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1、毕业设计（论文）别嘌呤对海兰褐蛋公鸡血尿酸等血液指标的影响EFFECT OF ALLOPURINOL ON BLOOD INDICATORS LIKE SERUM URIC ACID OF THE HIGHLAND BROWN EGG ROOSTER毕业设计（论文）任务书（指导教师填表）填表时间： 2012 年 1 月 3 日主要研究内容 本试验以海兰褐蛋公鸡为实验动物，以血清黄嘌呤氧化酶、血尿酸和血肌酐值作为痛风（高尿酸血症）建模和药物治疗效果的观察指标，研究别嘌呤对血清尿酸等指标的影响，以期对痛风（高尿酸血症）的临床用药和科学研究提供参考。主要技术指标(或研究目标)试验分三个组，阴性对照组
2、（正常组），阳性对照组和试验组此二者用高钙高蛋白饲料成功复制出了痛风（高尿酸血症）的实验模型3，然后试验组饲喂别嘌呤加以治疗。分别在分组后的第15天、第28天（用药第10天）和第35天（用药第17天）采血，离心，采集血清，用试剂盒测定各指标，记录数据；并有选择性的进行病理解剖观察，对典型病变拍照记录。进度计划2011.12.26 提交题目申请表、下达毕业论文计划任务书；2012.12012.2 查阅资料，准备试验材料；2012.22012.3 撰写开题报告，开题答辩，做预备试验；2012.32012.4 做正式试验；2012.42012.5 总结实验，整理结果数据，撰写论文；2012.5201
3、2.6 修改毕业论文，论文答辩。主要参考文献1 甘盂侯.中国禽病学M.北京：中国农业出版社，2003，4134152 雷鹏, 郭小权, 曹华斌, 等.禽痛风的研究进展J.中国家禽,2011,2（33）3 马冬梅, 陶国栋, 张焕春. 鸡痛风发生的生理生化机制及防治措施J.中国畜牧兽医,2008,11(35):10-11.教研室主任签字： 年 月 日别嘌呤对海兰褐蛋公鸡血尿酸等血液指标的影响摘 要本试验以海兰褐蛋公鸡为实验动物，以血清黄嘌呤氧化酶、血尿酸和血肌酐值作为痛风（高尿酸血症）建模和药物治疗效果的观察指标，研究别嘌呤对血清尿酸等指标的影响，以期对痛风（高尿酸血症）的临床用药和科学研究提供
4、参考。试验分三个组，阴性对照组（正常组），阳性对照组和试验组。试验结果：由分组后第28天（用药后第10天）采血所得试验数据可知，阳性对照组血尿酸水平（483.3860）480（mol/L），鸡的血清黄嘌呤氧化酶（XOD）活性值（9.74801.17106 U/L），与阴性对照组（6.04601.84123 U/L）相比，差异显著（P0.05），说明形成了痛风（高尿酸血症）。分组后第35天（分组后第35天）采血所得试验结果：试验组的血尿酸水平（254.267738.25272mol/L ），与阴性对照组（267.098019.33457mol/L）相比，差异不显著（P0.05）；试验组的血清黄嘌
5、呤氧化酶（XOD）活性值（7.46401.56684 U/L），与阴性对照组（6.04601.84123 U/L）相比，差异不显著（P0.05），这说明，已基本治愈了试验组鸡的痛风症。试验结果表明：别嘌呤具有显著降低患痛风鸡的血尿酸水平和血清中的黄嘌呤氧化酶的活性的作用，但对血清肌酐的作用不明显，还需进一步试验加以研究。关键词：痛风（高尿酸血症），别嘌呤，尿酸，肌酐，清黄嘌呤氧化酶EFFECT OF ALLOPURINOL ON BLOOD INDICATORSLIKE SERUM URIC ACID OF THE HIGHLANDBROWN EGG ROOSTERABSTRACTThe ai
