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1、摘要 番茄红素是一种重要的天然类胡萝b素，它具有防癌抗癌，提高免疫力，延缓衰老等多种保健功能。近年来，番茄红素作为一种功能性的天然色素，己引起越来越多的关注。本文采用柱层析法对从番茄中提取的番茄红素粗品进行分离纯化。进行了单因素试验，对影响纯化的几个因素（吸附剂、吸附温度、加样浓度、洗脱剂、洗脱温度、吸附容量、吸附速率、洗脱液用量、洗脱速率）进行了研究。单因素试验避免了水平选择的盲目性，缩短了实验时间，结果表明, 最佳分离条件为：吸附剂D101大孔树脂; 常温下吸附, 洗脱; 番茄红素油树脂与丙酮的比例为110; 洗脱剂为丙酮;吸附速率为45滴/min; 洗脱流速为53滴/min。本实验首先用
2、的是静态试验法对吸附剂、吸附温度、洗脱温度、加样浓度、洗脱剂进行了选择，在用层析柱对吸附容量、吸附速率、洗脱液用量、洗脱速率进行了选择，用静态试验法降低了实验操作的难度，提高了实验效率，最后用层析柱消除了静态试验的弊端，保证了实验的可靠性，最后在用确定的各因素的最佳条件用层析柱对番茄红素粗品进行纯化。本研究得出的番茄红素提取方法操作简单, 成本较低, 得率较高, 适宜大规模生产, 可望有一定经济效益。关键词：番茄红素 纯化 柱层析 大孔树脂 ABSTRACTLycopene is an important natural carotenoids，it has the function ofva
3、rious health cares，such as resisting cancer，increasing the immunity anddeferring decrepitude etcAs a potential functional natural colorant，moreand more people pay attention to it.Separation and purification of lycopene by column chromatogram were studied. The results indicated that the optimum condi
4、tions of column chromatogram that absorbent: D101peucine, adsorption and desorption at normal temperature,ratio of Lycopene oleoresin and acetone=110, desorption solvent: Acetone , the flow rate on adsorption: 3.5mLmin- 1. The analytic result of HPLC indicated that the HPLC chart of the solution aft
5、er chromatogram and the standard lycopene solution were resemblant. It expressed that column chromatogram could separate and purify lycopene.KEY WORDS:lycopene lycopene oleoresin columniation layer analyse D101peucine 目录前言1第1章 绪论31.1番茄红素的结构、性质及功能31.1.1番茄红素的分子结构31.1.2番茄红素的理化性质31.1.3番茄红素的功能51.2番茄红素的稳定
6、性51.3番茄红素在自然界的分布71.4番茄红素的研究状况71.4.1国外现状71.4.2国内现状81.5番茄红素的生产方法91.5.1 直接粉碎法91.5.2 浸提法91.5.3 酶反应法101.5.4 超临界流体萃取法101.5.5 酶促法111.5.6 化学合成法111.6本论文的立题意义及研究内容11第2章 实验材料与实验方法122.1实验仪器和试剂122.2 番茄红素粗提物的制备132.3 吸附剂的预处理142.3.1 D101大孔吸附树脂的预处理142.3.2 AB-8大孔吸附树脂的预处理142.3.3 氧化铝的预处理142.3.4 硅胶的预处理142.4 试验方法142.4.1
