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1、吉 林 农 业 科 技 学 院学 士 学 位 论 文论 文 题 目： 不同配方稀释液对银黑狐精液冷冻 保存质量的影响 年 级 专 业： 08级野生动物与自然区保护管理 学 生 姓 名： 学 号： 指 导 教 师： 评 阅 教 师： 完 成 日 期： 2012年5月10日 吉林农业科技学院不同配方稀释液对银黑狐精液冷冻保存质量的影响 摘 要用4种稀释液对5只12岁的健康种银黑狐精液进行体外低温保存，采用伊红-苯胺黑法检测精子活率，低渗肿胀法检测精子质膜的完整性，考马斯亮蓝染色法检测精子的顶体状态。结果表明：氨基乙酸稀释液低温保存时精子的活率、质膜的完整性、顶体的完整性明显优于其他3种稀释液，在第
2、3d时，精子活率为(63.592.48) %，质膜完整性为(63.572.30)%，顶体完整性为(65.272.49)%。关键词：银黑狐；精液；冷冻保存；稀释剂- I -不同配方稀释液对银黑狐精液冷冻保存质量的影响The different formulations to dilute silver and black fox semen cryopreservation quality influenceName:Major: Wild animals and nature reserve managementTutor: SAbstract With four dilutes to fiv
3、e dilute only 1 2 years old of the health of the silver and black fox semen in low temperature preservation, the Iraqi red-aniline black method to detect sperm live rate, low permeability swelling method to detect the integrity of the sperm of membrane, take an examination of MaSiLiang blue staining
4、 method to detect the sperm of the top body condition. The results show that: the amino acid low temperature preservation dilute sperm live rate, the integrity of the plasma membrane, top the integrity of the body is much better than other three diluent, at 3 days , sperm live rate is (63.592.48) %,
5、 plasma membrane integrity for (63.57 2.30) %, top body integrity for (65.272.49) %. Key Words：Silver black fox；semen；cryopreservation；thinner- III -目 录摘 要IAbstractII前 言11 材料与方法21.1 材料21.1.1 试验动物21.1.2 试验地点21.2 精液的采集21.3 精液的稀释保存21.3.1 稀释液配方21.3.2 精液的稀释31.3.3 精液的保存31.4 精液品质评价31.4.1 精子活率的检测子活率的检测31.4.
6、2 质膜完整性的检测41.4.3 顶体状态的检测42 结果与分析42.1 伊红苯胺黑染色法检测精子活率42.2 低渗肿胀试验检测精子质膜完整性52.3 考马斯亮蓝染色法检测银黑狐精液中顶体完整精子的比率62.4 银黑狐精液在不同稀释剂保存下不同方法间的相关系数63 讨论73.1 卵黄对精液质量的影响73.2 甘油对精液质量的影响7结 论8参 考 文 献9致 谢10不同配方稀释液对银黑狐精液冷冻保存质量的影响前 言目前，狐人工授精技术作为养狐业的一项重大技术，在引进芬兰蓝狐改良我国现有蓝狐品质的过程中，已愈来愈被广大养狐者所重视。随着人工授精技术的不断开展，精液的体外保存就显得十分重要。目前生产
