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1、毕业设计（论文）摘 要色谱法（chromatography）是用于分离多组分有机混合物的一种高效分离技术，色谱分析技术已成为药物分析学科领域中最基本也是最重要的研究手段和方法，具有广阔的应用前景。海洋真菌及其代谢产物中的某种化学成分是天然药物和天然食品添加剂的重要来源。由于某些有效的成分往往含量较低，并与许多其他化学成分并存，其提取分离是一项繁琐而艰巨的工作。色谱技术的发展与应用，对于各类有机物化学成分的分离、纯化与鉴定工作起着重大的推动作用。本论文实验主要是针对一株海洋真菌的四种培养条件（H1、PDB、GMPY和大米培养基）进行优化，其菌丝体和菌液经乙酸乙酯萃取获得粗样后再进行初步的柱色谱分
2、离与纯化，配以TLCHPLC/UV检测，以期获得含有目标化合物的培养条件。筛选结果表明：H1培养基和大米培养基的代谢产物丰富，适宜进一步研究。关键词：柱色谱，薄板层析，高效液相色谱/紫外分析技术，海洋真菌，培养条件优化ABSTRACTChromatography is a highly efficient separation technology which is used to isolate multi-component organic mixture. Chromatography technology has become one of the most important and
3、 fundamental research tools and methods in drug analysis area. It has broad application prospects. The chemical compositions of marine fungus and their metabolites is an important source of some natural medicine and natural food additives. Because of the low contents of some active ingredients and c
4、o-existence with many other chemical elements, their extraction and isolation is a tedious and difficult task. Development and application of chromatographic technique is playing a significant role in promoting the separation, purification and identification of various organic chemical components. E
5、xperiment of the thesis focuses on the optimization of four culture conditions (H1, PDB, GMPY and RICE) of the marine fungus. The mycelium and broth samples, extracted by ethyl acetate in advance, conduct a preliminary column chromatography isolation and purification, together with the TLCHPLC/UV de
6、tection, in order to obtain the culture conditions of containing the target compounds. These results demonstrate that: H1 medium and RICE medium with rich metabolites and containing some of the target compounds are suitable for further study.KEY WORDS: Column chromatography, TLC, HPLC/UV analysis te