7、静态实验吸附剂的选择142.4.2静态试验吸附温度的选择142.4.3 加样浓度的确定142.4.4 静态试验洗脱剂的选择152.4.5静态试验洗脱温度的选择152.4.6洗脱剂的选择152.4.7 吸附容量的选择152.4.8 吸附速率的选择152.4.9 洗脱液用量的选择152.4.10洗脱速率的选择16第3章 实验结果与讨论163.1 吸附剂的选择163.2 吸附温度的选择173.3 加样浓度的确定183.4 静态试验洗脱剂的选择193.5 静态试验洗脱温度的选择203.6 洗脱剂的选择213.7 吸附容量的选择223.8 吸附速率的选择233.9 洗脱液用量的选择253.10 洗脱速率
8、的选择26第4章 结论28参考文献29致谢32论文前言随着生活水平的日益提高，人们越来越关注自身的健康，希望通过饮食或医疗等手段来达到抵抗疾病、年益寿的目的。衰老和抗衰老也就成了食品科学、营养科学研究的焦点，英国Harman的自由基学说认为活性氧自由基攻击生命大分子，导致蛋白质损伤、酶失活、膜脂过氧化、碳水化合物和核酸损伤是引起机体衰老的根本原因，也是诱发肿瘤等恶性疾病的重要原因。细胞在正常的代谢过程中或者受到高能辐射，以及由于高压氧、药物(抗癌剂等)、香烟烟雾和光化学空气污染物等作用，都会刺激产生活性氧自由基。天然植物中存在众多消除活性氧自由基的抗氧化类功能因子，从天然植物中提取生理活性成分
9、作为功能因子，研制、开发和生产保健食品已被认为是世界上最有前途的朝阳产业。美国九十年代初就投入大量资金研究利用植物提取物开发短期防癌食品，德国利用天然植物中有限成分来预防人类的某些疾病，如从胡萝卜、草莓中提取花青素来保护眼睛，从银杏中提取类黄酮和类脂来预防老年性痴呆等，其终端产品年销量达80亿美元，而番茄红素就是具有这样功能的天然活性物质。现代生活中, 色素作为一种着色剂, 已被广泛应用于食品, 化妆品等与人体健康密切相关的行业。天然植物色素与人工合成色素相比, 原料来源充足, 对人体无毒副作用, 日益受到人们的重视, 有着广阔的发展前景。因此, 研究番茄中番茄红素的提取与纯化的工艺条件具有重
10、要的现实意义。番茄红素是一种脂溶性天然色素, 1903 年Schunck 发现番茄中的红色素的吸收光谱与胡萝卜素不同, 将这种红色素命名为番茄红素( Lycopene) 。1910 年Willstaller 和Escher 在对番茄红素的研究中指出, 番茄红素是胡萝卜素的异构体, 并首次确定了其分子式为C40H56, 分子量为536.85。番茄红素为番茄及其产品提供了鲜亮的红色, 同时, 具有抗氧化作用, 能抗癌抑癌。近年来, 在世界番茄红素开发热潮中, 我国科技界也开始重视和加强番茄红素的研究开发工作, 并取得了一定进展。但总体来说, 我国番茄红素的生产和研究尚处于起步阶段, 与国外相比差距
11、还很大, 至今国内市场番茄红素的生产和应用尚属空白, 没有真正意义上的番茄红素产品。本文根据番茄红素的结构及特性, 探索柱色谱法分离纯化番茄红素的工艺条件, 建立番茄红素提取制备的新方法。本文以番茄红素的纯化工艺研究为主，主要采用柱色谱法纯化番茄红素，在论文的第一章主要介绍了番茄红素的理化性质以及一些生物活性，还有一些从番茄粗提物中纯化番茄红素的研究方法及现状；第二章主要介绍了利用柱色谱法纯化番茄红素的实验预备，粗品的提取以及粗品处理的方法和试验用到的仪器及实验材料与试剂和柱色谱纯化番茄红素的工艺过程；第三章对实验数据进行了处理；第四章对本论文做了简单的总结。第1章 绪论1.1番茄红素的结构、
