas and the OD value of Chlorella cells would be drawn.And the nutrient solution would be sampled periodic to measure the OD value in order to work out the biomas. At last the lipid content of the Chlorella would be measured. The results show that the growth of the Chlorella obviously was risin

5、g along with the time of laser irradiation of 1min/12min/16min and the lipid content of Chlorella was rising along with the time of laser irradiation of 1min/2min/4min/8min.In conclusion the time of laser irradiation of 1min could be chosen as the high-level lipid microalgae for the research of stab

6、ility about the genetic mutation and Large-scale production of biodiesel. Keywords：Chlorella pyrenoidosa，biomas，biodiesel，He-Ne laser，lipid content 目录 III 目录 摘 要 I ABSTRACTII 第一章 引言.- 1 - 1.1 课题的背景和意义.- 1 - 1.2 9 号小球藻.- 2 - 1.3 He-Ne 激光器- 3 - 1.3.1 He-Ne 激光器的相关参数 .- 3 - 1.3.2 He-Ne 激光器的结构 .- 3 - 1.3

7、.3 He-Ne 激光器的工作原理 .- 4 - 第二章 材料与方法.- 8 - 2.1 9 号小球藻的培养.- 8 - 2.1.1 藻种- 8 - 2.1.2 藻种培养- 8 - 2.2 实验材料 .- 8 - 2.2.1 药品与试剂- 8 - 2.2.2 仪器- 9 - 2.3 实验方法 .- 9 - 2.3.1 9 号小球藻的诱导- 9 - 2.3.2 实验培养条件- 9 - 2.3.3 9 号小球藻细胞生长标准曲线的测定- 10 - 2.3.4 9 号小球藻生物量的测定- 10 - 2.3.5 9 号小球藻藻细胞的收集- 10 - 2.3.6 9 号小球藻总脂含量的测定- 10 - 第

8、三章 结果与讨论.- 12 - 3.1 9 号小球藻的生长曲线.- 12 - 3.1.1 9 号小球藻细胞形态的观察- 12 - 3.1.2 9 号小球藻藻细胞生长的测定- 12 - 3.2 9 号小球藻的总脂含量.- 17 - 3.2.1 9 号小球藻总脂含量的测定- 17 - 3.2.2 对利用 9 号小球藻进行工业化生产分析结果。- 17 - 第四章 结论.- 18 - 参考文献.- 19 - 致 谢.- 21 - 附 录.- 22 - 引言 - 1 - 第一章 引言 1.1 课题的背景和意义 随着世界经济的发展和人口的急剧膨胀，全球范围内的化石能源储备在迅 速减少。全球的石油需求量以每

9、年 1%的速度增长，预计在 2050 年即本世纪中 叶石油资源将会消耗殆尽。全球的天然气需求量则以每年 1.8%的速度递增，占 总能源需求量的 22%。煤炭的需求增长量则是最高的，以每年 2%的速度增长。 然而，地球上贮存的化石能源是有限的，总会有消耗殆尽的时候，在这种情况 下，新型能源的推广显得尤为重要。 生物能源作为一种新型的清洁能源，其本身的开发利用得到了更为广泛的 关注。生物能源是指从生物质得到的能源。生物质的种类有很多，大体分为植 物类和非植物类。藻类作为数量群庞大的生物质，成为了生物能源载体的研究 热点。可高效转化能量的植物最多只能将接收到的太阳辐射能的 10%12%转化 为化学能

10、，而微藻的光能转化效应为 20%左右。美国国家可更新实验室(NREL) 通过现代生物技术建成“工程微藻”，即硅藻类的一种“工程小环藻”。在实 验室条件下可使“工程微藻”中脂质含量增加到 60以上，户外生产也可增加 到 40以上。而一般自然状态下微藻的脂质含量为 5-20。“工程微藻”中 脂质含量的提高主要由于乙酰辅酶 A 羧化酶(ACC)基因在微藻细胞中的高效表 达，在控制脂质积累水平方面起到了重要作用。目前，正在研究选择合适的分 子载体，使 ACC 基因在细菌、酵母和植物中充分表达，还进一步将修饰的 ACC 基因引入微藻中以获得更高效表达。利用“工程微藻”生产柴油具有重要 经济意义和生态意义