7、chniques, marine fungus, optimization of culture conditions目录摘 要IABSTRACTII前 言1第1章 综述31.1 色谱分析简介31.1.1 色谱法概况31.1.2 几种应用广泛的色谱分析技术61.2 色谱分析与海洋药物的提取11第2章 实验部分122.1 菌株的培养条件优化122.1.1 菌株来源122.1.2 菌株的分离纯化122.1.3 培养条件优化122.2 真菌的提取与分离132.3 真菌代谢产物的分离提纯142.4 化学检测142.4.1 薄层层析分析(TLC)142.4.2 高效液相色谱分析(HPLC)15第3章 结
8、果与分析163.1 真菌培养条件优化163.2 真菌代谢产物的产物量比较173.3 真菌代谢产物的化学检测183.3.1 TLC检测结果183.3.2 HPLC检测结果203.3.3 HPLC/UV分析结果21第4章 结论254.1 真菌培养条件优化254.2目标化合物的化学筛选254.3建议与不足25参考文献26致 谢28III青岛理工大学毕业设计（论文）前 言本次研究课题的目的在于色谱分析在海洋真菌活性成分筛选中的应用情况。海洋活性真菌的次级代谢产物种类丰富，过去研究的焦点主要在海藻和软体动物身上，并且得到了许多极具潜力的药物先导化合物。近年来大量的生物学及生态学的研究结果表明，从海绵动物
9、中得到的许多化合物，其初始来源是与宿主有机体共生的海洋微生物。目前，海洋药物可持续性研究已经逐步转向关注与宿主动物共生的微生物。海洋动植物资源有限，收集困难，分离纯化复杂，难以工业化生产等弊端一直是阻碍海洋药物研究进一步开展的棘手问题，而海洋中种类最为多样的海洋微生物以其代谢产物多样和可培养性逐渐引起了研究者的关注，尤其在抗肿瘤活性方面，利用这些丰富的海洋天然产物，经有机全合成或适当的化学结构修饰等手段可用来生产高活性的海洋药物。海洋药物在临床或临床前研究中表现出乐观的前景，而该领域的发展促使这些海洋生物的获取方法不断更新。色谱技术是分析化学领域最重要的分离分析手段。随着色谱研究工作的迅猛发展
10、，各种新的色谱方法和检测技术日趋成熟，色谱联用技术也随之应运而生，因其具有高速、高效、高分辨、微量检测及分析自动化的性能和技术优势，而显示出广阔的应用前景。近年来，色谱联用技术在药物及其代谢产物研究、天然药物化学成分分析及生物大分子分析等方面的应用较为广泛。高效液相色谱是天然产物化学研究中的一种常规分析技术，已被广泛应用于天然产物的分析、分离包括制备性分离、纯化，以及检测化合物的纯度等多方面。目前国外很多实验室都有液相-紫外-二级管阵列检测（LC/UV-DAD）联用仪。LC/UV-DAD技术的适用对象是具有强发色团的天然产物,通过分析可获得非常有用的在线结构信息。目前最新的LC/UV-DAD联
11、用仪不仅可以测定每个流出峰的紫外光谱，并能自动在计算机中与天然产物数据库中收载的化合物进行对照检索鉴定但在对化合物的LC/UV-DAD图谱进行分析时有一点需要注意，由于化合物的紫外光谱与使用的溶剂系统的组成有关，因此同一化合物在不同溶剂系统中测定的紫外光谱会有一些差别。本论文实验主要是针对一株海洋真菌的培养条件进行优化，然后进行初步的柱色谱分离与纯化，配以TLCHPLC/UV检测，渴望得到含有目标化合物的培养条件，为后续的专性研究提供有利的基础保障，并在论文过程中体会科研的基本过程，培养基本的科研素质。第1章 综述1.1 色谱分析简介1.1.1 色谱法概况色谱法（chromatography）
12、又称色层法、层析法，是用于分离多组分有机混合物的一种高效分离技术。1906年，俄国植物学家茨维特（tsvet, 1872-1919）首创了这种分离技术，他把植物叶绿体色素的石油醚浸渍液倒入一根装有碳酸钙吸附剂的细直玻璃柱中，再加入纯石油醚，任其自由流下，原混合物开始被分离成不同颜色的谱带（即植物色素的分离），且以不同速度过柱子，然后按谱带颜色对混合物进行鉴定分析。当时，茨维特把这种分离结果称为色谱图，把这种分离方法命名为色谱法。七十多年来，色谱理论逐步建立和发展，色谱分离技术已逐步实现仪器化、自动化、高速化，并从分离手段发展到分析手段，色谱方法的应用范围不断扩大，色谱分离的对象早已不限于有色物
13、质，但“色谱法”这一名称一直被沿用 汪茂田，谢培山，王忠东，天然有机化合物提取分离与结构鉴定，北京：化学工业出版社，2004，69200。S1 S1S2 S2SPSPMPMP图1-1色谱分析的一般原理示意图色谱法是基于混合物各个组分在两相（固定相和流动相）之间的不均匀分配进行分离的一种方法。不均匀分配的先决条件，是各个组分对两相亲和力的不同和向两相不均匀分配的可能性。由于混合物中各组分对两相的亲和力有差异，它们穿过固定相的流动速度（或在固定相中的滞留时间）就不同，从而得到分离。色谱法的基本原理可用图1-1来描述。图中，SP和MP分别表示毛细管色谱中的固定相和流动相；S1和S2是待分离的两种组分