12、性质及功能1.1.1番茄红素的分子结构番茄红素是一种脂溶性天然色素,是开链式的不饱和类胡萝卜素， 1903 年Schunck 发现番茄中的红色素的吸收光谱与胡萝卜素不同, 将这种红色素命名为番茄红素( Lycopene) 。1910 年Willstaller 和Escher 在对番茄红素的研究中指出, 番茄红素是胡萝卜素的异构体, 并首次确定了其分子式为C40H56, 分子量为536.85。几乎所有来源于天然植物中的番茄红素都是反构型的，此构型最耐热，最稳定。下图为番茄红素的结构式。图1-11.1.2番茄红素的理化性质作为脂肪烃，番茄红素不溶于水，难溶于甲醇等有机溶剂，可溶于乙醚、石油醚、己烷
13、、丙酮，易溶于苯、二硫化碳、氯仿等，色泽为红色，熔点174在472nm出有强吸收峰。番茄红素是一种非环状平面直线型碳氢化合物，深红色针状晶体(从二氧化碳和乙醇混合液中的析出物)，熔点为174(全反式），在 472nm处有一强吸收峰。不溶于水， 难溶于甲醇、乙醇，可溶于脂肪、油脂、乙醚、石油醚、正己烷和丙酮，易溶于苯、氯仿、二硫化碳等有机溶剂16。自然界中的番茄红素主要以全反式存在，只有小部分是顺式构型，并以5一顺、9一顺和13一顺型为主。但在加工过程中，植物中的反式构型会向顺式构型转化。动物体内则以顺式构型为主，人血清中的番茄红素含量为 0.61.9mol/mL， 其中顺式构型的5873。番茄
14、红素链上有11个碳 碳共轭双键，每个双键都可能存在2种构型。理论上应有 211(即2048） 种异构体，但由于甲基化引起的位阻作用，大大限制了重排的数目，目前发现的异构体约有72种。顺式异构体与反式异构体在化学和物理性质上有很大差别。顺式构型的颜色弱，熔点低(小于174），消光系数小，极性强，更易溶解，并在紫外一可见光区的短波长处（350365nm）会出现较强的吸收，而全反式的番茄红素无此吸收，通常可用此吸收峰来检验番茄红素中顺式异构体的存在与否。多双键结构使番茄红素的化学性质非常活泼，极不稳定。凡对其他类胡萝卜素可造成降解的物理或化学因素包括光照、温度的升高、降低、与氧接触以及表面活性剂等均
15、可使它降解。番茄红素纯品在日光下12 基本损失殆尽， 紫外光下 3 损失40， 且温度越高降解越快。因此在提取番茄红素时要避免阳光，可在红光或黄光下进行。番茄红素对碱和氧化剂较稳定，酸对番茄红素有破坏作用，且随酸浓度的增加，其稳定性下降。还原剂如 VE、VC及BHT(二丁基羟基甲苯）可延缓其氧化。番茄红素的所有共轭和非共轭双键都在同一平面上，这使它在消除自由基和淬灭单线态氧的反应中为速率最大的一种类胡萝卜素，其淬灭有物理和化学两种方式，并以物理淬灭为主。物理方式是通过把激发态氧的能量传递给番茄红素，产生基态的氧和激发态的三线态番茄红素，再通过三线态番茄红素和周围介质之间相互的分子振动和转动作用
16、, 使能量散发，同时产生基态番茄红素。在这种物理淬灭的循环过程中，番茄红素本身没有发生变化，类似于催化剂的作用。化学灭氧量占总灭氧量的百分率不到0.05，它主要是通过番茄红素分子与氧作用发生分解的方式来完成。有关番茄红素与氧作用的研究发现， 在亚甲基蓝光敏剂的存在下，番茄红素与氧作用裂解为小分子量化合物的短链结构。1.1.3番茄红素的功能番茄红素（Lycopene）是类胡萝卜素的一种，是一种很强的抗氧化剂，具有极强的清除自由基的能力，对防治前列腺癌、肺癌、乳腺癌、子宫癌等有显著效果，还有预防心脑血管疾病、提高免疫力、延缓衰老等功效，有植物黄金之称，被誉为“21世纪保健品的新宠”。它是自然界中最
17、强的抗氧化剂，其抗氧化作用是胡萝卜素的2倍，VE的100倍。在清除人体“万病之源”自由基方面，番茄红素的作用比-胡萝卜素更强大。2003年，美国时代杂志把番茄红素列在“对人类健康贡献最大的食品”之首，番茄红素也因此被称为“植物中的黄金”。目前，番茄红素已在欧美、日本和我国港台地区被广泛接受。对防治前列腺疾病、前列腺癌、肺癌、胃癌、乳癌有奇效，有效抑制癌细胞的扩散和复制，被西方国家称为“植物黄金”，保护细胞DNA免受自由基损害，防止细胞病变、突变、癌变；含强力抗氧化生物活物质，能促使细胞的生长和再生，美容袪皱，延缓衰老，维技皮肤健康。番茄红素是植物中所含的一种天然色素，是迄今为止自然界中被发现的
