《生物技术毕业论文.doc》由会员分享，可在线阅读，更多相关《生物技术毕业论文.doc（25页珍藏版）》请在三一文库上搜索。
1、高等教育自学考试毕业(论文)说明书 高等教育自学考试 毕业设计（论文）说明书 农 学 （本科） 市 地 洛 阳 准考证号 030208103550 姓 名 赵 源 涛 河南科技大学高等教育自学考试办公室 高等教育自学考试毕业(论文)说明书 高等教育自学考试 毕业设计（论文）任务书 一、题目： 红掌组培快繁过程中污染原因的分析及对策探讨 二、本环节自 2009 年 6 月 30 日起至 20010 年 6 月 30 日 三、进行地点： 河南科技大学 四、内容要求： 综述简练完整，有见解；立论正确，论述充分，结 论严谨合理，实验正确，分析处理科学；文字通顺 ，技术用语准确， 符号统一，编号齐全，书
2、写工整规范，图表完备、整洁、正确；论文 结果有应用价值。 指导教师： 职称 批准日期： 年 月 日 高等教育自学考试毕业(论文)说明书 I 红掌组培快繁过程中污染原因的分析及对策探讨 摘 要 红掌（拉丁名：Spathiphyllum floribundum） ，亦叫安祖花，红鹤芋等，天南 星科火烛属。其花色艳丽，花茎挺拔，叶型翠绿美观，是当今世界著名的切花和 盆栽花卉之一，市场潜力大，具有极高的观赏价值和经济价值。红掌的繁殖方法 通常采用分株繁殖、扦插繁殖和组织培养繁殖。但分株繁殖、扦插繁殖很难满足 当前市场的需求，组织培养是红掌快速繁殖的有效途径。由于组织培养中经常出 现不同程度的污染问题，
3、造成很大的损失，因此控制污染是植物组织培养苗工厂 化生产中重要的技术环节。本文从灭菌方法、内源性污染、继代培养中污染防治 等方面，进行了红掌组培快繁过程中污染原因的分析及对策的探讨。 关键词：红掌，组织培养，灭菌，污染，防治 高等教育自学考试毕业(论文)说明书 II ANDRAEANUM DURING TISSUE CULTURE ANALYSIS OF THE CAUSES OF POLLUTION AND RELATED COUNTERMEASURES ABSTRACT Anthurium, also called Andrew Flower, lines such as flamingo
4、, a Fire Araceae. Its bright colors, tall and straight stem, green leaf-type appearance, are well-known in todays world of cut and potted flowers, one large market potential, with high ornamental value and economic value. Flower andraeanum breeding methods commonly used ramets propagation, cutting p
5、ropagation and tissue cultur e propagation. However, ramets propagation, cutting propagation is difficult to meet current market demand, tissue culture andraeanum Flower Express are an effective way of breeding. Tissue culture because of the frequent occurrence of various degrees of pollution, resul
6、ting in great loss, so control of pollution are industrial plant tissue culture vaccine production technology in the important aspect. This article from the sterilization method, endogenous pollution subculture in such areas as pollution prevention, to discuss how to minimize the emergence of tissue
7、 in the pollution problems. KEY WORDS: Anthurium，tissue culture， sterilization， pollution，prevention and treatment 高等教育自学考试毕业(论文)说明书 III 目 录 前 言1 第 1 章 培养基的灭菌2 1.1 一般培养基的灭菌2 1.2 不耐热物质的灭菌2 第 2 章 外植体材料的消毒与灭菌4 2.1 外植体的消毒与灭菌4 第 3 章 接种前的准备工作5 3.1 器皿、工具的灭菌5 3.1.1 器皿与金属器械的灭菌5 3.1.2 布质制品的灭菌5 3.2 培养室的灭菌5 3.3