11、，其优越性在于：微藻生产能力高、用海水作为天然培养 基可节约农业资源；比陆生植物单产油脂高出几十倍：生产的生物柴油不含硫， 燃烧时不排放有毒害气体，排入环境中也可被微生物降解，不污染环境，发展 富含油质的微藻或者“工程微藻”是生产生物柴油的一大趋势。 小球藻(Chlorella)是一种绿藻，一般分布在土壤和淡水水域中，有的还以共 生体的形式出现在无脊椎动物体内，大多数种的细胞中还有一个蛋白核1。小 球藻的遗传差异很大，所以小球藻细胞干重中脂类的含量由 4.5%86%不等。 小球藻细胞中的总脂类经皂化后可分为三个组分：脂肪酸，难皂化物质和水溶 性的皂化产物。小球藻细胞中脂类含量的增加主要是由于脂

12、肪酸积累的结果。 9 号小球藻（Chlorella pyrenoidosa）作为一种淡水小球藻，其不饱和脂肪酸的 引言 - 2 - 含量明显高于许多植物2。 本实验拟通过测定 He-Ne 激光对 9 号小球藻总脂含量的影响来筛选出脂类 积累的高产藻株，通过测定 He-Ne 激光对 9 号小球藻生物量的影响来筛选可迅 速积累生物量的藻株。 1.2 9 号小球藻 9 号小球藻属于绿藻门（Chlorella）绿球藻目（Chlorococcales）卵囊藻科 （Oocystaceae）。是一种单细胞蛋白核小球藻，细胞多呈球形，细胞壁薄，色 素体呈杯状，几乎充满整个细胞。9 号小球藻具有一个很明显的蛋白

13、核，直径 为 3 至 5m2。 小球藻的分布式极为广泛的，在海洋、湖泊、池塘、沟渠、树皮和湿润土 壤等环境中都可以生长繁殖。9 号小球藻是一种生长在淡水中的小球藻类，对 环境的适应能力之强十分罕见，是微藻大规模培养的主要污染源之一。 1890 年小球藻首次由荷兰微生物学家 Beijerinck 在琼脂平板上成功分离， 1919 年这种纯培养物被用于实验室研究植物生理学3、4。在 20 世纪 40 年代后 期，美国、德国、以色列和日本开始了对小球藻规模化培养的研究。已解决第 二次世界大战期间的能源问题和战后饥饿问题5。20 世纪 60 年代，美国及俄罗 斯科学家进行了“太空藻类学”研究，以小球藻

14、作为宇宙飞船飞行时的光和气 体交换器6、7。1971 年 Takechi 等人以醋酸盐为碳源在池塘中装配环流搅拌器， 建立了混养培养方法8。近期对于小球藻的研究则多集中在小球藻的产油研究 和营养研究上。 小球藻依据种类的不同，其蛋白质含量为 7.3%88%不等，碳水化合物为 5.7%38%，脂类为 4.5%86%。小球藻藻细胞中蛋白质的含量与其生长环境有 直接关系，如果蛋白核小球藻生长在良好的环境中，其细胞中的蛋白质含量一 般高于 50%2。Fisher 和 Burlew 分析了蛋白核小球藻的蛋白质样品的氨基酸组 成，计算出这种蛋白质的必需氨基酸指数为 629。实验表明蛋白核小球藻的氨 基酸指

15、数与面粉、花生等植物处于同一水平。小球藻细胞中的脂类存在形式主 要是脂肪酸，其不饱和脂肪酸的含量明显高于其他植物。在氮饥饿的生长条件 下，蛋白核小球藻在生长过程中可积累最多高大 86%的脂类。 引言 - 3 - 1.3 He-Ne 激光器 1.3.1 He-Ne 激光器的相关参数 He-Ne 激光器其本质为气体激光器，于 1960 年末研制成功，是全球第二种 研制的激光器，由于 He-Ne 激光器结构简单、使用方便、光束质量好。成本较 低且工作可靠，它也是迄今为止应用最广泛的激光器之一。 He-Ne 激光器在可见光和红外光波段有多条发射谱段，本实验采用最强也 是应用最为广泛的波长为 623.8