7、中主要使用鲜精进行人工授精，受孕率也比较理想，但精子的存活时间短，使优良的种狐资源难以得到充分利用，造成一些优良精液的浪费。由于精子解冻后的低成活率和人工授精后的低繁殖率，使得银黑狐精液冷冻技术难以得到推广1。精液的低温保存可以减少冷冻对精子的损伤，而且存活时间比常温时明显延长，可用于人工授精。但随着体外保存时间的延长，精子的受精能力会逐渐降低。所以，银黑狐精液低温保存及保存时精子质量的评价就显得非常重要。在我国，研究狐的人工授精开始于20世纪60年代，而冷冻精液的研究是在人工授精工作的基础上于20世纪90年代开始在生产上探索并应用2，其结果远不如象家畜精液冷冻那样拥有一整套完备的成熟技术措施
8、，这是狐属动物在人工饲养条件下繁殖力不高的表现。文献查新表明，稀释液是精子的保护剂，对精液的保存效果起决定性作用。关于银黑狐冷冻稀释液方面的研究报道很少。本选题设计不同稀释液对银黑狐精子低温保存的影响的进行研究，筛选出一种高效低温保存银黑狐精子的稀释液配方，可以提高银黑狐人工授精技术的效率。冷冻精液的应用可进一步提高优良种公狐的配种潜力，可进行种间杂交，可使母狐配种不受时间地域的限制。通过研究不同配方稀释液对银黑狐精液冷冻保存质量的影响3，筛选出一种高效低温保存银黑狐精子的稀释液配方，可以提高银黑狐人工授精技术的效率4，获得更大的经济效益。为普及银黑狐的冷配提供科学依据，对发展我国养狐业集约化
9、、科学化和规范化饲养具有极其重要的意义。本研究对银黑狐精液用伊利尼变温液(IVT) 、氨基乙酸、卵黄牛奶、葡萄糖卵黄4种低温稀释液稀释保存，在05保存5d的过程中对精子的质量从活率、质膜的完整性、顶体的完整性进行了检测。利用伊红苯胺黑检测精子的活率；利用低渗肿胀实验检测精子质膜的完整性；利用考马斯亮蓝染色检测精子顶体的状态5。为探讨行之有效的精液低温保存的稀释液配方，提高银黑狐人工授精技术的效率提供依据。1 材料与方法稀释液是精子的保护剂，对精液的保存效果起决定性作用。一般的稀释液由糖类、蛋白质、脂类、缓冲液、保护剂和其他添加物质组成。动物精液种类不同，所用方法不同其稀释液的组成也不同。本试验
10、选用伊利尼变温液(IVT)、氨基乙酸、卵黄牛奶、葡萄糖卵黄4种稀释液对银黑狐精液进行低温保存，从精子活率、质膜完整性、顶体状态3个方面对精子质量进行检测，旨在筛选出一种高效低温保存银黑狐精子的稀释液配方，为普及银黑狐的冷配提供理论依据。1.1 材料1.1.1 试验动物试验动物为12岁的健康种银黑狐5只，均为雄性。1.1.2 试验地点精液采集于2012年2月至3月在吉林市左家狐场。稀释液配制及试验样品测试在吉林农业科技学院动物繁殖实验室完成。1.2 精液的采集采用手握法采精，将公狐固定于采精架上，呈站立姿势，待其安静后，用42 0. 1 %的高锰酸钾水对阴茎及其周围部位进行消毒。然后，用右手拇指
11、、食指和中指握阴茎龟头尖端，上下轻轻滑动，待阴茎稍有突起时将阴茎由公狐两后腿间拉向后方，上下按摩数次，约2030 s，公狐即可产生射精反射，左手持集精杯随时准备接取精液。然后对鲜精液进行品质检查6，选取活力在0.8以上，密度在10 x 108个/ mL以上的精液用于冷冻7。1.3 精液的稀释保存1.3.1 稀释液配方试验选用IVT、氨基乙酸、卵黄牛奶、葡萄糖卵黄4种稀释液，4种稀释液配方见表1-18。 表1-1 银黑狐精液低温保存稀释液成分(每100 mL)成分稀释液配方IVT氨基乙酸卵黄牛奶葡萄糖卵黄柠檬酸钠/g2.000.72碳酸氢钠/g0.21氯化钾/g0.04葡萄糖/g0.305.50
12、氨苯磺胺/g0.30氨基乙酸/g1.82乳糖/g1.00蔗糖/g0.16奶粉/g0.40甘油/g5.00卵黄/mL10.005.0020.0020.00链霉素/万 IU10101010青霉素/万 IU101010101.3.2 精液的稀释稀释液均为实验当日新配制，试验前将四种稀释液作37水溶同温处理，选取活力在0.8、密度在10 x 108个/ mL以上的精液，与预热好的稀释液，以精液：稀释液=1：2(体积)的比例稀释9。1.3.3 精液的保存将IVT、氨基乙酸、卵黄牛奶、葡萄糖卵黄4种稀释液稀释在35 冰箱内平衡2 h。用铝盒盖距液氮面1 cm左右，在-80-100下滴冻，1 mL精液滴冻1
13、01粒，冻后取出冻精检查精子活力后，再放入纱布袋内浸入液氮罐保存。将稀释后的4份精液分别在0，2，4，8，12h及1，2，3，4，5d取出适量的精液，放入37 的恒温水浴中升温处理，升温后的精子用伊红苯胺黑染色、低渗肿胀试验和考马斯亮蓝染色进行质量评价。1.4 精液品质评价1.4.1 精子活率的检测子活率的检测将染色液伊红(5%)、苯胺黑(1%)按1:1混合，37 预热。取少量稀释后的精液与染色液迅速混合，制成抹片自然干燥，显微镜下观察，死精子为红色，活精子不着色或只在头部的核环处呈淡红色。随机观察200个精子并计算出死活精子的比例。1.4.2 质膜完整性的检测 取l mL低渗液于集精杯中，3