14、物质，被分离混合物组分S1对流动相具有较高的亲和力，而组分S2更亲固定相；S1和S2代表两组分按箭头所指方向随流动相流过管子一定时间后所到达的区域位置。图1-2用圆球形物质和浸入固定相SP和流动相MP中的程度，表示混合物组分在两相之间分配的差异。由于热运动的缘故，被分离物质中的分子具有连续进入两相中的趋势。然而，它们在固定相中的平均滞留时间（即在该动力学过程中使物质得以分离的时间）有不同，物质S1的分子主要处于流动相中，它们被流动相带走的量按计算比平均数多，而S2在固定相中的平均滞留时间比S1长。一定时间后，S1的色谱带就会展现在S2的色谱带之前。因此，用色谱法就会实现S1和S2的组分分离。根
15、据其分离原理，有吸附色谱、分配色谱、离子交换色谱与排阻色谱等方法。吸附色谱是利用吸附剂对被分离物质的吸附能力不同，用溶剂或气体洗脱，以使组分分离。常用的吸附剂有氧化铝、硅胶、聚酰胺等有吸附活性的物质。分配色谱是利用溶液中被分离物质在两相中分配系数不同，以使组分分离。其中一相为液体，涂布或使之键合在固体载体上，称固定相；另一相为液体或气体，称流动相。常用的载体有硅胶、硅藻土、硅镁型吸附剂与纤维素粉等。离子交换色谱是利用被分离物质在离子交换树脂上的离子交换势不同而使组分分离。常用的有不同强度的阳、阴离子交换树脂，流动相一般为水或含有机溶剂的缓冲液。排阻色谱又称凝胶色谱或凝胶渗透色谱，是利用被分离物
16、质分子量大小的不同和在填料上渗透程度的不同，以使组分分离。常用的填料有分子筛、葡聚糖凝胶、微孔聚合物、微孔硅胶或玻璃珠等，可根据载体和试样的性质，选用水或有机溶剂为流动相。色谱法的分离方法，按产生分离过程的相系统来分有柱色谱法（column chromatography, CC, 在柱子中进行）、纸色谱法（paper chromatography, PC, 在纸上进行）、薄层色谱法（thin layer chromatography, TLC, 在薄板或薄膜上进行）、毛细管色谱法（capillary tube chromatography, CTC, 在毛细管中行）。按流动相分类的现代色谱法有
17、气相色谱法、高效液相色谱法。色谱所用溶剂应与试样不起化学反应，并应用纯度较高的溶剂。色谱时的温度，除气相色谱法或另有规定外，均系指在室温下操作。分离后各成分的检出，通常采用各单体中规定的方法。通常用柱色谱、纸色谱或薄层色谱分离有色物质时，可根据其色带进行区分，对有些无色物质，可在245-365nm的紫外灯下检测。纸色谱或薄层色谱也可喷显色剂使之显色。薄层色谱还可用加有荧光物质的薄层硅胶，采用荧光熄灭法检测。用纸色谱进行定量测定时，可将色谱斑点部分剪下或挖取，用溶剂溶出该成分，再用分光光度法或比色法测定，也可用色谱扫描仪直接在纸或薄层板上测出，也可用色谱扫描仪直接以纸或薄层板上测出。柱色谱、气相
18、色谱和高效液相色谱可用接于色谱柱出口处的各种检测器检测 刘虎威，色谱分析方法及应用，北京：科学出版社，1973，5660。色谱技术在研究天然有机化合物中有着广泛应用。动物、植物、微生物及其代谢产物中的某种化学成分是天然药物和天然食品添加剂的重要来源。由于有些有用的成分往往含量较低，并与许多其他化学成分并存，其提取分离是一项非常繁琐而艰巨的工作。溶剂提取分离技术是天然产物提取分离的经典技术，但溶剂耗量大，分离效率低，环境污染严重，操作安全性差，因此一般仅用于实验室小量样品的制备，而不适用于大批量的工业生产。无论是天然药用植物或动物，在我国有着种类多、分布广的优势。对它们的组分结构与生理活性关系的
19、研究以及对天然物质的综合利用是当今极具潜力的研究课题，并要求对自然资源的研究与开发向深入化、快速化、微量化方向发展，以获取安全无毒高效的天然有效成分服务于人类，色谱技术正符合这种要求，并在以下几个方面得到广泛应用。（1）分离混合物 在天然物提取的有效部位中，往往含有结构相似、理化性质相近的几种成分的混合物用一般的化学方法很难分离，可用色谱分离方法将它们分离纯化。（2）精制化合物 在提取、分离得到有效成分时，往往含有少量结构类似的杂质不易除去，也可利用柱色谱除去杂质得到纯品。（3）鉴定化合物 在一定条件下，纯的有机化合物在薄层色谱或纸色谱中都有一定的比移值，在气相色谱和高效液相色谱中都有一定的保