16、nm 的红光。除此之外还有 543.5nm 的绿光、 594nm 的黄光、612nm 的橙色光、1.15m 的近红外辐射和 3.39m 的谱线。 红光 He-Ne 激光器以连续方式工作，具有稳定的低噪声输出，功率可达 100mV。发射线宽主要由 Doppler 加宽决定，半最大点全宽度(FWHM)的典型值 为 1.5GHz，其他典型参数如下： 表 1 典型 He-Ne 参数 参数数值 激光波长/nm632.8 自发辐射系数/s-1 3.4106 激光上能级寿命/s 1.710-7 受激发射截面/m2 310-17 自发发射线宽 FWHM/Hz 1.5109 小信号反转粒子数密度/m3 6101

17、5 1.3.2 He-Ne 激光器的结构 He-Ne 激光器的结构见图 2，其结构形式很多，但都是由激光管和激光电 源组成。激光管由放电管、电极和光学谐振腔组成。 放电管通常由毛细管和储气管构成，是产生激光的地方。放电管中充入一 定比例的氦（He）、氖（Ne）气体，当电极加上高压电后，毛细管中的气体开 始放电，是氖原子受激发产生粒子数反转。储气管与毛细管相连，并不发生气 体放电，其作用是补偿因慢漏气及管内元件放气或吸附气体造成 He、Ne 气体 引言 - 4 - 比例及总气压发生的变化，延长器件的寿命。He-Ne 激光器的阳极一般用钨棒 制成，阴极多用电子发射率高和溅射率小的铝及其合金制作而成

18、。为了增加电 子发射面积和减小阴极溅射，一般都把阴极做成圆筒状，然后用钨棒引到管外。 图 1 He-Ne 激光器的结构 He-Ne 激光器由于增益低，谐振腔一般采用平凹式，平面镜为输出镜，透 过率约为 1%到 2%，凹面镜为全反射镜。 He-Ne 激光器的结构按谐振腔与放电管的放置方式不同可分为内腔式、外 腔式和半内腔式。按阴极及储气管位置的不同又可分为同轴式、旁轴式和单细 管式。 1.3.3 He-Ne 激光器的工作原理 氦氖激光器中工作物质是氦气和氖气，其中氦气为辅助气体，氖气为工作 气体。产生激光的是氖原子，利用不同能级的受激辐射跃迁将产生不同波长的 激光，主要有632.8nm、1.15

19、m 和3.39m 三个波长。 He-Ne 激光器的能级结构图如图3所示，氦原子有两个亚稳态能级 21S0、23S1，它们的寿命分别为510-6s 和10-4s，能量分别为20.73eV 和 19.73eV。两个都是亚稳能级。He 的这两个能级几乎与 Ne 的2s 和3s 两个能级 引言 - 5 - 分别重合。He 的21S0能级比 Ne 的3S3仅低0.048eV，He 的23S1能级仅比 Ne 的2S 能级仅高0.039eV。在 He-Ne 混合气体中进行放电时，在电场中加速获得一定动 能的电子与氦原子碰撞，并将氦原子由基态激发到各种激发态中，在它们衰变 到基态的过程中，大部分被长寿命的23

20、S1和21S0能级吸收。通过近共振能量转移， 此两能级寿命长容易积累粒子。因而，在放电管中这两个能级上的氦原子数是 比较多的。这些氦原子的能量又分别与处于2S 和3S 态的氖原子的能量相近。 处于21S0、23S1能级的氦原子与基态氖原子碰撞后，很容易将能量传递给氖原子， 使它们从基态跃迁到2和3态，这一过程称能量共振转移。由于氖原子的2P、3P 态能级寿命较短，这样氖原子在能级3S3P、3S2P、2S2P 间形成粒子数反 转分布，从而发射出3.39m、632.8nm、1.5m 三种波长的激光。 图 2 He-Ne 原子的部分能级图 632.8nm 振荡是由3S2到2P4跃迁形成的。上能级3

21、S2寿命为10-7s。下能级2P4 寿命为1.810-8s，比3S2寿命短得多，因而满足反转分布条件。由于2P4到基态 的跃迁是禁戒的，因此，主要通过自发发射衰减到1s 上。1s 态是一个亚稳态。 1s 上的氖原子与电子碰撞后又会跃迁到激光下能级2P4上，同时还存在自发发射 引言 - 6 - 辐射的共振俘获，这两个过程都不利于2P4能级的排空。1s 上的氖原子主要通过 与放电管内壁的碰撞而回到基态，这就是所谓的“管壁效应” 。为了增加氖原子 与管壁碰撞几率以加强“管壁效应” ，尽快使激光下能级抽空以提高反转数，所 以，He-Ne 激光器的放电管都是用毛细管。 1.15m 振荡是由2S2到2P4