6、m of this experiment was to research the effect that allopurinol acted on the serum uric acid etc , and expected to provide a reference for the clinical medicine and scientific research of gout(hyperuricemia) . The Highland Brown egg rooster ,in this experiment ,were selected as the experimental ani
7、mals , and the serum xanthine oxidase, the serum uric acid and the serum creatinine values were appointed as the barometer for modeling and drug treatment of the gout (hyperuricemia). The test was divided into three groups, the negative control group (normal group), the positive control group and ex
8、perimental group.The results: we knew, according to the datas acquired from collecting blood in the 28th day after grouping (the 10th day after using drug) that the serum uric acid levels of the positive control group(483.3860) was greater than 480 (mol / L),and the serum xanthine oxidase (XOD) acti
9、vity value (9.7480 1.17106 U / L) showed significant differences (P 0.05) compared with the negative control group (267.098019.33457mol/L); and the serum xanthine oxidase (XOD) activity value (7.4640 1.56684 the U / L) showed no differences (P 0.05) compared with the negative control group (6.0460 1
10、.84123) , which suggested that the gout (hyperuricemia) of the experimental group were basically cured . The results showed that: allopurinol significantly reduce the levels of serum uric acid and the activity of serum xanthine oxidase , but the role of the serum creatinine is not obvious and needs
11、further testing to be studied.KEY WORDS: gout(Hyperuricemia) , allopurinol , aric acid , creatinine , xanthine oxidase目 录1 前言11.1 痛风（高尿酸盐血症）简介11.2 痛风（高尿酸盐血症）的病因21.2.1 尿酸生成过多21.2.2 尿酸排泄障碍21.3 痛风的临床症状31.3.1 内脏型痛风31.3.2 关节型痛风31.4 发病机理31.5 别嘌呤降低血尿酸含量的机制42 材料与方法42.1 试验前准备42.2 试验分组52.3 饲料配制及成分组成52.3.1 蛋用雏