8、 无菌操作和无菌操作技术5 第 4 章 红掌诱导与继代培养过程中的污染7 第 5 章 污染的原因和预防措施8 5.1 通常污染8 5.2 内源性污染8 5.3 污染原因判断及污染苗抢救8 5.4 预防方法和措施9 5.4.1 基本方法9 5.4.2 经常检查消毒锅的灭菌质量9 5.4.3 检查培养容器是否存在问题10 5.4.4 继代培养中污染的控制10 5.4.5 减少培养基中的有机成分10 结 论11 谢 辞12 参考文献13 附 录15 外文资料翻译18 高等教育自学考试毕业(论文)说明书 1 前 言 红掌（拉丁名：Spathiphyllum floribundum） ，天南星科火烛属，
9、原产地哥伦 比亚。其花色艳丽，花茎挺拔，叶型翠绿美观，是当今世界著名的切花和盆栽花 卉之一，市场潜力大，具有极高的观赏价值和经济价值。其繁殖方法通常采用分 株繁殖、扦插繁殖和组织培养繁殖。但分株繁殖、扦插繁殖很难满足当前市场的 需求，组织培养是安祖花快速繁殖的有效途径。 植物组织培养中经常会出现不同程度的污染问题，污染是在组织培养过程中 培养基和培养材料滋生杂菌，导致培养失败的现象。它是影响植物组织培养的一 个重要因素，它通常会导致培养失败造成很大的损失。植物组培苗的工厂化生产 在我国发展速度很快，组织培养技术日趋完善，但在组织培养中通常会出现不同 程度的污染，因此预防和控制污染是植物组织培养
10、苗工厂化生产中重要的技术环 节。在植物组织培养过程中，存在两种类型的污染：一类是通常所说的污染，即 外植体消毒不彻底，无菌操作和培养过程中，如：培养基、接种工具、接种室消 毒不严格或操作不规范而导致的污染；另一类是内源菌污染，内源菌包括真菌和 细菌，内源污染一般是指内源细菌所致的污染。 本文从一般的污染的控制、内源性污染的控制、继代培养中污染防治、减少 培养基中的有机成分等方面，讨论了怎样减少组培中出现的污染问题，如：对于 一般的污染来说，主要从操作环境、操作人员、仪器；对于内源性污染主要是从 外植体预处理到外植体灭菌方法；对于继代培养污染的控制主要是从对无菌外植 体进行检验和反复进行茎尖培养
11、或分生组织培养；至于对培养基有机成分的减少 措施主要是减去培养基中的 VB1、VB6或除去培养基中的蔗糖这几方面加以论述。 高等教育自学考试毕业(论文)说明书 2 第 1 章 培养基的灭菌 1.1 一般培养基的灭菌 培养基是在有菌的环境中配制的，在该过程中会使培养基带有各种杂菌，因 此，每次培养基配制完毕和分装后应尽快灭菌，否则培养基中就会滋生各种杂菌， 改变培养基的营养成分和pH值，影响培养效果。常用灭菌方法是用高压蒸汽灭菌 法进行灭菌，将培养基置于高压灭菌锅中，从达到要求温度的时刻算起，在 0.105Mpa的压力下（121。C）灭菌15-40min。灭菌的时间取决于温度，而不是直 接取决于
12、压力。由于容器的体积不同，瓶壁的厚度不同，所需灭菌时间也不同1 （表1-1） ，对经过高压灭菌后不会变质的物品，如无菌水、培养皿、器械等，可 延长灭菌时间和增加压力。培养基灭菌时间不能过长，否则容易引起培养基中营 养成分的损失，并且琼脂也会随灭菌时间的延长，凝固能力下降，甚至不能凝固。 因此，所需的灭菌时间应随着要进行灭菌的物体体积而变化。 表1-1 培养基高压蒸汽灭菌所必须的最少时间 容器的体积（ml） 在121。C下灭菌所必须的最少时间（min） 20-50 15 75-150 20 250-500 25 1000 30 1500 35 2000 40 当灭菌锅里的热溶液冷却时，必须十分小
13、心，如果压力下降过急，超过了温 度下降的速率，就会使液体滚沸，从培养容器之中溢出。另外，只有当高压锅的 压力表指针回到零时，才能打开灭菌锅。 1.2 不耐热物质的灭菌 某些生长调节物质（GA3、Zt、IAA、IBA） 、尿素以及某些维生素等不耐热的 物质遇热易分解，不能进行高压蒸汽灭菌处理，通常只能采用单独液体过滤灭菌 方法。热分解化合物溶液的灭菌是通过过滤膜进行过滤灭菌的，然后将其加入经 高等教育自学考试毕业(论文)说明书 3 过高压灭菌过的并未凝固的培养基中。 如果是制备固态培养基，方法是先将没有不耐热物质而包含其他化合物的培 养基倒入培养瓶中进行高压蒸汽灭菌，灭菌后置于超净工作台上冷却。
14、当其冷却 至45。C左右（即琼脂凝固温度） ，琼脂将要凝固之前，加入经过滤灭菌的各项不 耐热成分的溶液，然后混匀放置，待冷凉凝固后备用，但不能在琼脂培养基温度 较高时加入，以防止不耐热物质的分解2。 高等教育自学考试毕业(论文)说明书 4 第 2 章 外植体材料的消毒与灭菌 2.1 外植体的消毒与灭菌 1、用红掌茎尖作外植体时，要尽量选取带菌少的材料，如果室外栽培的材 料污染太严重，可先将植物样本挖出，改为室内盆栽，喷布杀虫剂和杀菌剂，不 便移栽的，可套塑料袋，待长出新枝条后，再行采样接种。 2、对污染严重的外植体，可以在培养基中加入杀菌剂。也可在菌类长入组 织内部时，除去韧皮组织，只接种内部