20、留时间。所以，利用色谱法可以鉴定化合物的纯度，或利用标准品的对照来初步确定两种性质相似的化合物是否为同一物质1。色谱技术的发展与应用，对于各类有机物化学成分的分离鉴定工作起着重大的推动作用，如中药丹参的化学成分在20世纪30年代从中分离到3种脂溶性成分，分别称为丹参酮1、2、3，但后来经进一步研究，发现除丹参酮1为纯品外，2、3均为混合结晶，并通过各种色谱方法，迄今已发现15种单体化合物，其中有4种为我国首次发现 彭琛，郑忠辉，杜希萍，黄耀坚，宋思扬，苏文金，培养基对海藻真菌PT2菌株的生长及活性代谢产物合成的影响，台湾海峡，2005，24（1）：9096。高速逆流色谱 (high speed
21、 countercurrent chromatography, 简称HSCCC) 是一种快速、高效、连续的液-液色谱分离技术，在中药、生化、保健食品、天然产物化学、环境分析等领域有着广泛的应用，尤其是逆流色谱在食品功能成分分离纯化领域，对分离银杏、芦荟、红曲、甘草中的功能成分 毛立新，刘成，杨晓兰，高速逆流色谱在保健食品功能成分纯化中的应用，食品科学，2007，28（2）：372374。迎春花花甘、涩、平，清热利尿、解毒，治疗发热头痛、小便热痛和下肢溃疡等，我们首次在国内报道用气相色谱一质谱联用法(GCMS)分析迎春花叶挥发油的化学成分，并测定各化合物在其挥发油中的相对百分含量 汤洪波，周欣，
22、李章万，王道平，彭炳先，雷培海，迎春花叶挥发油的化学成分，华西药学杂志，2005，20（4）：308309。目前随着色谱理论和电子学、光学、计算机等技术的综合应用，新的色谱技术也在不断出现和发展。此外，色谱技术在精细化工和高分子材料领域中的应用。1.1.2 几种应用广泛的色谱分析技术A 柱色谱柱色谱是将待分离混合物均匀的加在装有固定向的柱子（玻璃或金属制成）中，再加适当的溶剂（称洗脱剂）冲洗，由于固定相和移动相对各组分的亲和力不同，试样中各组分在两相中的分配不同，在柱中随流动相移动的速度不同，对固定相亲和力最弱的组分随洗脱剂首先流出，通过分段定量收集洗脱液而使各组分得到分离，在色谱法中常把那种
23、起分离作用的柱管称为色谱柱，在柱内进行的这种色谱分离法称为柱色谱法。所有柱色谱（包括气相色谱和液相色谱）都可以用分离系数来描述。如果某一组分在固定相中的浓度表示为Cn，在流动相中的浓度表示为Cm，则分配系数可表示为。试样中各组分在流动相中的移动速度与分配系数成反比，分配系数大的组分在固定相中分配得多，而移动速度慢，反之则移动速度快。如果两组分的分配系数一致，就不能分离。因此可以说，柱色谱是基于试样中各组分在两相中的分配系数不同来达到分离目的的。A+B混合物ABABABA图1-2 柱色谱分离过程示意图柱色谱的分离过程如图，进样点之后，随着时间的推移，组分浓度在不断变化。当组分的浓度达到极大时，曲
24、线上即出现峰，称为该组分的色谱峰。每个组分在流出曲线上都有一个相应的峰。从进样开始到出现每组分浓度极大值所需要的时间称为保留时间，以tr表示。图中非滞留部分的保留时间为t，称为死时间。扣除死时间的保留时间称为调整保留时间，以tr表示。由图可知，组分不同，其保留时间也不同，所以保留时间是组分的定性依据；峰面积大小与组分浓度呈一定的函数关系，所以峰面积是组分浓度的定量依据1。柱色谱的分离效果可进一步通过高效液相色谱或气相色谱作仪器分析，称色谱分析法。色谱图是柱色谱分离效果的主要技术资料数据，它可以提供下列重要信息。（1）可以指明样品的组成情况和提供混合物试样中的最少组分数。如果试样各组分在色谱条件
25、下能彼此分离，并都能对检测有响应的话，那么色谱图中的峰数即为试样中峰组分数。（2）说明色谱柱的分离情况。从色谱图中不仅可以直接看出组分是否定量分离，而且还可以根据它计算色谱柱选择性和分离度。（3）提供单组分的定性依据色谱峰数据（如保留时间）及定量依据峰面积和峰高1。吸附柱色谱法可用于染料木素与染料木素-4-葡萄糖苷的分离。例如槐白皮（sophora japonical）的酒精提取物，以酸水解后析出沉淀物，该沉淀物依次以乙醚、甲醇提取。取甲醇提取物28g，以甲醇溶解，拌入聚酰胺粉（60g），减压抽干，磨细。加在预先以水为溶剂填装的（5.359）cm的聚酰胺柱顶。依次以水、30%乙醇、50%乙醇洗
26、脱，每种溶剂洗至有很少物质洗下时改换下种洗脱溶剂。在30%乙醇洗脱的各流分中，析出白色针晶，以二甲基甲酰胺重结晶，产物熔点257，经鉴定为染料木素-4-葡萄糖苷（genistein-4-glucoside,sophricoside）。50%乙醇洗脱的前几个流分，析出黄色针晶，以甲醇-水混合液纯结晶，熔点294296，经鉴定为染料木素（genistein） Bull A. T., Ward A. C., Goodfellow M.; Search and discovery strategies for biotechnology: the paradigm shift. Microbiol.