12、鸡配合饲料52.3.2 基础饲料的配制52.3.3 高钙高蛋白饲料的配制52.4 实验仪器与试剂52.4.1 仪器52.4.2 试剂52.5 痛风的造模62.6 样品的采集62.6.1 采集时间62.6.2 采集方法62.7 检测指标及方法62.7.1 血清尿酸值测定62.7.2 血清肌酐值测定72.7.3 血清黄嘌呤氧化酶测定82.8 统计学处理93 结果与分析93.1 各组鸡的血尿酸值记录与比较93.2 各组鸡的血清黄嘌呤氧化酶（XOD）活性93.3 各组鸡的血清肌酐值记录与分析93.4 痛风典型病变组织观察93.4.1 肾脏病变观察93.4.2 肝脏病变观察94. 讨论94.1 别嘌呤降
13、血清尿酸水平初探94.2 别嘌呤对未患痛风鸡作用效果推测95. 结论9参考文献9致谢9外文资料译文91 前言禽痛风早在1766年就有报道，但至今未被完全了解1。1901年Bannes2将禽痛风分为关节型和内脏型两种，并认为关节型痛风相似于人类的痛风，而内脏型痛风则类似于人类的尿毒症，首次将禽痛风与肾脏障碍联系起来。许多研究者除进一步证实禽内脏型痛风与肾脏功能损伤有密切关系外，还认为关节型痛风亦是由于肾脏功能损伤所致。在国外的文献中常用以下名词对禽痛风进行描述：关节型痛风（arficular gout）、内脏型痛风（visceral gout）、内脏性尿酸盐沉积（visceral urate d
14、eposiflon）、尿石症（urolithiasis）、肾衰竭（renal failure3。除鸡以外，火鸡、水禽（鹅）、雉、鸽子等亦可发生痛风。据国外一些禽病调查和尸检统计报道，禽痛风在一些鸡场的疾病发生中占有相当高的比例4。上世纪八、九十年代，英国和美国都将产蛋鸡的群体死亡归咎于痛风5。据报道，我国大部分禽痛风是批量发生，且死亡率较高，有时可达30%6。而且，近年来此病的发生还有增多的趋势，特别是集约化饲养的鸡群。由此说明，禽痛风到目前为止仍为我国较常见的禽病之一。别嘌呤对痛风病的治疗作用，有人在药物的对比试验中涉及到，但直接研究别嘌呤的降尿酸作用，及其作用机制的研究罕见。本试验意在通过
15、利用高钙高蛋白饲料复制出鸡痛风，然后用别嘌呤饲喂患痛风鸡，并定期采血测定血尿酸、黄嘌呤氧化酶和肌酐等指标，然后对结果进行统计学处理和分析，观察别嘌呤对血尿酸有无降低作用，初探其作用机制，为临床用药及后续研究提供参考。1.1 痛风（高尿酸盐血症）简介高尿酸血症（hypemricemia）和痛风（gout）是嘌呤代谢紊乱和尿酸排泄减少所引起的一组异质性疾病，其发病原因主要是尿酸生成增多或排泄减少，造成尿酸在体内蓄积，使血液中的尿酸浓度升高7，进而以尿酸盐沉积在关节囊、关节软骨、关节周围、胸腹腔及各种脏器表面和其他间质组织中的一种疾病8。临床上以病禽行动迟缓、腿与翅关节肿大、厌食、跛行、衰弱和腹泻为
16、特征。其病理特征是血液中尿酸水平增高,病理剖检时见到关节表面或内脏表面有大量白色尿酸盐沉积9。高尿酸血症是痛风的生化基础，而痛风必然伴有高尿酸血症。从本质上说，高尿酸血症与痛风之间并无严格界限。家禽痛风是商品鸡的常见病、多发病，遍布于世界各地，其发病率达85，病死率高达30。痛风可分为关节型痛风(articular gout)和内脏型痛风(visceral gout)两种。禽痛风遍布于世界各地,为家禽常见、多发病之一。鸡、火鸡、水禽、鸽、鹌鹑等均有发生,具有很高的发病率和死亡率。据国外统计,痛风的发病率约为16%50%。在上世纪八九十年代英国和美国等国将产蛋鸡群发生的死亡原因主要归咎于痛风。我
17、国对禽痛风的发病率和损失情况虽没有精确的统计，但据报道大部分的禽通风是大批量发生、且死亡率较高。近年来本病的发生有增多的趋势，特别是集约化饲养的鸡群，由于饲料生产、饲养管理水平中有许多可诱发痛风的因素。因此，禽痛风是我国养禽业所面临的重要问题之一10-13。1.2 痛风（高尿酸盐血症）的病因禽痛风是由多因素引起的疾病，现仍不断有新的病因被发现和证实。据文献统计，病因有数十种之多，而且两种类型痛风的发病因素也有一定的差异，现归纳如下。1.2.1 尿酸生成过多1.2.1.1 遗传因素在某些品系的鸡中，存在着痛风的遗传易感性。应该说引起关节型痛风的主要是遗传性因素，某些品种的鸡肾小管对尿酸的分泌有缺