15、的分生组织可防止材料带菌。 3、外植体消毒常用药剂有：70%75%的酒精，0.3%0.6%的次氯酸钠溶液 和 0.1%的升汞溶液等。选用何种灭菌剂和灭菌时间根据不同情况及操作者的经验 来掌握，既要求将外植体表面的微生物彻底杀死，又要求尽可能少伤害外植体组 织和表层细胞。先用 75%的酒精棉花擦拭外植体材料再使用消毒药剂常能取得较 好的消毒效果3。常用消毒剂的消毒效果比较见表 2-1: 表 2-1 常用消毒剂的消毒效果比较 消毒剂使用浓度（%） 去除难易 消毒时间（min） 效果 3.3 无菌操作和无菌操作技术 植物组织培养是一种无菌技术，因此不仅要求整个操作过程，一切用具、材 料、培养基、培养
16、室、工作人员的衣物都要无菌，而且要求工作人员在操作过程 中要遵守无菌操作的规程，如少有疏忽，都会造成无法挽回的后果，使工作前功 尽弃。污染中特别注意一种呈乳白色的细菌污染，这种细菌为芽孢杆菌。法国林 木育种协会鉴定为迟缓芽孢杆菌，它外被荚膜，耐高温，一般消毒剂难以杀死。 它可随培养材料、用具等传播；也可出现在培养基表面，或呈滴形云雾状存在培 养基内，若出现时应严格灭菌，清洗和消毒用具，并更换消毒酒精6。 操作人员操作动作要熟练、动作快、规范，这样可以缩短操作时间，减少污 染。因为有很多组织培养的失败，从材料、培养基条件等方面检查均无问题，只 是由于操作技术不熟练，如脱毒培养抽取茎尖很小，操作时
17、间长了就会使茎尖失 水变干，或不慎感染杂菌，再同时接种的环境又不是绝对无菌的。所以工作人员 在进行无菌操作是要严守以下几点： 高等教育自学考试毕业(论文)说明书 5 1、入无菌室前，要洗手，去掉指甲中的污物。 2、入室时要穿上经过消毒的工作服、帽子、口罩和鞋子等。 3、操作前要用 70% 的酒精擦洗工作人员的手，操作中要经常用酒精擦洗手。 不准讲话，亦不准对着操作区呼吸，以免微生物污染材料、培养基和用具。每次 重新操作都要把工具在火焰上消毒。 4、必须在酒精灯火焰处进行操作，如打开瓶口，转接材料。盖瓶盖前应将 瓶口在火焰上烧一下，再将盖子也在火焰上烧一下，然后盖上。 高等教育自学考试毕业(论文
18、)说明书 6 第 4 章 红掌诱导与继代培养过程中的污染 初代培养获得的无菌材料在后期或继代培养也可能出现污染，这一方面是由 于操作不慎的原因，另外即是由于初代培养中使用了营养相对简单的培养基有可 能使污染不易表现出来，有时继代材料在培养室则可能被螨传播的真菌污染。 对已污染的红掌组培苗，有时因植物材料难得或重新发生要花费很多时间， 也可切取较大的植株重新消毒接种。李春燕等用 400 或 600 万单位/L 的青霉素无 菌水溶液分别浸泡红掌组培细菌污染苗 60min 或 40min，可有效防治组培中的细 菌污染。经处理过的苗继代培养时，不再重复出现细菌污染现象，且苗分化能力 强，生根培养时，根
19、系发达，移栽成活率高7。李颖等的实验研究证明，如果继 代培养中只有真菌污染，采用 3%的多菌灵无菌液浸泡 0.5h 以上即可，用无菌水 冲洗后接种或不用无菌水冲洗直接接种都可消除真菌污染。如果在细菌污染和细 菌、真菌同时污染的情况下，可采用 HgCl2消毒法，把污染的红掌培养苗切割成 较长的茎段作外植体，用自来水冲洗 0.5h，再在超净工作台上用乙醇和 HgCl2进 行短时间的处理即可再度建立无菌苗培养体系8。 高等教育自学考试毕业(论文)说明书 7 有 高等教育自学考试毕业(论文)说明书 8 参考文献 1李云.林果花菜组织培养快速育苗技术，中国林业出版社，2003，1（2）:23- 25 2
20、王青连.植物组织培养M，中国农业出版社，2002：23-24. 3周学工业出版社，2003，80-81 9李春燕，李颖.组织培养中青霉素对细菌污染的抑制作用，东北林业大学学报， 2000,28(5):97-98 10李颖，李春燕.多菌灵和青霉素在组培污染中的应用，林业科技， 2002，27（1）：6-8 11由翠荣,曲复宁,龚雪琴等.迷你玫瑰组织培养中细菌污染的防止J，植物生 理学通讯,2004,40（1）:46-47 12周俊辉，周厚高，刘花全.植物组织培养中内生细菌污染问题广西植物 ， 2003，23(1):41-47 13biotec. 植物组织培养苗之污染与检测EB/OL.2006，1
21、5(1):16-17 14林盛，马崇烈，胡东琼. 组织培养中污染的控制J，广西农业科学， 1994(2)：87-88. 15于福科，张广军.玫瑰组织培养污染控制技术措施，陕西农业科学，2002(11): 47-48 16宋锋惠,李康,史彦江.组织培养及快速繁殖技术研究，新疆农业科学， 2002，39(6)：343-345 17肖玉兰.植物无糖组培快繁工厂化生产技术，云南科技出版社，2003，3(2): 1-4 高等教育自学考试毕业(论文)说明书 9 附 录 灭菌方法 常用的灭菌方法可分为物理的和化学的两类，即：物理方法如干热(烘烧和 灼烧)、湿热(常压或高压蒸煮)、射线处理(紫外线、超声波、微