27、Mol. Biol. Rev., 2000, 64: 573606. 。B 薄层色谱薄层色谱（thin layer chromatography）又称薄层层析，出现在20世纪40年代，1938年N. A. lzmailor和M. S. Schraiber首次在显微镜载玻片上涂布氧化铝薄层，用微量圆环技术分离了多种植物酊剂中的成分，从此开始了薄层色谱的应用，形成了应用广泛的薄层色谱法。薄层色谱是一种液相色谱，通常是将固定相均匀的涂在玻璃、金属或塑料等表面上，形成薄层，试样点在薄层的一端，流动相借毛细作用流经固定相，使被分离的物质保留在固定相上。根据薄层色谱法所依据的分离原理可以把薄层色谱法分为吸
28、附薄层色谱、分配薄层色谱、离子交换薄层色谱和分子排阻薄层色谱等，其中最常见的薄层色谱是以吸附剂为固定相的吸附薄层色谱，其分离原理与吸附薄层色谱的分离原理基本一致 张震南，薄层色谱ABC，云南化工，1995，1：4651。薄层色谱方法鉴别物质具有专属性强、灵敏、可靠等优点，可作为双料喉风散的质量控制方法。在不同温度条件下，利用薄层色谱法对双料喉风散中甘草、山豆根、黄连、青黛、人工牛黄等药材进行定性鉴别，研究发现在最适的温度条件下，各色谱斑点清晰，分离效果好，阴性对照无干扰 谢贺，苏健裕，李冰，李琳，唐昭，温叶明，双料喉风散的薄层色谱分析，中华中医药杂志，2011，1(1)：190192。黄酮类化
29、合物属植物多酚化合物，是植物次生代谢产物，该类化合物在医药、食品及化工方面有着重要的研究价值，已报道其有抗氧化性、抗炎抗菌、抑制血小板凝集及肥大细胞组胺释放等作用，在癌症及心脏病等疾患上也显示出治疗潜力，对其的提取具有重要的医疗意义。黄酮类化合物的来源主要有天然提取 赵熙，粟本文，郑红发，黄怀生，袁英芳，响应面法优化超声波辅助提取绿茶总黄酮工艺的研究茶叶科学，2010，4：917924和人工合成 李月鹏，顾军，李灵芝，7-羟基黄酮衍生物的合成，合成化学，2011，2：8487两种。其中天然提取的药物因副作用小而引起了人们更大的研究兴趣。随着植物源化合物的研究，色谱技术日益成为天然产物中生物活性
30、成分分离纯化及分析的主要手段，薄层色谱技术以其快速、简便、准确度高等优点是现代实验室不可或缺的分析手段，在黄酮类化合物的研究中被广泛应用 唐丽娟，刘玮炜，史大华，赵跃强，陶传洲，薄层层析在植物黄酮类化合物研究中的应用，时珍国医国药，2009，20(12)：29172918。C 高效液相色谱法在液相色谱中，采用颗粒十分细的高效固定相，并采用高压泵输送流动相，全部工作通过一起来完成，这种使用新的仪器对有机物进行分离分析的方法称为高效液相色谱法（high performance liquid chromatography, HPLC）。该技术是在20世纪60年代中期吸收了普通液相色谱和气象色谱的优点
31、，经过适当改进发展起来的。现在HPLC几乎能分析所有的有机物、高分子及生物试样，在目前已知的有机化合物中，若事先不进行化学改性，只有20%的化合物用气相色谱可以得到较好的分离，而80%的有机化合物则需HPLC分析。目前，HPLC在有机化学、生化、医学、药物临床、化工、食品卫生、环保监测、商检和法检等方面都有较好的用途 Tadamasa Hattori, Kyoko Adachi, and Yoshikazu Shizuri, New ceramide from marine sponge Haliclona koremella and related compounds as antifoul