22、跃迁形成的。对激光上能级2S2的泵浦是通过与氖 的23S2的近共振能量转移来实现的。2S2的寿命为10-7s。它的下能级与632.8nm 跃迁过程所使用的相同，所以，也有赖于管壁效应抽空1s 能级，从而抽空2P4能 级上的氖原子。 3.39m 振荡是由3S2到3P4形成的。其上能级与632.8nm 振荡时的相同；下 能级3P4的寿命为10-8s，下能级与基态间的跃迁是禁戒的，通过自发辐射衰变到 1s 能级上，因而也是靠管壁效应抽空激光下能级。 上述过程可表示为： e*+He(11S0)e*+He*(21S0) e*+He(11S0)e*+He*(23S0) He*(21S0)+Ne(2P6)H

23、e(21S0)+Ne*(3S) He*(23S1+Ne(2P6)He(21S0)+Ne*(2S) Ne*(3S)Ne*(2P)产生波长为632.8nm 的激光 Ne*(3S)Ne*(3P)产生波长为3.39m 的激光 Ne*(2S)Ne*(2P)产生波长为1.15m 的激光 从理论上讲，这三种波长的激光都有可能发射，但我们可以采取一些方法 去抑制其中的两种，而使我们所需要的一种波长的激光得到输出。632.8nm（红 光）因输出为可见波段的激光，实际应用较广泛10。 1.3.4 He-Ne 激光在生物学方面的应用 He-Ne 激光在生物学领域主要作为诱变育种的一种激光诱变方式。 赵萌萌等人利用

24、He-Ne 激光诱变钝顶螺旋藻 IS，发现经 He-Ne 激光 15min 和 20min 照射后的藻种藻丝形态发生变化，藻丝变短、螺旋变紧密，生长速度 明显加快， 胡萝卜素、蛋白质和多糖含量均有较大幅度的增加11。郭爱莲等 人利用 He-Ne 激光对白腐真菌的菌丝体和原生质体进行照射诱变，发现部分经 过照射右边的菌株木质素降解率可达 3811%和 39188%，比出发菌株的 33%和 39%高出许多12。张建民等人通过 He-Ne 激光照射诱变小球藻发现在 2min 随 着照射时间的延长，藻细胞的生长繁殖能力明显加强，细胞内叶绿素、蛋白质 引言 - 7 - 含量均呈上升趋势13。黄建新等人通

25、过采用 He-Ne 激光对地衣芽孢杆菌进行激 光诱导，分别以 10min、20min、30min、40min 进行照射处理,结果表明,10min 照射对 H25 菌的芽孢萌发有激活作用,促进其生长速度；0min 和 30min 照射对 H25 菌株的产酶力有明显的影响，筛选出三株比出发菌株产酶力提高 2 倍以上, 且对啤酒发酵中双乙酰降解作用明显的变异菌株，其中 L 2206菌株经传代培 养及酯酶同工酶分析,证明发生了稳定的遗传变异14。戴德慧等人采用 He-Ne 激 光诱变红曲霉 M9x 原生质体，获得一株 Monacolin K 产量为 103.73g/ml 的诱 变株 M9y，其产量约是

26、出发菌株 M9x 的 4.1 倍，经酯酶同工酶分析，其酶带条 纹数、迁移率等均发生了明显变化15。张智维等人。用 He-Ne 激光作为诱变光 源,照射啤酒酵母细胞,在合适的时间和剂量下,得到一株优良菌株。用该菌株酿 造的啤酒,其双乙酰值为 0.1253mg/L,比原菌株下降了 30%16。朱宏莉等人利用 He-Ne 激光诱变果胶酶产生菌的菌体细胞,获得了突变株 ZH2g,其酶活为出发菌 株的 1.3 倍，用 He-Ne 激光照射 ZH2g 的原生质体,从而得到了高产突变株 ZH2gA,其酶活为出发菌株的 1.6 倍17。张建军等人通过 He-Ne 激光复合诱变选 育柠檬酸高产菌，筛选出的高产突