18、陷，即使饲喂正常蛋白质水平的饲料也会引起痛风。有些研究者还从关节型痛风的高发鸡群中选育出一些遗传性高尿酸血症系鸡。1.2.1.2 高蛋白饲料饲料中蛋白含量过高，特别是大量饲喂富含核蛋白和嘌呤碱的蛋白质饲料，可产生过多尿酸。这类饲料有动物内脏(肝、肠、脑、肾、胸腺胰腺)、肉屑、鱼粉、大豆、豌豆等。研究表明，如在肾脏功能正常的情况下，饲喂蛋白水平含量稍高的饲料，虽然会使血浆尿酸水平一过性升高，但不会发生痛风。有实验在22.5%和43.97%两个蛋白质水平上进行连续42天试验，虽然发现血浆尿酸升高，但未出现内脏型或关节型痛风。不过有报道在成年鸡的日粮中加入去脂肪的马肉和5%尿素，使日粮中蛋白质的含量
19、达40%，结果引起了痛风14。1.2.2 尿酸排泄障碍1.2.2.1 传染性因素传染性支气管炎病毒的嗜肾株(nephro tropic strains)15、传染性法氏囊病毒、产蛋下降综合征病毒、禽流感病毒16，以及传染性肾病和雏鸡白痢的病原均可引起肾脏的病变，造成尿酸排泄障碍，而引起痛风。近来有报道隐孢子虫感染尿道引起鸡痛风17以及出血性多瘤病毒感染引起鹅痛风的病例。1.2.2.2 中毒性因素包括一些嗜肾性化学毒物、药物及细菌毒素等。能引起肾脏损伤的化学毒物有重铬酸钾、镉、铊、锌、铝、丙酮、石炭酸、升汞、草酸等。化学药品中主要是长期使用磺胺类药物、喹乙醇以及氨基糖类抗生素等;而霉菌毒素中毒因
20、素更显重要，如赭曲霉毒素、黄曲霉毒素、桔青霉毒素和卵孢毒素等。人类用于高尿酸血症的别嘌呤醇药物中毒时也可引起禽类的内脏型痛风18。1.2.2.3 饲养管理性因素许多报道表明，高钙日粮是造成痛风的重要原因之一19。国内程金科、黎晓敏等人先后用高钙日粮成功地复制出痛风病例。禽日粮中长期缺乏维生素A，也能导致肾小管和输尿管上皮细胞代谢障碍，造成尿酸排出受阻。其次钠/钾比例失调可诱发痛风和尿石症20。1.3 痛风的临床症状本病多呈慢性经过，病禽食欲减退，逐渐消瘦，羽毛松乱，精神委靡，禽冠苍白，不自主地排出白色黏液状稀粪，含有多量尿酸盐。母鸡产蛋量降低，甚至完全停产，有的可发生突然死亡。在临床上，以内脏
21、型痛风多见，而关节型痛风较少发生21。1.3.1 内脏型痛风鸡群中因内脏型痛风引发的死亡可以是零星出现，亦可大批发生，多为肾衰竭死亡。病禽的胃肠道疾病症状明显，如腹泻，粪便白色，肛门周围羽毛上常被多量白色尿酸盐黏附，厌食，虚弱，贫血，有的突发死亡。不同致病因素所引起的内脏型痛风其临床表现也不尽相同，而高钙（或）低磷其生前症状多不典型。1.3.2 关节型痛风关节型痛风一般呈慢性经过，病鸡食欲降低，羽毛松乱，多在趾前关节、趾关节发病，也可侵害腕前、腕及肘关节，关节肿胀。初期软而痛，界限多不明显，中期肿胀部逐渐变硬，微痛，形成不能移动或稍能移动的结节，结节有豌豆大或蚕豆大小。病后期，结节软化或破裂，
22、排出灰黄色干酪样物，局部形成出血性溃疡。病禽往往呈蹲坐或独肢站立姿势，行动困难，跛行。翅、脊椎等部位的关节，甚至肉垂的皮肤中也可形成结节性肿胀22。1.4 发病机理尿酸作为禽类含氮物（蛋白质、核酸）代谢的主要产物，比人类产生的更有意义。人类产生尿酸的虽然亦为嘌呤核苷酸分解所致，但蛋白质代谢的氮产物主要是通过合成尿素或通过谷氨酸携带经肾排出的。禽类由于缺乏尿素合成酶系（精氨酸酶）不能利用氨合成尿素，其肾脏中缺乏谷氨酰胺合成酶，氨不能由谷氨酰胺携带，禽类蛋白质代谢的氨产物通过嘌呤核苷酸合成及分解途径，以尿酸的形式排出。同时，肾脏是禽类体内尿酸代谢最重要、最关键的器官，它不仅是尿酸的生成场所，而且是