14、7预热5 min，取稀释后的精液0.1 mL加入预热的低渗液中，37孵育30 min。在高倍镜下计数200个精子，数出精子尾部出现肿胀的百分率。1.4.3 顶体状态的检测取80 L精子稀释液置于1 mL生理盐水中，10 000 r/min离心15s，弃上清液，取沉淀加1 mL3.7%多聚甲醛和磷酸盐缓冲液(PBS)后，用加样器悬浮，室温固定30 min，离心，弃上清液，取沉淀用1 mL PBS悬浮，离心，弃上清液，取沉淀用500800 L PBS悬浮，涂片干燥，0.22%考马斯亮蓝染色5 min，用蒸馏水洗去染液后，干燥，中性树胶封片、观察。随机选取200个顶体蓝色、边缘光滑的精子为具有完整顶
15、体的精子类型10。2 结果与分析 2.1 伊红苯胺黑染色法检测精子活率表2-1银黑狐精液中活精子的比率 %保存时间精液稀释液IVT氨基乙酸卵黄牛奶葡萄糖卵黄0 h82.91Aa1.0982.91Aa1.0982.91Aa1.0982.91Aa1.092 h81.13Aa2.1581.23Aab1.9579.60Ab1.9680.55Ab1.494 h78.56Ab1.7078.92Ab1.7975.99Bc1.7579.38Ab2.458 h76.45Ab3.3675.47Ac2.6472.01Bd2.4376.05Ac2.2612 h71.69ABc3.2472.15Acd2.6868.27
16、Ce1.5974.28Ac2.701 d65.96ABd4.1668.97ACde3.6064.48Bf2.0470.38Cd2.292 d60.44Abe3.6565.57Cef2.8857.28Bg1.7364.73Ce3.193 d48.78Af3.2263.59Bfg2.4842.07Ch2.6955.04Df2.804 d27.56Ag2.2160.38Bgh3.3413.84Ci2.4120.01Dg4.955 d6.01Ah2.1355.90Bh3.734.46ACj2.358.62ADh3.65注:同行数据肩标大写字母不同表示差异显著(p0.05)；同列数据肩标小写字母不同表示
17、差异显著(p0.05)。从表2-1可知：4种稀释液保存精子活率的效果依次为氨基乙酸葡萄糖卵黄IVT卵黄牛奶。新鲜精液的精子活率是(82.911.09)%。4种稀释液保存8h后活率仍在70%以上，IVT稀释液保存的精子活率下降的最慢，而卵黄牛奶稀释液下降的最明显。保存12h后，只有氨基乙酸活率下降缓慢，其他几种活率下降显著(p0.05)。在5d时，4种稀释液保存的精子活率都显著下降，氨基乙酸稀释液最好，为(55.903.73)%。2.2 低渗肿胀试验检测精子质膜完整性表2-2银黑狐精液中质膜完整精子的比率 %保存时间精液稀释液IVT氨基乙酸卵黄牛奶葡萄糖卵黄0 h83.39Aa1.7783.39
18、Aa1.7783.39Aa1.7783.39Aa1.772 h81.27Aa2.1980.25Ab2.5779.84Aab3.8882.15Aab2.284 h78.10Ab2.6478.33Abc2.7977.89Abc2.7980.34Abc2.428 h75.26Ac1.5776.55ABc2.9575.61Acc2.0378.34BCcd2.6912 h71.71Ad2.7273.39ABcd4.7472.17Ad3.0476.03Bde2.931 d67.33Ae3.0369.81Ade2.3069.34ABd3.4973.03Be2.292 d59.48Af3.1366.72Bef
19、3.3861.21Ac2.7365.18Bf1.513 d50.65Ag2.9463.57Bfg2.3045.26Cf3.0956.25Dg3.174 d29.52Ah1.8661.47Bg2.1215.40Cg2.3526.99Ah3.335 d7.63Ai1.3356.97Bh3.188.72Ah2.1914.80Ci2.86注:同行数据肩标大写字母不同表示差异显著(p0.05)；同列数据肩标小写字母不同表示差异显著(p0.05)。从表2-2可知：4种稀释液保存精子质膜完整性比率依次为氨基乙酸葡萄糖卵黄 IVT卵黄牛奶。新鲜精液中精子质膜完整的比例为(83.391.77)% 。4种稀释液除