27、变菌株柠檬酸产酸率提高了 19.29%，转化率 由 87.07%到 103.86%18。姜岩等人通过利用 He-Ne 激光诱变热带假丝酵母 CT43，发现其降解苯酚的效率显著提高19。 目前，利用 He-Ne 激光主要用在微生物诱变育种方面，在微藻方面应用还 很少。本文初步研究了不同照射时长的 He-Ne 激光对 9 号小球藻生物量和总脂 含量积累的影响。结果表明 1min、12min 和 16min 照射时间长度的 He-Ne 激光 对 9 号小球藻生物量的积累有显著的促进作用，2min、4min、8min 照射时间长 度的 He-Ne 激光对 9 号小球藻生物量的积累有抑制作用。1min

28、照射时间长度的 He-Ne 激光对 9 号小球藻总脂含量的积累有明显的促进作用。 引言 - 8 - 材料与方法 - 8 - 第二章 材料与方法 2.1 9 号小球藻的培养 2.1.1 藻种 9号小球藻原藻种购自中国科学院水生生物研究所 2.1.2 藻种培养 在5L的三角瓶中加入3L的液体培养基，接种一定体积的原藻液。由日光灯 提供光照，其光照与黑暗比为12h:12h，光照强度为1200Lx，其培养温度为23 恒温培养，每天手动摇瓶3至5次，营养液加盐频率为2周加一次1/4浓度的营养 盐，待培养至生长对数期备用。 本实验采用BG11培养基（pH=7.1） ，其各营养成分浓度如下： （一）大量元素

29、： NaNO3 75g/L K2HPO4 2g/L MgSO47H2O 3.75g/L Na2CO3 1g/L 柠檬酸 0.3g/L CaCl22H2O 1.8g/L 柠檬酸铁铵 0.3g/L EDTANa2 50mg/L （二）微量金属元素： H3BO3 2.86g/L MnCl24H2O 1.86g/L ZnSO47H2O 0.22g/L CuSO45H2O 80mg/L Na2MoO42H2O 0.39g/L Co(NO3)26H2O 50mg/L 2.2 实验材料 2.2.1 药品与试剂 蒸馏水、95%乙醇、丙酮、氯仿、甲醇、氮气等 材料与方法 - 9 - 2.2.2 仪器 三角瓶（2

30、50mL、5L） 、饲养瓶（25mL） 、比色皿、量筒、胶头滴管、血球 计数板、盖玻片、细线、封口膜、pH 试纸、玻璃棒、药匙、移液枪、离心管 （10mL、50mL） 、称量纸、烧杯、试管、研钵、擦镜纸等 氦-氖激光器（北京大学物理系工厂 JD-2 型） 电子天平（HANGPING FA1004） 可见分光光度计（上海光谱仪器有限公司 723 型） 超声波破碎仪（美国 SONICS VC605） 台式低温离心机（HERAEUS） 高压蒸汽灭菌锅 超净工作台（DLCJIN） 普通光学显微镜（SEC282） 氮吹仪（上海泉岛科贸有限公司 QSC12T） 电热恒温鼓风干燥箱（DGF30/14IIA）

31、 旋涡混合器（MVS1） 2.3 实验方法 2.3.1 9 号小球藻的诱导 本实验设置了空白、1min、2min、4min、8min、12min、16min七个激光照 射时间梯度，每种时间长度设置三个重复。在超净工作台上将以培养至生长对 数期的藻液分装至21个25mL的饲养瓶中，每瓶20mL依次标好各照射时间长度 值。分别将已装有藻液的饲养瓶至于磁力搅拌器上，在转子的搅拌下至于JD-2 型氦-氖激光器的照射下，照射参数为：波长632.8nm，功率40mw。在照射完毕 后同时于超净工作台上接种于300mL的三角瓶中，每瓶200ml的培养液。 2.3.2 实验培养条件 淡水小球藻生长的培养温度为

32、23，光照与黑暗比为 12h:12h，白天光强 约为 1200Lx。培养阶段每天定时摇藻（一日 3 次） ，每周加盐一次，一次加入 1/4 倍数浓度的 BG11 营养盐。. 材料与方法 - 10 - 2.3.3 9 号小球藻细胞生长标准曲线的测定 9 号小球藻细胞密度的测定采用血球计数板法，取实验用藻原藻种培养液 10ml，从中取 1ml，加到血球板上，在显微镜下进行计数，然后，从中取 4ml 测吸光度；将剩余的 5ml 稀释 2 倍，从中取 1ml 进行血球计数板，取 4ml 测吸 光度；同样将剩余的 5ml 稀释 2 倍，从中取 1ml 进行血球计数板，取 4ml 测吸 光度；以此类推，稀