32、ding substances against macroalgae, J. Nat. prod., 1998, 61:823826。高效液相色谱仪主要是由高压泵、进样器、色谱柱、检测器、温度控制器、记录仪、数据处理装置等部分组成，其中最关键的是高压泵、色谱柱和检测器三部分。高压泵主要的作用是使流动相以稳定的流速流经色谱柱。色谱柱是HPLC的心脏，稳定的、高性能的色谱柱是建立耐用、重现性好的方法的根本。影响色谱柱质量的主要因素有柱填料、柱形状和装柱质量等。HPLC的流出物采用在线检测技术，当组分从柱内流出是溶液的浓度变化可通过检测器转化为光学或电学信号而被检出。常用的检测器有紫外吸收检测器、折
33、光指数检测器、荧光检测器。电化学检测器、质谱检测器。黄酮类化合物是具有重要药理活性和生理活性的一类物质，是中草药的有效成分，也是食品中的主要天然抗氧化剂和色素添加剂。运用高效液相色谱配合紫外检测器、光电二极管阵列检测器和质谱检测器的多种分析方法可对黄酮类中大量存在，具有代表性的黄酮、黄酮醇和双氢黄酮等类进行定性和定量分析 陈娟，师彦平，天然产物皂苷类化合物的高效液相色谱分析.药物分析杂志，2005，25(1)：123126。姜黄属姜科植物，其根茎中的主要活性物质为姜黄素，脱甲氧基姜黄素，双脱甲氧基姜黄素，它们都具有多种功能的药用价值和保健作用。吴志伟等采用高效液相色谱法测定其中8种主要成分的含
34、量，不仅操作简单，而且数据精确，不受工艺条件的影响，均能得到满意的结果 周如梅，高效液相色谱及其应用，企业技术开发，2005，24(6)：3638。高效液相色谱是植物化学研究中的一项常规分析技术，已被广泛应用于天然产物的分析、分离包括制备性分离、纯化，以及检测化合物的纯等多方面。在过去的20年里，与这一高效分离技联用技术的发展导致一些重要分析技术/分析仪器，如LC/UV-DAD Huber L., et al. Diode array detetion in HPLC. New York; Marcel Dekker, 1993 、LC-MS Niessen W. M. A. Liquid C
35、hromatography-Mass spectrometry. 2nd ed. New York; Marcel Dekker, 1999和最近LC-NMR Spraul M., et al.; Liquid Chromatography coupled with high field proton nuclear magnetic resonance spectroscopy: Current status and future prospects. Anal. Proc.,1993, 30: 390技术的出现。通过HPLC与上述不同的光检测器的结合使用，使得在对一个复杂混合物经HPLC分
36、离的同时可记录每个液相峰完整的在线光学数据。如前所述，植物粗提取物是一个非常复杂的混合物，其所含化合物可达数百种之多。对其中每一个成分进行分离、纯化及结构鉴定是一项既耗钱又耗力的工作。液相色谱/光谱（紫外、质谱及核磁共振）联用新技术主要就是针对这种情形，为了节约时间、经费和无谓的重复性劳动而出现的。目前，在发达国家这一新技术已被广泛地应用于植物粗提物有效成分的快速筛选分析研究中，大大加快了天然有效成分的研究速度和发现新化合物、先导化合物的几率 组分海洋真菌提取物纯化合物药理研究在线光谱分析LC/UVLC/MSLC/NMR生物活性生物活性结构鉴定化学合成结构修饰生物活性常规光谱分析UVMSNMR
37、IR图1- 3 新药先导化合物的研究过程海洋真菌代谢产物是新化合物及新药先导物的重要来源，也是新药开发的重要资源。要从真菌中获得有开发应用前景的新药先导化合物需要真菌学、生药学、药理学、化学、毒理学等多学科的相互配合。其研究过程可用下图示 郭跃伟，液相色谱/光谱(紫外质谱及核磁共振)联用技术在中草药有效成分研究中的应用关，天然产物研究与开发，2003，15(1)：456457。1.2 色谱分析与海洋药物的提取随着分离科学与技术的进步，色谱提取分离技术在天然产物提取分离中的应用日渐增加。而海洋药物是天然药物的重要来源，主要包括海洋动物药、海洋植物药和海洋矿物药。海洋天然产物的筛选目标主要是针对严