23、尿酸唯一的排泄通道23。因此，肾的结构功能状况直接决定着禽类尿酸合成代谢是否正常。肾脏中尿酸的生成部位是肾小管上皮细胞，其排泄主要是通过肾小管上皮细胞的分泌。尿酸是一种微溶于水的物质，其形成与胶体溶液中的Na+、K+、Ca2+、NH4+等阳离子的浓度和pH值有关系。肾脏集合管、输尿管上皮细胞分泌的黏液可起润滑管壁作用。目前对禽痛风发病机理的研究表明，造成尿酸排泄障碍的机制是构成禽痛风发生的主要因素。关节型和内脏型痛风的病理学观察结果认为，肾脏的原发性损伤是痛风发生的物质和形态学基础。但并不是所有的肾脏损害都可以发生痛风，如肾小球肾炎、间质性肾炎则一般很少伴发痛风，主要表现为肾小管疾病的肾病可经
24、常导致痛风24，这可能是由于肾小管主要负责尿酸转运和分泌带来的结果。总之，当禽类饲料中蛋白质和核蛋白含量过多或由于遗传等因素使得尿酸产生增多，或由于其它原因使得肾脏功能受损，尿酸排泄障碍致体内尿酸大量蓄积，从而形成高尿酸血症，以尿酸盐形式在关节、软组织、软骨和内脏表面及皮下结缔组织等处沉积下来，引起禽痛风一系列临床症状和病理变化。目前为止对于引发禽痛风（尿酸盐沉积症）的真正机制还不能很好地解释，有待今后进一步研究。肌酐是肌肉在体内的代谢产物，主要由肾小球虑过排出体外。肌酐经肾小球滤过，最后全部排出体外，肾功能若有问题就无法完全排出所产生的肌酐，即会造成血肌酐浓度上升，因此肌酐的数值就可以作为判
25、断肾脏损伤的一种标志。血肌酐升高是因为肾脏收到各种病理损伤，导致搜孙肾脏局部循环障碍，促使肾脏组织（功能肾单位）缺血缺氧，从而损伤了肾毛细血管，造成肾小球基底膜的损伤，启动肾脏的纤维化，在肾脏纤维化的启动过程中，不断释放的毒性因子促使肾脏固有细胞的表型发生转变，生成大量的不易降解的细胞外基质，细胞外基质的聚集与堆积就代替了健康的肾单位，导致肾小球的硬化，肾小球滤过功能的丧失，肌酐等物质不能被排泄掉，造成肌酐的升高。1.5 别嘌呤降低血尿酸含量的机制尿酸是嘌呤代谢的产物，主要由细胞核酸代谢分解和其它嘌呤类化合物以及食物中的嘌呤核苷酸经酶的作用分解而来。由于禽类缺乏尿酸分解酶，所以尿酸是嘌呤代谢的
26、主要终末产物。黄嘌呤氧化酶在尿酸生成过程中发挥着重要的作用，是调控尿酸生成的关键环节25，在痛风的发病中占有重要的地位。嘌呤核苷酸经过代谢，转化为黄嘌呤最终经过黄嘌呤氧化酶的氧化，转化为尿酸26。黄嘌呤氧化酶活性增强则嘌呤在体内分解代谢也增强，尿酸的生成即会增加，可致血尿酸水平升高，这是血尿酸升高及痛风发病的重要机理之一。抑制黄嘌呤氧化酶的活性是治疗痛风和降低血尿酸抑制黄嘌呤氧化酶的活性是治疗痛风和降低血尿酸的重要手段。次黄嘌呤是嘌呤核酸代谢的重要中间产物27，别嘌呤是次黄嘌呤的类似物，它可以与次黄嘌呤竞争黄嘌呤氧化酶，从而降低黄嘌呤氧化酶的有效活性，减少尿酸生成，降低血尿酸含量。2 材料与方
27、法2.1 试验前准备于洛阳公华种鸡场购买60只1日龄雄性海兰褐蛋鸡雏鸡，在河科大南校区牧场北四房饲养，前一周饲喂温水并于水中加一定量的高锰酸钾，之后一直饲喂自来水，用料为鲲鹏蛋用雏鸡配合饲料，令其自由采食，笼内设有白炽灯，并用塑料膜包住笼子，并设通风口，故笼内照明、保温及通风良好，前期共饲养38天。在试验开始后的第5天给所有鸡只进行了新城疫免疫。在试验的第20天对鸡只进行了球虫和支原体病的药物预防。2.2 试验分组除去前期饲养过程中死亡的并淘汰弱鸡，将余下的45只随机分为三组，即空白对照组（A组）、阳性对照组（B组）和实验组（C组）。空白对照组饲喂基础饲料，阳性对照组和实验组饲喂高钙高蛋白饲料
28、。笼养，自由采食及饮水。2.3 饲料配制及成分组成2.3.1 蛋用雏鸡配合饲料由洛阳市鲲鹏饲料有限公司生产，适用于9周龄以前鸡。成份如下：粗蛋白18.0%，粗纤维5.5%，粗灰分8.0%，粗脂肪2.5%，钙0.8-1.4%，总磷0.33%，食盐0.3-0.8%，蛋氨酸0.3-0.6%。2.3.2 基础饲料的配制浓缩料（由洛阳欣牧川饲料有限公司生产，适用期22日龄-出栏前7天，其蛋白含量在40%以上）：玉米粉（牧场提供，蛋白含量约10%）=4:6。这样，饲料整体蛋白含量约22%。2.3.3 高钙高蛋白饲料的配制玉米粉（牧场提供，蛋白含量约10%）：豆粕（蛋白含量约45%）：进口鱼粉（蛋白含量约6