20、氨基乙酸在3d后精子质膜完整性迅速下降。在5d时，4种稀释液保存的精子质膜完整性都显著下降(p0.05)，氨基乙酸稀释液最好，为(56.973.18)%。2.3 考马斯亮蓝染色法检测银黑狐精液中顶体完整精子的比率表2-3银黑狐精液中顶体完整精子的比率 %保存时间精液稀释液IVT氨基乙酸卵黄牛奶葡萄糖卵黄0 h83.62Aa1.5083.62Aa1.5083.62Aa1.5083.62Aa1.502 h81.95Aab3.4181.66Aab3.4680.62Abc2.2682.85Aab1.334 h78.95Abc1.9879.45Abc1.7278.26Acd2.7381.02Aab2.6
21、78 h76.04Acd3.7277.09Acd2.4476.81Ad2.2079.53Abc3.6512 h73.36Ade1.8575.42ABd2.7173.03Ae1.2777.39Bc2.591 d69.78Ae3.6171.31Ae2.8370.55Ae2.8873.33Ad2.912 d61.77Af2.8569.24Bef3.7861.79Af2.1266.58Be2.753 d52.69Ag3.1265.27Bfg2.4946.54Cg2.3761.12Df3.114 d31.42Ah2.5163.75Bg2.2219.02Ch2.2228.81Ag2.115 d13.31A
22、i1.9960.52Bh2.039.74Ci2.0218.13Dh2.37注:同行数据肩标大写字母不同表示差异显著(p0.05)；同列数据肩标小写字母不同表示差异显著(p0.05)。从表2-3可知：4种稀释液对蓝狐精液顶体完整性的保存效果依次为氨基乙酸葡萄糖卵黄 IVT卵黄牛奶。新鲜的精液中，具有完整顶体精子的百分率为(83.621.50) %。4种稀释剂保存12h精子顶体完整比率非常高。当保存1d时，4种稀释液顶体完整性还很高，之后顶体完整性比率不断下降，氨基乙酸稀释液下降缓慢。在5d时，氨基乙酸稀释液最好，为(60.522.03)%。2.4 银黑狐精液在不同稀释剂保存下不同方法间的相关系数
23、表2-3不同方法检测银黑狐精子在不同稀释液低温保存时质量的相关系数方法伊红苯胺黑低渗试验考马斯亮蓝伊红苯胺黑0.99860.9981低渗试验0.99860.9991考马斯亮蓝0.99810.9991用低渗肿胀试验和考马斯亮蓝染色法同时检测精子头尾部膜的功能状态，用伊红苯胺黑染色和考马斯亮蓝染色法同时检测精子的活率和顶体的完整性，结果均高度相关，显示数据稳定可靠。3 讨论稀释液对精子的体外保存起着决定性的作用，稀释液的成分影响精液的质量11。3.1 卵黄对精液质量的影响试验选择的4种稀释液中都加入了卵黄，通常卵黄被用来防止冷刺激，它可以直接渗透到质膜内，保持质膜稳定性，防止由于膜不稳定引起获能、
24、顶体反应导致的精子死亡。3.2 甘油对精液质量的影响 试验中，氮基乙酸可作为精子呼吸的代谢基质，增强其存活时间。葡萄糖卵黄稀释液中加入了甘油，甘油作为一种抗冻物质已广泛应用于冷冻精液中12，但在低温稀释液中加入甘油，保存效果并不十分理想13。这可能是由于低温保存时精子的新陈代谢作用比冷冻保存时活跃，而甘油具有弱毒性且能渗入到精子内，使精子的形态受到损伤。IVT稀释液中的碳酸氢钠和氯化钾虽能补充保存过程中钠、钾离子的缺失，但对精子保存效果并不理想。卵黄牛奶稀释液中的牛奶和卵黄都含有卵磷脂、脂蛋白及其复合物，具有防止精子冷体克的作用，但二者在同一稀释液中的保存效果不明显，是4种低温稀释液中对精子保
25、存效果最差的，与期望结果差异显著，其原因还需进一步深入研究14。结 论4种稀释液对银黑狐精子低温保存效果依次为氨基乙酸葡萄糖卵黄 IVT卵黄牛奶。低温稀释液IVT、葡萄糖卵黄、卵黄牛奶稀释液在保存2d、氨基乙酸稀释液在保存4d时精液中精子的活率、质膜及顶体的完整性仍高于60%，均可用于输精，氨基乙酸稀释液是4种稀释液中对精子低温保存效果最好的。利用氨基乙酸稀释液低温保存银黑狐精子的稀释液配方，可以解决精子解冻后的低成活率和人工授精后的低繁殖率的问题，使得银黑狐精液冷冻技术得以推广，提高经济效益，对发展我国科学化集约化养狐有促进作用。参 考 文 献1 钱国成.狐的人工授精技术J.特种经济动植物.
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