33、释十次，测出数值，然后作出吸光度与细胞密度的关系曲 线。 2.3.4 9 号小球藻生物量的测定 从实验组小球藻激光诱导时间开始，每三天测定一次各诱导时长梯度实验 组藻细胞的吸光度值。具体测定方法为：从每个梯度的三瓶重复中各取出 1.5mL 的藻液共 4.5mL，于 540nm 的波长下测定其吸光度值。根据已作出的小 球藻吸光度与细胞密度的关系曲线方程换算出小球藻的细胞密度，并记录数据。 2.3.5 9 号小球藻藻细胞的收集 将小球藻藻液转移至 50ml 的离心管中，配平后，在低温高速离心机中，于 8000rpm 下离心 10min，弃去上清，应尽量弃除上清；将收集好的藻泥于-20 的冰箱中保存

34、，以备总脂含量的测定。 2.3.6 9 号小球藻总脂含量的测定 （1）处理藻细胞样品 从冰箱中取出用于待测总脂含量的样品，于电热恒温鼓风干燥箱中 100 干燥过夜至恒重，分别测量各实验组干燥粉质量 m0，并记录数据。研磨已称量 的干燥粉，并加入等体积的氯仿和甲醇（1:2，现配现用） ，注意：药品有毒， 操作时戴上乳胶手套和口罩，实验在通风橱中进行。 （2）超声波破壁 在功率 240W，周期 1min，破壁 15s，间隔 5s，3 个循环的条件下进行破壁。 破壁过程中需要冰浴保护，防止超声波破壁仪工作中产生的高温对藻细胞的灼 伤。 （3）离心 将破壁完的藻液分装于两个 50mL 离心管中，配平后

35、，于低温高速离心机 材料与方法 - 11 - 中，10000rmp 条件下离心 10min。 （4）萃取 离心完后，取上清液，按 3:1（氯仿：上清液）的比例加入氯仿并涡旋混匀。 之后再加入与氯仿等体积的水涡旋混匀，静置待其分层。取下层有机相转入预 先称重(m1)的 10ml 离心管中，用氮吹仪吹干有机溶剂，氮吹仪水浴温度设定为 61。 （5）干燥及称量 氮吹完成后，将离心管至于 100的鼓风干燥箱中干燥 30min，待干燥完成 后取出立即称量并记录质量 m2。 （6）计算 总脂含量的计算公式为：总脂含量百分比=（m2-m1)/m0100% 材料与方法 - 12 - 结果与讨论 - 12 -

36、第三章 结果与讨论 3.1 9 号小球藻的生长曲线 3.1.1 9 号小球藻细胞形态的观察 实验前所用 3L 三角瓶装的 9 号小球藻生物量积累较多，培养液成墨绿色， 瓶底部有极少量沉淀粘结藻体，表明此时 9 号小球藻的生长已达到对数生长期。 经过分装接种后小球藻培养液呈翠绿色，三角瓶底部无藻细胞聚集物。在激光 照射后 6 天小球藻培养液颜色加深。第 24 天时可以看出 1min、12min 的 16min 的诱导组藻细胞培养液颜色明显深于其他诱导组以及对照组，此时各组培养瓶 瓶底已有少量藻细胞聚集物沉降。随着培养时间的增长，各组之间藻细胞培养 液的颜色差异更加明显，其中 1min、12min

37、 和 16min 明显大于对照组，其他三 个诱导组则比对照组要小。 3.1.2 9 号小球藻藻细胞生长的测定 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 03 69 12 15 18 21 24 27 30 33 36 39 42 45 48 51 54 57 60 测量天数（天） OD值（A） 0min 1min 2min 4min 8min 12min 16min 图 3 9 号小球藻的生长趋势 结果与讨论 - 13 - y = 52.337x + 0.2661 R2 = 0.9984 0 2 4 6 8 10 12 14 00.050.10.150.20.25 OD值（A） 细胞密度 图 4

38、 9 号小球藻的细胞密度和 OD 值标准曲线 0 20 40 60 80 100 120 140 0369 12 15 18 21 24 27 30 33 36 39 42 45 48 51 54 57 60 培养天数（天） 细细胞胞密密度度 0min 16min 图 5 激光照射筛选最优化菌株与对照组对比 由图 3 可见，9 号小球藻对照组和各诱导组在培养 121 天时，细胞密度整 体呈上升趋势，到第 21 天时 1min、12min 和 16min 实验组以及对照组整体仍 旧保持上升趋势，其中 1min、12min 和 16min 上升趋势较为明显，在第 57 天 的时候达到峰值。分别对三