18、最强抗氧化剂之一。主要存在于茄科植物西红柿的成熟果实中。它是目前自然界中被发现的最强抗氧化剂。科学证明，人体内的单线态氧和氧自由基是侵害人体自身免疫系统的罪魁祸首。番茄红素清除自由基的功效远胜于其他类胡萝卜素和维生素E，其淬灭单线态氧速率常数是维生素E的100倍。它可以有效的防治因衰老，免疫力下降引起的各种疾病。番茄红素的功效：对防治前列腺疾病、前列腺癌、肺癌、胃癌、乳癌有奇效；有效抑制癌细胞的扩散和复制，被西方国家称为“植物黄金”；保护细胞DNA免受自由基损害，防止细胞病变、突变、癌变；含强力抗氧化生物活物质；能促使细胞的生长和再生，美容祛皱，延缓衰老，维技皮肤健康。1.2番茄红素的稳定性
19、番茄红素为番茄及其产品提供了鲜艳的红色，番茄红素同时具有重要的生物学活性，因此，保持其稳定性，减少其在加工和储存中的损失十分必要。番茄红素是多不饱和碳氢化合物，分子中有11个共扼及2个非共扼双键。因此番茄红素的稳定性很差，容易发生顺反异构化和氧化降解。尤其是高纯度番茄红素由于缺少其他物质的保护，极不稳定，容易被氧化破坏。Sharma SK等人研究了番茄浆和种子在不同加工和贮藏环境中番茄红素的降解动力学，认为番茄红素的降解为拟一级反应，表明番茄红素的降解受多种因素的影响，Schierl和Bretzel等的研究报告指出，热处理可使番茄汁中顺式番茄红素显著增加。Stahl和Sies等还发现加热处理可
20、以提高番茄汁中番茄红素被人体的吸收。但有些学者持不同意见Nguyen和Schwartz等研究报道，人体中较高的顺式番茄红素含量与是否食用热处理过的食物无关。Nguyen和Schwartz等人还发现，加工过程中的热处理对番茄制品中番茄红素含量没有很大的影响。番茄红素从反式结构转变为顺式结构时光密度会降低，但顺反异构对番茄红素的总量并没有影响，而目前一般的测定方法还很难区分化学降解和立体异构所引起的差异，加上番茄红素含量的变化受很多因素影响，所以上述研究结果的差异尚难进行统一。孙庆杰、丁霄霖通过对番茄红素稳定性研究认为，K+、Mg2+、Ca2+、Zn2+素的损失较少，番茄红素对光十分敏感，尤其是对
21、口光和紫外光，口光下半天，番茄红素基本损失殆尽，紫外光下三天损失40。番茄红素对酸不稳定，对碱稳定。Simpson等发现，存在于番茄和番茄制品中的番茄红素比较稳定，而离体番茄红素的稳定性较差，可能是由于分离出来的番茄红素失去了细胞成分如水的保护作用的缘故；抽真空和充氮包装可以降低氧化的程度；在分离过程中添加抗氧化剂如BHT，也可减少氧化和异构化。 Sharma SK等人在干燥番茄渣(富含纤维素)的实验中发现，冷冻干燥方式处理后，番茄渣中番茄红素的降解率高于在25和75干燥的样品。但也有学者研究报道冷冻干燥和热灭菌的番茄在常温贮存中番茄红素有较好的稳定性。日本学者利用热风干燥、冷冻干燥以及乙醇脱
22、水来处理样品，发现乙醇脱水的番茄红素得率最高，可达90左右122J.MTLee和BHC hen等通过对隔氧条件下纯品番茄红素的加热和光照模型研究发现，番茄红素的降解在热处理和光照环境中为一级反应。并进一步指出在50时，最初9小时内番茄红素的异构化为主要趋势，在100和150条件下番茄红素的降解为主要趋势，而且番茄红素降解的速率随温度的升高而提高。活化能为610KJmol，在光照环境中番茄红素的异构化为主要趋势。氧、热、光会促使番茄红素的顺反异构化和氧化降解，因此番茄红素的稳定性研究是番茄红素研究领域的一个重要内容，这对于确定番茄红素的提取、储存、加工及分析的环境条件具有重大的实际意义。1.3番
23、茄红素在自然界的分布 近年的研究证实番茄红素分布于番茄、西瓜，南瓜、李、柿，桃、木瓜、芒果、番石榴、葡萄、红莓、云莓、柑橘等的果实和茶的叶片及萝卜、胡萝卜、芜菁、甘蓝等的根部。番茄和番茄制品如番茄酱中的番茄红素，是西方膳食中类胡萝卜素最主要的来源，其它的水果、蔬菜只提供了很少量的来源。人们从番茄获得的番茄红素约占其总摄入量的80以上，番茄红素在番茄中的含量随品种和成熟度的不同而不同。一般来说，加工用番茄中番茄红素的含量是鲜食用番茄的3- 3.5倍，成熟度越高，番茄红素的含量越高。我国新疆产加工用番茄的番茄红素含量很高，番茄中含量为314mg100g以上，番茄皮中含量为20mg100g。Shar