22、波)、过滤、清 洗和大量无菌水冲洗等措施；化学方法是使用升汞、甲醛、过氧化氢、高锰酸钾、 来苏儿、漂白粉、次氯酸钠、抗菌素、酒精化学药品处理。这些方法和药剂要根 据工作中的不同材料不同目的适当选用湿热灭菌（培养基）培养基在制备后的 24h 内完成灭菌工序。 1、高压灭菌方法是最常用的物理灭菌方法，高压灭菌的原理是：在密闭的 蒸锅内，其中的蒸气不能外溢，压力不断上升，使水的沸点不断提高，从而锅内 温度也随之增加。在 0.1MPa 的压力下，锅内温度达 121 。在此蒸气温度下， 可以很快杀死各种细菌及其高度耐热的芽孢。注意完全排除锅内空气，使锅内全 部是水蒸气，灭菌才能彻底。高压灭菌放气有几种不
23、同的做法，但目的都是要排 净空气，使锅内均匀升温，保证灭菌彻底。常用方法是：关闭放气阀，通电后， 待压力上升到 O05MPa 时，打开放气阀，放出空气，待压力表指针归零后，再 关闭放气阀。三次放气后，关阀再通电，压力表上升达 01015Mpa 时，维 持 1520min。对高压灭菌后不变质的物品，如无菌水、栽培介质、接种用具， 可以延长灭菌时间或提高压力。而培养基要严格遵守保压时间，既要保压彻底， 又要防止培养基中的成分变质或效力降低，不能随意延长时间。对于一些布制品， 如实验服、口罩等也可用高压灭菌。洗净晾干后用耐高压塑料袋装好，高压灭菌 2030min。高压灭菌前后的培养基，其 pH 值下
24、降 0.20.3 单位。高压后培养 基 pH 值的变化方向和幅度取决于多种因素。在高压灭菌前用碱调高 pH 值至预定 值的则相反。培养基中成分单一时和培养基中含有高或较高浓度物质时，高压灭 菌后的 pH 值变化幅度较大，甚至可大于 2 个 pH 值单位。环境 pH 值的变化大于 0.5 单位就有可能产生明显的生理影响。高压灭菌通常会使培养基中的蔗糖水解为单 糖 从而改变培养基的渗透压。在 8%20%蔗糖范围内，高压灭菌后的培养基约 升高 0.43 倍。培养基中的铁在高压灭菌时会催化蔗糖水解，可使 15%25%的蔗 高等教育自学考试毕业(论文)说明书 10 糖水解为葡萄糖和果糖。培养基值小于 5
25、.5，其水解量更多，培养基中添加 0.1% 活性炭时，高压下蔗糖水解大大增强，添加 1%活性炭，蔗糖水解率可达 5%。 2、灼烧灭菌（用于无菌操作的器械）在无菌操作时，把镊子、剪子、解剖 刀等浸入 95%的酒精中，使用之前在酒精灯火焰上灼烧灭菌。冷却后，立即使用。 操作中可采用 250 或 500ml 的广口瓶，放入 95%的酒精，以便插入工具。 3、干热灭菌（玻璃器皿及耐热用具）干热灭菌是利用烘箱加热到 160180。C 的温度来杀死微生物。由于在干热条件下，细菌的营养细胞的抗热性 大为提高，接近芽孢的抗热水平，通常采用 170 持续 90min 来灭菌。干热灭菌 的物品要预先洗净并干燥，工
26、具等要妥为包扎，以免灭菌后取用时重新污染。包 扎可用耐高温的塑料。灭菌时应渐进升温，达到顶定温度后记录时间。烘箱内放 置的物品的数量不宜过多，以免妨碍热对流和穿透，到指定时间断电后，待充分 冷凉，才能打开烘箱，以免因骤冷而使器皿破裂。干热灭菌能源消耗太大，浪费 时间。 4、过滤灭菌（不耐热的物质）一些生长调节剂，如赤霉素、玉米素、脱落 酸和某些维生素是不耐热的，不能用高压灭菌处理，通常采用过滤灭菌方法。可 用无菌的孔径 0.200.45um 的硝酸纤维素膜过滤菌类，当溶液通过滤膜后，细 菌的细胞和真菌的孢子等因大于滤膜直径而被阻，在需要过滤灭菌的液体量大时， 常使用抽滤装置；液量小时，可用注射
27、器。使用前对其高压灭菌，将滤膜装在注 射器的靠针管处，将待过滤的液体装入注射器，推压注射器活塞杆，溶液压出滤 膜，从针管压出的溶液就是无菌溶液。 5、紫外线和熏蒸灭菌（空间） (1)紫外线灭菌在接种室、超净台上或接种箱里用紫外灯灭菌。紫外线灭菌 是利用辐射因子灭菌，细菌吸收紫外线后，蛋白质和核酸发生结构变化，引起细 菌的染色体变异，造成死亡。紫外线的波长为 200300nm，其中以 260nm 的杀菌 能力最强，但是由于紫外线的穿透物质的能力很弱，所以只适于空气和物体表面 的灭菌，而且要求距照射物以不超过 120 cm 为宜。 (2)熏蒸灭菌用加热焚烧、氧化等方法，使化学药剂变为气体状态扩散到
28、空 气中，以杀死空气和物体表面的微生物。这种方法简便，只需要把消毒的空间关 闭紧密即可。常用熏蒸剂是甲醛，熏蒸时，房间关闭紧密，按 58ml/m3用量， 将甲醛置于广口容器中，加 5 g/m3高锰酸钾氧化挥发。熏蒸时，房间可预先喷湿 高等教育自学考试毕业(论文)说明书 11 以加强效果。冰醋酸也可进行加热熏蒸，但效果不如甲醛。化学消毒剂的种类很 多，它们使微生物的蛋白质变性，或竞争其酶系统，或降低其表面张力，增加菌 体细胞浆膜的通透性，使细胞破裂或溶解。一般说来，温度越高，作用时间越长， 杀菌效果越好。另外，由于消毒剂必须溶解于水才能发挥作用，所以要制成水溶 状态，如升汞与高锰酸钾。还有消毒剂