29、0%，钙含量约5%）：骨粉（钙含量约30%）：酵母干粉（由湖北省牧源生物科技有限公司生产。其蛋白含量55%2，酵母细胞数32%2，活性细胞率85%）=50:30:5:5:10。这样，饲料整体蛋白含量约25%。2.4 实验仪器与试剂2.4.1 仪器紫外可见光分光光度计（南京麒麟分析仪器有限公司生产的752型），离心机（台式过滤离心机，TF-1-B型，飞鸽品牌）、恒温水浴锅，低温冰箱，手提式不锈钢压力蒸汽灭菌器 （电热型） 18L ；5ml注射器及针头，10ml离心管，10ml采血管，各量程移液枪及枪头，烧杯，量筒，解剖器械，数码相机等。2.4.2 试剂鸡新城疫活疫苗（La Sota），辽宁益康生
30、物股份有限公司生产。用法：滴鼻、点眼、饮水或喷雾（本试验采用滴鼻点眼法）；用量：1000羽份/瓶。治疗支原体用药：500mg/L的泰乐菌素（河北久牧科贸有限公司兽药原粉部生产，保值期36个月，85%含量），每天喂625L/笼，连喂7天。治疗球虫用药：磺胺氯吡嗪（武汉大华伟业医药化工集团有限公司生产，保质期36个月，99%含量）（300mL/L）：TMP=5:1SQ（500mL/L）：TMP=5:10.5%的地克珠利，2mL/L。三组药先各自溶解配成溶液，然后再配成2L，平均分喂给三组鸡。2.5 痛风的造模鸡痛风成模的标准28是精神状态精神不振，闭眼发呆外形冠髦苍白，羽毛松乱、脱落，腿污无光泽，
31、皮肤灰污如覆膜运动运动迟缓，步行疼痛，站立不稳，喜伏卧，跄躁关节及趾部肿胀增粗变形，触摸关节躲闪、挣扎、哀鸣痛叫饮食与排泄食欲减少或绝食，素囊空虚，逐渐消瘦衰弱，粪便有大量白色尿酸盐化验血尿酸含量大于480mol/l。阳性对照组及试验组饲喂约28d（分组后的第28天）出现痛风表现。症见精神委顿、羽毛松乱、脱毛、食欲减退、粪便稀白（含大量白色尿酸盐）、关节肿大、轻捏即躲闪哀鸣、跛行疼痛、站立不稳等，采血测定各指标并进行统计分析发现也符合痛风症状，造成鸡高尿酸血症动物模型。高尿酸血症鸡造模成功后继续按原方案饲喂。将别嘌呤（广州亨达化工贸易有限公司生产，规格：100mg/片）制成100mg/L的混悬
32、液，于分组后的第19天饲喂试验组鸡，每天500ml，空白对照组及阳性对照组饲喂自来水。2.6 样品的采集2.6.1 采集时间分别于分组后的第15天、第28天和第35天采血，并对采过血的鸡只进行解剖观察。2.6.2 采集方法2.6.2.1 采血方法本实验采用鸡心脏采血，将鸡侧位固定，右侧在下，头向左侧固定。找出从胸骨走向肩胛部的皮下大静脉，心脏约在该静脉分支下侧；或由肱骨头、股骨头、胸骨前端三点所形成三角形中心稍偏前方的部位。用酒精棉球消毒后在选定部位垂直进针，如刺入心脏可感到心脏跳动，稍回抽针栓可见回血，否则应将针头稍拔出，再更换一个角度刺入，直至抽出血液。血标本3000r/min离心10mi
33、n，分离血清，-20保存待检。2.6.2.2 解剖观察方法待鸡采血后，将鸡沿腹中线剖开，观察其肝、肾、肠等内脏病理变化及内脏表面的尿酸盐沉积情况。观察被剖检鸡的腿部等关节病变。对于典型病变拍照保存。2.7 检测指标及方法2.7.1 血清尿酸值测定本试验采用尿酸测定试剂盒（南京建成生物工程研究所生产）来测定样本的尿酸值。原理：无蛋白滤液中的尿酸在碱性状态下还原磷钨酸生成钨蓝、尿囊素和二氧化碳，蓝色深浅与尿酸浓度成正比例。试剂组成：1、 试剂一：1g/l尿酸标准储备液：0.5ml1支，4保存3个月。50mg/l尿酸标准应用液的配制：1g/l标准储备液：蒸馏水=1:19，现用现配。2、 试剂二：钨酸