24、maSK等人测定了番茄中各部分番茄红素的含且，结果表明：表皮及番茄水溶部分含72-79的番茄红素。番茄红素的前体物是植物组织中的有色体，随着成熟度的增加，叶绿体向有色体转变，番茄红素的生物合成也随之加快。番茄刚成熟时，果实内a一胡萝卜素和一胡萝卜素的含量达到最大值，完全成熟后番茄红素含量最高，一般为类胡萝卜素总量的64一76。番茄红素也广泛存在于人体的各种器官和组织中。主要分布在人的血液、肾上腺、肝脏、睾丸、前列腺、乳腺、卵巢、子宫、消化道等器官中。其中血液、肾上腺、睾丸、肝脏等含有较多的番茄红素。番茄红素在人体中以顺式构型的形式存在的比例较高。1.4番茄红素的研究状况1.4.1国外现状 在番
25、茄红素生产方面，国外比较典型的生产厂家有以色列的Lycorde NaturalProducts industries Ltd，总部在以色列Negev Destert City ofBeer Shera，该公司组织遗传、农业、工程等多学科专家组成的研究小组，通过杂交育种选育了一种番茄红素含量很高的番茄品种，其含量是其它番茄品种的4.5倍，并以此为原料采用一种非化学的比较传统的方法生产番茄提取物(Tomato estract)，产品的商标为LYCOMATO，目前该种产品己被多家生产营养补充剂的公司采用，如TWin Labs，Weider Nutrion Group，Solgar,Jarrow an
26、d GeneralNutrition Centers。日本也有一种商品番茄红素，番茄红素含量为5O25，为红褐色液体。目前对番茄红素提取物的商业品质通常要求番茄红素含量3。国外番茄制品除传统的番茄酱(Tomato sauce)番茄(Tomatojuice)；现在向功能性生物制品发展，番茄红素主要被运用于如下几个方面。1.4.1.1用于防止紫外线灼伤，保护皮肤的产品上，典型的产品有：ICOMATO Sunscreen factor 8撑125mL主要成分：Lycopene，VA，VE用途：前2030 min使用，防止紫外线(UVA、UVB)灼伤。生产商：Bullivants Natural He
27、ath Products P tyLtd。(澳大利亚)。1.4.1.2 用于预防前列腺产品上，典型产品有：Lycosoy Postrate Protector(60粒胶囊)；Wakunage ofAmerica CO，Ltd(美国)1.4.1.3用于番茄红素功能性产品，典型的产品如：Unique Lycopene(60粒胶囊，Y瓶，10mg)售价2995美元。1.4.1.4用于类胡萝卜素复合产品，主要与a，p一胡萝卜素、叶黄素合用于功能食品。1.4.2国内现状 我国的番茄育种、栽培和采后加工已初步形成规模化，系列化。据不完全统计，我国己有不下几百个栽培品种。它们可分为鲜食型和加工型两类，鲜食型
28、番茄在我国种植广泛，其果实可直接食用。鲜食型番茄的产业链比较短，易为市场反馈调节，发展比较平稳。加工型番茄在我国许多地区也己有大规模的生产。我国西北的新疆地区已有庞大的加工型番茄生产能力，年产超过60万吨。加工型番茄产业己成为该地区经济发展的支柱产业。加工型番茄的果实一般要经过加工才为人们食用，因此加工型番茄的产业链比鲜食型番茄的要长，加工环节的重要性尤为突出，如果按产量算，我国加工型番茄的单产也可达到4吨每亩的水平，总产堪称当今番茄生产的大国。目前，保健食品越来越受到人们的重视，保健食品市场的崛起使得传统的医药行业面临挑战，生病服药的概念正遭受到以预防生病为主概念的冲击。特别是当今人们更加注
29、重天然植物的活性成分对疾病的预防作用，更注重饮食对健康的重要性，番茄红素作为一种非常有前途的抗氧化剂正在不断受到人们的普遍关注，如果科学研究继续进一步支持番茄红素在抗癌、防癌方面的作用，番茄红素将会成为2l世纪营养保健品市场令人瞩目的一员。加工型番茄的果实中含有丰富的类胡萝卜素，主要为番茄红素。因此，在加工番茄的综合开发和利用中，番茄红素的开发和利用可以成为重点。根据加工型番茄的特性，番茄的加工和综合利用的重要内容是其中所含的番茄红素，以加工型番茄为原料生产富含番茄红素的功能食品、保健食品和食品添加剂是加工型番茄的综合开发利用的一条切实可行的途径。虽然我国番茄红素研究与生产尚在起步，但如果在现