38、重危害人类健康的癌症、心脑血管疾病、病毒感染(HIV等)及其它疑难杂症。迄今人们已涉猎世界各大洋和海区的浅海、近海和岛礁附近的海洋生物达22门，1822属和3018种，近几十年来全世界已从海洋动、植物及微生物中分离得到15000多个新颖化合物。世界报道较多的海洋生物活性物质包括海绵、海鞘、软珊瑚、软体动物、苔藓虫、棘皮动物、海藻、微藻、细菌、真菌等，热带和温带海洋生物一直是研究的重点。国外海洋药物研究的主要生物类型有：(1)海藻：如昆布、海人草、石花菜、螺旋藻、羊栖菜、鼠尾藻等；(2)软体动物：如牡蛎、蛤蜊等；(3)节肢动物：龙虾等；(4)棘皮动物：如海星、海燕等；(5)脊索动物：如海马、带鱼
39、等；(6)腔肠动物：如珊瑚、海蜇等；(7)微生物：海绵、海鞘。其化学结构主要有糖、多糖、氨基酸、蛋白质、无机盐、皂苷类、甾醇类、生物碱类、萜类、大环内酯类、核苷类等。目前，海洋天然产物主要应用在治疗严重危害人类健康的癌症、心脑血管疾病、病毒感染(HIV等)及其他疑难杂症 李光壁，王昶，刘占广，海洋药物研究进展与展望，盐业与化工， 2009，38(5)：4349。表1-1已发现的海洋药物主要结构及来源 王燕，乔善义，海洋天然产物的药物开发，国际药学研究杂志，2009， 36(4)：307310生物活性作用主要结果类型主要生物来源抗肿瘤类核苷类、酰胺类、聚醚类、萜类、大环内酯类、肽类海绵、海鞘、软
40、珊瑚、柳珊瑚、海兔、苔藓抗心血管类萜类、多糖类、高不饱和脂肪酸类、喹啉酮类、肽类、核苷类海藻、鱼类、海绵、珊瑚抗菌、消炎类多糖类、多肽类、酮类、吲哚类、N-糖苷类、-胡萝卜素类海藻、海绵、海鞘、珊瑚、细菌、真菌镇痛、神经毒素（海洋毒素）氨基酸类、脂肪酸类、生物碱类、皂苷类、萜类、大环内酯类、聚醚类、蛋白质类微藻、鱼类、贝类、棘皮动物第2章 实验部分2.1 菌株的培养条件优化2.1.1 菌株来源实验用的菌株为分离自热带海洋生物（泰国马尾藻）的内生真菌。2.1.2 菌株的分离纯化A 实验材料分离培养基配料：采用琼脂-麦芽浸膏培养基：琼脂15g，麦芽浸膏15g，干海藻粉（与分离材料相同海藻）15g，
41、氯霉素0.2g，海盐24.4g，蒸馏水1L，pH7.47.8，121高压蒸汽灭菌20min。实验仪器：培养皿，无菌培养箱，高压蒸汽灭菌锅。 B 实验方法内生真菌的分离：先用无菌海水清洗海藻表面除去固体附着物，然后将海藻浸入70乙醇中30秒以杀死附着在海藻表面的微生物。将海藻置于无菌玻璃片上切成小块组织，随后将海藻组织块放入培养基平板，将切口与培养基表面接触，同时将表面消毒的完整藻体放入另一培养基平板作为空白对照。25培养5天。从海藻组织块与培养基接触面生长出的真菌菌落即为海藻内生真菌。 内生真菌的纯化：从培养基中挑取海藻周围生长的单一菌落的真菌菌丝体，接种到无菌的琼脂-麦芽浸膏培养基平板中。2
42、5培养5天。纯化后的菌落接入斜面培养，4保存。长期贮存菌种采用石蜡油法4保藏。 选取生长旺盛的菌株作为筛选试验之用。2.1.3 培养条件优化 A 实验材料选取四种碳、氮源及生长因子有明显差别的培养基配料，具体配方如下： 1. PDB培养基：葡萄糖20g/L，酵母粉3g/L，蛋白胨5g/L，味精5g/L，pH6.0，50%陈海水煮土豆（200g/L），蒸馏水定容至1L。 2. H1培养基：山梨醇20g/L，麦芽糖20g/L，味精10g/L，色氨酸0.5g/L，酵母粉3g/L，K2HPO4 0.5g/L，MgSO47H2O 0.3g/L，50%陈海水配制，pH6.5，蒸馏水定容至1L。3. 寡营养