34、蛋白沉淀剂：60ml2瓶，4保存6个月。3、 试剂三：CUT试剂：30ml1瓶，4保存3个月。4、 试剂四：磷钨酸试剂：30ml1瓶，4保存3个月。操作方法（见表1）表1血清尿酸测定操作表 测定管标准管空白管血清（ml）0.250mg/l尿酸标准应用液（ml）0.2蒸馏水（ml）0.2钨酸蛋白沉淀剂 （ml）2.02.02.0混匀，10分钟后，3000转/分离心5分钟上清液（ml）1.61.61.6CUT试剂（ml）0.50.50.5磷钨酸试剂（ml）0.50.50.5混匀，10分钟后以波长690nm、1cm光径、空管白调零，测各管吸光度值。尿液尿酸测定：记录尿量，混匀尿液，尿酸溶解度低，易结
35、晶沉淀，因此要加温到50，立即用水稀释10倍，操作同血清，结果乘以10。注：尿酸的成色稳定性差，显色后最好20分钟内完成比色，所以一批实验最好不要超过20份标本。计算公式：(297.4mol/L)2.7.2 血清肌酐值测定本试验采用血、尿肌酐测定试剂盒（除蛋白法）测定试剂盒（南京建成生物工程研究所生产）来测定样本的血清肌酐值。原理：血浆（血清）除蛋白的上清液中的肌酐与苦味酸产生Jaffe反应，生成桔红色的加成物。试剂组成及配制：1、 试剂一：50mol/l肌酐标准品应用液20ml1瓶，4保存3个月。200mol/l肌酐标准贮备液10ml1瓶（用于标准曲线制作），4保存3个月。2、 试剂二：钨酸
36、蛋白沉淀剂100ml2瓶，4保存6个月。3、 试剂三：苦味酸溶液60ml1瓶，4保存6个月。4、 试剂四：0.75mol/l氢氧化钠60ml瓶，4保存6个月。样品前处理:取血清（血浆）0.2ml加入试剂二（钨酸蛋白沉淀剂）2ml或者取血清0.1ml加试剂二（钨酸蛋白沉淀剂）1ml，充分混匀，3000转/分，离心10分钟，取上清按下表进行测定。操作方法（见表2）表2血清尿酸测定操作表测定管标准管空白管血清（浆）蛋白滤液（ml）1.6试剂一（50mol/l肌酐标准品）（ml）1.6蒸馏水（ml）1.6试剂三（ml）0.50.50.5试剂四（ml）0.50.50.5混匀，37水浴10分钟，取出后流水
37、冷却，1cm光径，510nm波长，空白管或蒸馏水调零，测各管吸光度值。计算公式（用空白管调零）：2.7.3 血清黄嘌呤氧化酶测定本试验采用血清黄嘌呤（XOD）测定试剂盒测定试剂盒（南京建成生物工程研究所生产）来测定样本的血清黄嘌呤活性值。原理：XOD可催化次黄嘌呤生成黄嘌呤，与此同时产生超氧阴离子自由基，当有电子受体及显色剂存在的情况下，生成紫红色的结合物，根据后者生成量的多少可以推算出XOD的活力。保存条件及有效期：28密封保存，有效期3个月。试剂组成及配制（见表3）表3血清黄嘌呤氧化酶试剂盒试剂组成及配制组成规格(50管/48样)试剂一-20以下冷冻保存液体20ml3瓶试剂二28保存液体5
38、ml1瓶试剂三黄色透明液体28保存6ml2瓶试剂四黄色白色粉末-20保存粉剂2支稀释液-20保存0.6ml2支试剂四配制：临用前取4号稀释液0.6ml稀释4号粉剂一支，用不完的-20以下冷冻保存（尽量避免反复冻融）试剂五终止液28保存60ml1瓶样本前处理：血清（浆）的测定：血清可直接取样进行检测；血浆需以30003500转/分，离心10分钟，小心吸取澄清液的上清液进行检测。操作方法（见表4）表4血清黄嘌呤氧化酶测定操作表加样管空白管B测定管U试剂（ml）（ml）蒸馏水a样本b试剂一11试剂二0.050.05试剂三0.20.2试剂四0.020.02混匀，37水浴20分钟终止液11混匀，530n
39、m光径，蒸馏水调零，测各管吸光度值。a为蒸馏水的量，b为取样量，a与b在数值上相等。血清XOD单位定义及计算公式定义：每升血清（浆）在37每分钟转化1mol的底物所需的酶量为一个酶活力单位（U）。血清中XOD活性(U/L)=式中：测定管吸光度值；空白管吸光度值；反应体系稀释倍数比色光径反应时间2.8 统计学处理试验数据均以平均数标准差表示。采用SPSS程序软件进行方差分析。3 结果与分析3.1各组鸡的血尿酸值记录与比较（见表5）表5试验不同时期鸡血尿酸指标（mol/L）组别n第15天（分组后）第28天（用药后第10天）第35天（用药后第17天）阴性对照组5267.098019.33457a26