30、有番茄品种的基础上，选择高含量的番茄作为原料进行加工，将传统工艺与先进手段结合，相信番茄红素在国内将会很快商品化、规模化。1.5番茄红素的生产方法国内外对番茄红素制备方法和工艺的研究很活跃，新的方法不断出现。目前主要有以下几种：直接粉碎法、浸提法、酶反应法、超临界萃取法，还有化学合成、生物工程等方法。1.5.1 直接粉碎法将番茄皮粉碎，作为着色粉直接添加于食品中。1.5.2 浸提法番茄皮晾干粉碎-着色包装产品番茄红素不溶于水，难溶于甲醇、乙醇，可溶于乙醚、石油醚、己烷、丙酮、易溶于氯仿、二硫化碳、苯等有机溶剂。利用这一性质，可利用亲油性有机溶剂浸提番茄红素。虽然这种方法的应用对象广泛，而且具有
31、良好的回收率，但应用于商业目的时有一些明显的缺点，如：成本较高、萃取试剂的毒性所引起的产品安全性问题、时间长等。1.5.3 酶反应法日本一专利介绍了利用番茄皮自身酶反应来提取番茄红素的方法，在微碱性条件下(pH=759)，使番茄皮中的果胶酶和纤维素酶反应，分解果胶和纤维素，使得番茄红素的蛋白质复合物从细胞中溶出。所得色素为水分散性色素。工艺为：a 番茄打浆粉碎或番茄加工副产物，加碱调整pH759；b 4560加热搅拌5小时左右；c 过滤除去表皮、种子和纤维等残渣，得提取液；d 加酸调整提取液至弱酸性(pH4045)，类胡萝卜素凝聚沉淀、静置，虹吸除去上部浑浊液，得含类胡萝卜素的沉淀；e 沉淀调
32、整pH后真空浓缩，然后加酸或食盐保存。1.5.4 超临界流体萃取法超临界流体萃取是一种处于工业开发阶段的新型食品、化工分离过程。其技术原理是利用超临界流体的溶解能力与其密度的关系，即利用压力和温度对超临界流体溶解能力的影响而进行的。超临界流体萃取法：具有工艺简单、能耗低、萃取剂便宜、无毒、易回收、可低温处理，适于番茄红素等热敏性成分的优点。其在以色列、日本等国应用成熟，安本政光等研究了超临界CO2从番茄皮中提取番茄红素：原料微粉碎或经果胶酶、纤维素酶处理后，提取压力270kgcm2，提取温度40，提取率达95139J。目前超临界萃取技术在我国尚处于起步阶段，无锡轻工业大学的孙庆杰、丁霄霖做了超
33、临界CO2萃取番茄红素的初步研究，对萃取条件如压力、温度、CO2流量、时间做了一定研刭401。国内许多科研机构都在致力于此项课题，但大多数只是停留在实验室阶段，难于形成工业化规模。1.5.5 酶促法目前有研究证明， 除了从番茄皮中提取番茄红素之外，还可以采用藻类和真菌及酵母发酵制备番茄红素。Gavilou等在三孢布拉霉的生长介质中加入工业番茄废水，发现抑制了p胡萝卜素的生产并刺激番茄红素的合成,通过对蜂房芽孢杆菌DC1在6-7klx光照下培养生产番茄红素；在丝状真菌三孢布拉Blakeslea trispora生物合成p胡萝卜素的过程中，通过pH控制环化即可合成番茄红素。日本Kirin公司已成功
34、采用生物工程技术，即通过DNA重组技术改变细胞的代谢系统生产出了番茄红素，并提高了番茄红素的产率。1.5.6 化学合成法合成番茄红素的主要途径可根据应用的基本化学反应分为两种：Wittig合成法和醛一砜合成法。也可根据不同数目碳原子结合的方式可分为：2C15+C10：C20+C20；2C10+C20等。目前采用合成工艺生产番茄红素主要有两个生产商：Roche公司和Bash公司。1.6本论文的立题意义及研究内容 作为功能性天然色素的番茄红素，在医药、食品、化妆品等方面都有着良好的应用前景，它的开发应用将给农业、食品加工业、医药行业、美容业等与之相关的行业带来可观的经济效益，具有广阔的市场前景，所
35、以，本课题以番茄为实验原料，研究柱色谱法分离纯化番茄红素的工艺条件，针对以上对番茄红素研究现状的叙述，拟在以下几个方面对番茄红素进行较为系统的研究：吸附剂的选择；吸附温度的选择；加样浓度的选择；洗脱剂的选择；洗脱温度的选择；吸附流速的选择 ；洗脱速率的选择；洗脱液用量的选择。第2章 实验材料与实验方法2.1实验仪器和试剂表2-1 实验仪器及厂家实验仪器生产厂家JY2002型电子天平上海精密科学仪器有限公司SHZ-D型循环水式真空泵巩义市英裕予华仪器厂R-205型旋转蒸发器上海申顺生物科技有限公司SHZW21420型三用处电热恒温水箱北京泰克仪器有限公司752N型紫外可见光分光光度计上海第三分析