29、的浓度一般是浓度越大，杀菌能力越强， 但石炭酸和酒精例外。 6、喷雾灭菌（物体表面）物体表面可用一些药剂涂擦、喷雾灭菌。如桌面、 墙面、双手、植物材料表面等，可用 70%的酒精反复涂擦灭菌，l%2%的来苏儿 溶液以及 0.25%1%的新洁尔灭也可以。 高等教育自学考试毕业(论文)说明书 12 外文资料翻译 CHITOSAN ON ANDRAEANUM TISSUE INHIBITION OF BACTERIA CONTAMINATION Abstract: The fungi was isolated and purified from polluted anthurium subcultur
30、e medium, identified to be DeuteromycotinaHyphpmycetes Hyphomycetales Dematiaceae and trichoderma. The inhibition effect of the three kinds of chitosan on the fungi wasconducted.The results showed that the chitosan had inhibition effect on the fungi. The higher concentrations of chitosan had a bette
31、inhibition effect than the lower ones.The inhibition effect of 50000 and 250000 molecular weight chitosan is better than that of the3000 molecular weight. It is preliminarily proved that chitosan had good inhibition effect on the fungi from polluted tissue culture , andwill have good application val
32、ue in the fields of pollution prevention in flowers tissue culture. Key words: tissue culture; contamination; Chitosan; inhibition effect Plant tissue culture, not only in plant breeding, rapid propagation of seedlings and the production of useful secondary metabolites, such as the use of a wide ran
33、ge of plant genetic engineering is and Plant Molecular Biology, one of the important foundation for the study 1. Pollution, browning, glass and tissue culture are the main problems, including pollution of the most common 2. Therefore take effective prevention and control measures to reduce the chanc
34、e of contamination occurred, tissue culture is an important guarantee for success. Chitosan (chitosan) is the chitin in strong alkaline conditions from B After the formation of acyl an important derivative is determined by a number of N- acetyl glucosamine through -(1-4) glycosidic bond linking the
35、nature of it more lively. Has natural antibacterial properties of chitosan, and a broad spectrum antimicrobial, in recent years, chitosan in various fields such as agriculture，medicine 3, manufacture 4, 高等教育自学考试毕业(论文)说明书 13 food 5, etc. The use of great importance. Tissue culture of the chitosan in