43、培养基（GMPY）：葡萄糖6.7g/L，蛋白胨5g/L，酵母粉3g/L，甘露醇20g/L，自来水配制，pH7.0，蒸馏水定容至1L。4. 大米培养基（RICE）：大米100g/L，蛋白胨0.3g/L，海水130ml。实验仪器：锥形培养瓶、无菌培养箱、高压灭菌锅B 试验方法液体培养基选用摇床动态培养，固体培养基选用静态培养。摇床培养分别在4、6、8、10、12、14天灭菌；固体静态培养在7、10、14、17、21、25、30天灭菌。摇床培养：每瓶约150ml，共6瓶；配置1L溶液。固体静态培养：共7个样品，按照配方配制。于生化培养箱中28光照条件下分别静置培养。2.2 真菌的提取与分离A 实验材
44、料化学溶剂：乙酸乙酯；丙酮；超纯水实验仪器：分液漏斗；烘箱；粉碎器；分析天平B试验方法在真菌静态培养过程中，定期观察真菌在不同培养基、不同光照条件下的生长状况，并拍照记录。发现各菌株在不同光照条件、不同培养基上的生长速度以及生长形貌有所区别，总体来说光照较强的菌株生长较快、真菌颜色较深，寡营养培养基上生长较慢。培养结束后，往瓶中加入约三分之一体积的乙酸乙酯没过菌丝体，静置一周（至少3天）以杀死真菌。然后小心取出菌丝体，菌丝体干燥粉碎后以100mL80%丙酮水提取3次，减压浓缩除去丙酮，剩下水相用乙酸乙酯萃取；发酵液用乙酸乙酯萃取3次，减压浓缩；合并所有乙酸乙酯相，减压蒸干，称重。2.3 真菌代
45、谢产物的分离提纯真菌代谢产物的分离纯化通过柱层析色谱的梯度洗脱来实现。A 实验材料化学溶剂：石油醚；乙酸乙酯；甲醇；二氯甲烷；三氯甲烷（以上为分析纯）。实验仪器：吸附层析柱；锥形瓶；旋转蒸发仪；移液管；研钵B 试验方法拌样：样品用氯仿：甲醇=1:1溶剂彻底溶解，于研钵内加适量100-200目硅胶，将样品均匀的滴在铺平的硅胶表面，并轻轻拌匀，待样品中的溶剂挥发，重复加样、拌匀的过程，直至样品溶液完全与硅胶拌合在一起。装柱：将色谱柱洗净干燥，底部铺一层脱脂棉。将细硅胶与最初使用的洗脱剂混匀，混悬液慢慢加入柱内，同时将下端活塞打开，使洗脱剂慢慢流出，此时淋洗层析柱，将粘附的细硅胶洗下，然后用洗脱溶剂
46、洗脱2-3个柱体积，待洗脱剂液面约高于硅胶液面2时关闭活塞。加样：将拌好的样品均匀地从柱顶装入，并轻轻拍打层析柱使样品平铺在平整的硅胶表面，之后用洗脱剂淋洗内壁，将粘附的样品洗下。梯度洗脱：打开吸附柱上端，将洗脱剂连续不断的慢慢滴加在色谱柱内，同时打开层析柱底部活塞，收集洗脱液。然后将洗脱液使用旋转蒸发仪移去溶剂，并转移至小样品瓶中，称重，贴好标签存放。梯度洗脱液的洗脱能力随极性增大而增加，故洗脱极性由弱增强。洗脱体系为4个梯度：石油醚：乙酸乙酯=50:1，二氯甲烷：甲醇=20:1，二氯甲烷：甲醇=5:1，甲醇，各洗脱200mL。2.4 化学检测2.4.1 薄层层析分析(TLC) A 实验材料
47、实验仪器：玻璃硅胶板、毛细玻璃管、展开槽、紫外灯、扫描仪、电热板；显色剂：茴香醛硫酸显色剂(茴香醛-甲醇-硫酸=5:80:15)；展开剂：展开剂极性约为洗脱剂极性的2倍。B 试验方法将上述提取物溶于有机溶剂中，过滤，毛细管点样于玻璃硅胶板上，于层析缸中展开，在紫外光254nm波长下标出其荧光区域，以茴香醛硫酸显色剂喷雾，以加热板加热显色。记录并扫描层析结果。2.4.2 高效液相色谱分析(HPLC) A 试验材料化学溶剂：色谱甲醇；超纯水实验仪器：Dionex高效液相色谱仪；有机相微滤膜；旋转蒸发仪B 实验方法将菌株在不同培养基条件和不同过洗脱梯度下的粗提物取适量溶于色谱纯甲醇中，使用有机相的微滤膜过滤后进行HPLC分析。所用仪器为Dionex HPLC仪(P680 HPLC蠕动泵，UVD 340U紫外可见发光二极管阵列检测器，C18柱(5m,8.0250mm)；洗脱梯度为：05min，10%甲醇；535min，10%100%甲醇；3545min，100%甲醇；4546 min，100%10%甲醇；4660 min，10%甲醇；进样量为20L；流速为1.0mL/s。 第3章 结果与分析3.1 真菌