36、仪器厂JY92-20超声波细胞粉碎机宁波新芝生物科技股份有限公司微波炉美的表2-2 实验试剂及厂家试剂及材料生产厂家番茄购于西安市场无水乙醇分析纯，西安化学试剂厂氯仿分析纯，西安化学试剂厂乙醚化学纯，西安化学试剂厂95%乙醇分析纯，西安化学试剂厂丙酮分析纯，西安化学试剂厂正己烷分析纯，西安化学试剂厂石油醚分析纯，西安化学试剂厂蒸馏水实验室自制甲醇分析纯，西安化学试剂厂氧化铝西安化学试剂厂D-101树脂西安化学试剂厂AB-8树脂西安化学试剂厂硅胶（100-200目）西安化学试剂厂2.2 番茄红素粗提物的制备 由于番茄红素的性质，它作为脂肪烃，番茄红素不溶于水，难溶于甲醇等有机溶剂，可溶于乙醚、石
37、油醚、己烷、丙酮，易溶于苯、二硫化碳、氯仿等，色泽为红色，熔点174在472nm出有强吸收峰。而且具有强氧化性，受热易分解，不稳定性。所以在粗提番茄红素时以乙酸乙酯为提取剂，温度为室温，超声辅助提取，提取时间为25min。具体的工艺流程： 番茄清洗切块搅拌破碎称取一定量的番茄酱按1:1的关系加入乙酸乙酯冰域超声25min真空抽滤收集滤液即为番茄红素粗品测粗提液在485nm处的吸光度（粗提工艺为高宁同学提供）2.3 吸附剂的预处理2.3.1 D101大孔吸附树脂的预处理乙醇浸泡24h用乙醇洗至流出液与水1:5不浑浊用水洗至无醇味5%Hcl通过树脂，浸泡2-4h水洗至中性2%NaoH通过树脂，浸泡
38、2-4h水洗至中性备用2.3.2 AB-8大孔吸附树脂的预处理用2倍树脂体积的无水乙醇过柱，用水洗至无醇味备用2.3.3 氧化铝的预处理加蒸馏水煮沸滤去上清液抽干在105烘箱中活化2h,备用2.3.4 硅胶的预处理用浓盐酸浸泡硅胶，然后用蒸馏水洗涤硅胶后进行减压抽滤，不断加蒸馏水冲洗，使得滤液中基本不含氯离子，晾干一周后，在110烘箱中活化2h，备用。2.4 试验方法2.4.1 静态实验吸附剂的选择称取等质量（4g，同下）的吸附剂( 本试验选用100-200目硅胶、氧化铝、D101树脂和AB8树脂作为吸附剂),分别放入烧杯中, 倒入同体积同浓度的粗提液, 使粗提液和吸附剂充分接触，15 min
39、 后, 取出上清液,测其吸光度值。2.4.2静态试验吸附温度的选择 称取一定量的D101大孔吸附树脂,平均分成4份,置于三角瓶中,分别加入同体积同浓度( 以吸光度表示, 下同) 的色素溶液, 分别在25、35、45和55恒温水域箱中24 h,于485nm波长下测定上清液的吸光度值,计算静态吸附率, 选择适宜的吸附温度。2.4.3 加样浓度的确定加样浓度的确定称取10 g D101树脂吸附剂装柱, 用丙酮润湿, 加入不同浓度的样品提取液, 于485nm 波长下测定流出液的吸光度值, 以样品液的吸光度值对单位质量吸附剂的吸附量作图, 选取适宜的加样浓度。吸附量= (A- A0)V/W。（吸光度y=
40、0.097x即浓度-0.022）2.4.4 静态试验洗脱剂的选择称取一定量的层析树脂, 平均分成6份,置于三角瓶中。分别加入同体积同浓度的色素溶液, 室温下搅拌至吸附饱和,倒去上清液, 再分别加入丙酮、氯仿、乙醚、正己烷、甲醇、石油醚各20 mL洗脱番茄红素,室温下搅拌至洗脱达到饱和, 485nm 波长下测定洗脱液的吸光度值,选择适宜的洗脱剂。2.4.5静态试验洗脱温度的选择称取一定量的层析树脂,平均分成3份,置于三角瓶中,分别加入同体积、同浓度的番茄红素溶液, 室温下搅拌至吸附饱和, 倒去上清液, 再各加入同体积的丙酮溶液洗脱色素,分别在25、35、45、和55条件下洗脱。485nm波长下测
41、定上清液的吸光度值,选择适宜的洗脱温度。2.4.6洗脱剂的选择称取一定量的层析树脂，装柱，倒入25ml同浓度的粗提液,待液体流到柱出口处,关闭活塞,使粗提液和吸附剂充分接触。15 min后,打开活塞用甲醇冲洗层析柱后，分别以丙酮、石油醚、丙酮加石油醚（1:1）为洗脱剂，进行洗脱，洗脱液每一毫升（稀释五倍）测一次其吸光度，选择适宜的洗脱剂。2.4.7 吸附容量的选择称取一定量的层析树脂，装柱，逐渐加入番茄粗提液，打开活塞，每一毫升测一次其吸光度，选择合适的吸附容量。2.4.8 吸附速率的选择称取一定量的层析树脂，装柱，分别加入等量的同浓度的番茄粗提液，用活塞控制流速，每一毫升（稀释五倍）测一次其