40、7.098019.33457b267.098019.33457a阳性对照组5260.848047.01476a483.386089.26377a492.9004130.73296b试验组5492.4880156.69844a254.267738.25272a注：各列相比，上标相同者差异不显著（P0.05），上标不同者差异极显著（P0.01）.随着饲喂时间的延长，阳性对照组鸡的血尿酸水平逐渐升高。但在分组后（开始饲喂高钙高蛋白）的第15天，与阴性对照组相比，差异不显著（P0.05）；而在分组后的第28天，与阴性对照组相比，差异极显著（P0.01），且其血尿酸水平483.3860480（mol/L
41、）。这说明，在饲喂高钙高蛋白15天时，并未形成痛风（高尿酸血症），而在饲喂高钙高蛋白28天时，形成了明显的痛风（高尿酸血症）。由分组后第28天（且已用药10天）所得数据可知，试验组鸡的血尿酸水平，与阴性对照组相比，差异极显著（P0.01），且492.4880480，说明形成了痛风（高尿酸血症）；与阳性对照组相比，差异不显著（P0.05），说明这段时间别嘌呤对试验组鸡的血尿酸水平降低效果不明显，原因可能是用药时试验组鸡还没形成痛风（高尿酸血症），而别嘌呤对未形成痛风（高尿酸血症）鸡的作用不明显，这也许是鸡的一种正常防御机制，但有待进一步研究。由分组后的第35天（已用药17天）所得数据分析，试验组
42、的血尿酸水平，与阳性对照组相比，差异极显著（P0.01）；与阴性对照组相比，差异不显著（P0.05）。这说明，在用药后的第17天，别嘌呤显著降低了试验组鸡的血尿酸水平，并与阴性对照组鸡的血尿酸水平相当，即已基本治愈了试验组鸡的高尿酸血症。3.2 各组鸡的血清黄嘌呤氧化酶（XOD）活性(见表6)表6 试验不同时期各组鸡血清XOD活性指标（U/L）组别n第15天（分组后）第28天（用药后第10天）第35天（用药后第17天）阴性对照组56.04601.84123a6.04601.84123c6.04601.84123a阳性对照组57.06001.75140a9.74801.17106a10.6840
43、2.05935c试验组59.57401.82604a7.46401.56684a注：同列相比，上标相同者差异不显著（P0.05），上标不同者差异显著（P0.05）随着饲喂时间的延长，阳性对照组鸡的血清黄嘌呤氧化酶（XOD）活性值逐渐升高。但在分组后（开始饲喂高钙高蛋白）的第15天，与阴性对照组相比，差异不显著（P0.05）；而在分组后的第28天，与阴性对照组相比，差异显著（P0.05）。这说明，在饲喂高钙高蛋白15天时，并未达到痛风时的血清黄嘌呤氧化酶（XOD）活性值，而在饲喂高钙高蛋白28天时，达到了血清黄嘌呤氧化酶（XOD）痛风水平，即表现出了痛风症状。由分组后第28天（且已用药10天）所
44、得数据可知，试验组鸡的血清黄嘌呤氧化酶（XOD）活性值，与阴性对照组相比，差异显著（P0.05），说明形成了高尿酸血症；与阳性对照组相比，差异不显著（P0.05），说明这段时间别嘌呤对试验组鸡的血清黄嘌呤氧化酶（XOD）活性值降低效果不明显，原因可能是用药时试验组鸡还没表现明显的痛风症状，而别嘌呤对未患痛风鸡的作用不明显，这也许是鸡的一种正常防御机制，但有待后续试验进一步研究求证。由分组后的第35天（已用药17天）所得数据分析，试验组的血清黄嘌呤氧化酶（XOD）活性值，与阳性对照组相比，差异显著（P0.05）；与阴性对照组相比，差异不显著（P0.05）。这说明，在用药后的第17天，别嘌呤显著降低了试验组鸡的血清黄嘌呤氧化酶（XOD）活性值，并与阴性对照组鸡的血清黄嘌呤氧化酶（XOD）活性值相当，即已基本治愈了试验组鸡的痛风症。3.3 各组鸡的血清肌酐值记录与分析（见表7）表7不同时期各组鸡血清肌酐值指标（mol/L）组别n第15天（分组后）第28天（用药后第10天）第35天（用药后第17天）阴性对照组521.54554.35511a21.54554.35511d21.54554.3551