39、个实验组进行单因素方差分析如下： 结果与讨论 - 14 - 1min 和对照组： 方差分析：单因素方差分析 SUMMARY 组观测数求和平均方差 行 1 218.2590.3932860.011736 行 2 2118.2060.8669520.143086 方差分 析 差异源 SSdfMSFP-valueF crit 组间 2.35578112.35578130.432112.26E-064.084746 组内 3.096441400.077411 总计 5.45222241 查 F 值表，得 F0.05(1,40)=4.08,F0.01(1,40)=7.31,故 F F0.01,P F0.

40、01,P F0.01,PF0.05,PF0.01,PF0.01,P0.01, 说明 8min 照射时间长度的 He-Ne 激光对 9 号小球藻的生长 具有极其显著的抑制作用。 经过各组单因素方差分析可知，激光照射长度 1min/12min/16min 的实验组 的生物量的积累均极其显著高于空白对照组，其中 16min 的实验组积累量最大， 为对照组的 3.85 倍。激光照射长度 2min/4min/8min 的实验组的生物量积累均低 于对照。 结果与讨论 - 17 - 3.2 9 号小球藻的总脂含量 3.2.1 9 号小球藻总脂含量的测定 表 2 9 号小球藻总脂含量的测定结果 照射时间长度总

41、脂含量照射时间长度总脂含量 对照19.20%8min24.81% 1min34.23%12min19.39% 2min25.09%16min10.13% 4min32.27% 由表 2 可看出激光照射时间长度为 1min、2min、4min 和 8min 的实验组总 脂含量明显大于对照组的总脂含量，其中最大的为激光照射时间长度为 1min 的 实验组，为对照组的 1.78 倍。激光照射时间长度为 12min 的实验组测得总脂含 量与对照组无明显差异。激光照射时间长度为 16min 的实验组总脂含量明显低 于对照组的总脂含量。 3.2.2 对利用 9 号小球藻进行工业化生产分析结果。 由实验所得

42、数据可知，16min 照射时间长度的 He-Ne 激光可极其显著的促 进 9 号小球藻生物量的积累，但其对 9 号小球藻总脂的积累是有抑制作用的。 1min 照射时间长度的 He-Ne 激光对 9 号小球藻总脂的积累有显著的促进作用， 并且其对 9 号小球藻生物量的积累也有极其显著的促进作用。将二者第 60 天的 生物量与总脂含量进行计算比对，分别将 OD 值与总脂含量相乘的出结果： 1min 实验组为 0.447，16min 实验组为 0.241。所以 1min 实验组藻可对进一步 高产藻株筛选和生物柴油工业化规模生产提供实验参考。 结论 - 18 - 第四章 结论 1 不同时间的 He-N

43、e 照射会对 9 号淡水小球藻的生长速率和总脂积累速度 产生显著影响。 2. He-Ne 激光照射时间长度为 16min 的实验组 9 号小球藻藻株生物量积累 最为迅速，在第 60 天时的生物量为对照组的 3.85 倍。1min 和 12min 照射时间 长度的 He-Ne 激光对 9 号小球藻藻株的生长也具有极其显著的促进作用，在第 60 天时的生物量分别为对照组的 2.11 倍和 1.23 倍。 3. He-Ne 激光照射时间长度为 1min 的实验组 9 号小球藻藻株总脂含量的积 累量最大，为对照组的 1.78 倍。2min/4min/8min 实验组 9 号小球藻总脂含量的 积累也均大

44、于对照组，其中 2min 的实验组为对照组的 1.31 倍，4min 的实验组 为对照组的 1.68 倍，8min 的实验组为对照组的 1.29 倍。 4. He-Ne 激光照射时间长度为 1min 的实验组 9 号小球藻藻株最适合用于筛 选工业生产生物柴油的藻株。可为之后的生物柴油工业化生产提供科学参考。 参考文献 - 19 - 参考文献 1 Reisser W.，Meier H. and Wiessner W.，Cytological studies on the endosymbiotic unit of Paramecium bursaria Ehrbg. And Chlorella

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