36、the application of inhibition has not been reported. This experiment to be from the contaminated medium subculture andraeanum extraction, purification and identification of bacteria contamination, with different molecular weight chitosan and different concentrations of their inhibition, and explore
37、the best inhibitory effect of chitosan molecular weight and the best inhibitory concentration, in order to explore the chitosan as a new type of antimicrobial agent to provide specific information. 1 Materials and Methods 1.1 Test materials 1.1.1 Isolates Streptomyces bacteria pollution (code-named
38、WCHPA), separated from the laboratory contamination andraeanum subculture medium. 1.1.2 Test for Drugs Chitosan, a Zhejiang Xing Biotechnology Australia Limited, a molecular weight of 3kd (degree of deacetylation 80%), 50kd (degree of deacetylation 90%), 25kd (degree of deacetylation 90%)6. 1.1.3 Me
39、dium PDA medium Potatoes 200g, glucose 20g, agar 20g, distilled water 1000ml, pH value of the natural. 1.2 Test Method 1.2.1 Isolation and purification Clean out the work in Taichung andraeanum subculture medium pollution fungi, from PDA medium. Repeat several times until the colony characteristics
40、and morphology changes are no longer, we can identify bacteria have been purified. 1.2.2 Identification of bacteria contamination Continuous observation of colony morphology after purification. Film production equipment to further observe the shape strain, mycelium, spores, spore cell spore cell mor
41、phology and conidiation of the ways and forms and so on, taking pictures with a digital microscope. 1.2.3 Bacteriostatic Test 高等教育自学考试毕业(论文)说明书 14 That the different molecular weight chitosan with 1M solution of acetic acid dissolved mixed with PDA medium to produce a final concentration of chitosan
42、 (0.5,1.0,1.5,2.0,2.5,3.0)mg/ml of culture medium, 1M solution of sodium hydroxide by adjusting pH value of 6.0, in addition to the control without chitosan, the other with the addition of chitosan in the same medium7. To eliminate all high-pressure cooker sterilization 30min under 121 and pour plate. Mycelium white to green after 24h and then into a brown,