42、吸光度，选择合适的吸附速率，以提高分离效率。2.4.9 洗脱液用量的选择称取一定量的层析树脂，装柱，倒入等量的同浓度的粗提液,待液体流到柱出口处,关闭活塞,使粗提液和吸附剂充分接触。15 min后,打开活塞用甲醇冲洗层析柱后，逐渐加入丙酮洗脱液，用活塞控制流速，每一毫升（稀释五倍）测一次其吸光度，选择合适的洗脱液用量，以提高分离效率。2.4.10洗脱速率的选择称取一定量的层析树脂，装柱，倒入等量的同浓度的粗提液,待液体流到柱出口处,关闭活塞,使粗提液和吸附剂充分接触。15 min后,打开活塞用甲醇冲洗层柱后，加入等量的丙酮洗脱剂，用活塞控制流速，每一毫升（稀释五倍）测一次其吸光度，选择合适的洗
43、脱速率，以提高分离效率。第3章 实验结果与讨论3.1 吸附剂的选择 硅胶（100-200目）、D101树脂、AB8树脂、氧化铝各称取4g放入锥形瓶中各加入10ml同浓度的番茄红素粗提物15min后测其上清液吸光度实验结果如下图所示：图3-1由实验结果可知，D101树脂的吸附效果最好，所以柱层析时应选D101树脂为吸附剂。3.2 吸附温度的选择等量（4g）称取D101树脂四份放入锥形瓶中各加入10ml同浓度的番茄红素粗提物分别放在25、35、45、55恒温水域中15min测其上清液吸光度实验结果如下图所示：图3-2由实验结果可知在35是吸附效果最好，在低温下色素的吸附量较高, 温度增加反而不利于
44、吸附，由于工业上生产温度控制难以控制，温度影响也不是非常显著，因此, 在生产上可选择常温下吸附。3.3 加样浓度的确定等量（4g）称取D101树脂四份放入锥形瓶中各加入10ml不同浓度（吸光度不同）的番茄红素粗提物室温放置15min测其上清液吸光度实验数据如下表所示：表3-1编号12345吸附前的吸光度0.6450.5240.4060.230.198吸附后的吸光度0.4010.3910.3210.2020.187吸光度与浓度的关系：吸光度y=0.097x-0.022吸附量=（A-A1）V/W吸光度与吸附量的关系：图3-3由实验结果可知浓度越大吸附量越大，但考虑到浓度过大影响料液在层析柱中流动，
45、因此也浓度不宜过大。3.4 静态试验洗脱剂的选择称取六份等量（4g）层析树脂各加入15ml番茄红素粗品室温下静置2h滤去上清液依次加入20ml洗脱液室温下静置2h测其上清液的吸光度（吸附剂都有丙酮、氯仿、乙醚、正己烷、甲醇、石油醚）实验数据如下表所示： 图3-4由上表数据可知氯仿的洗脱效果最好，由于氯仿有剧毒，考虑到安全问题，所以选择丙酮作为洗脱剂。3.5 静态试验洗脱温度的选择称取四份等量（4g）层析树脂各加入15ml番茄红素粗品室温下静置2h滤去上清液依次加入20ml丙酮洗脱液分别在25、35、45、55下的恒温水域中静置2h测其上清液的吸光度实验数据如下图所示：图3-5由上表数据可知在2
46、5时丙酮的洗脱效果最好，因此可在室温下进行洗脱。3.6 洗脱剂的选择称取4gD01树脂装柱倒入等量的同浓度的番茄红素粗品静置15min打开活塞使液体流出用甲醇溶液冲洗层析柱分别加入丙酮、石油醚、丙酮+石油醚（1:1）洗脱测其活塞处洗脱下液体的吸光度（1-10组每一毫升稀释五倍后测一次吸光度，后三组每五毫升测一次吸光度）实验数据如下图所示：图3-6由上表的数据可知丙酮的洗脱效果最好，因此用丙酮作为洗脱剂。3.7 吸附容量的选择称取4gD101树脂依次加入番茄红素粗品打开活塞使液体流出测其活塞处流出液的吸光度（每一毫升接一次稀释五倍后侧其吸光度）实验数据如下表所示：图3-7由上表数据可知，在第五组数据时吸光度突然增大，从第六组开始吸光度增大的缓慢，所以在第五组时树脂的吸附量达到饱和，由于每一毫升测一次吸光度，即吸附量为5ml。3.8 吸附速率的选择称取4gD101树脂依次加入5ml番茄红素粗品打开活塞使液体流出通过控制活塞来控制洗脱速率测其不