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1、载体的定义： 能够承载外源基因，并将其带入受体细胞得以相对稳定维持的DNA分子称为基因载体。,基因工程载体,载体的作用,1）将外源基因带入受体细胞并保持稳定 2）为外源基因提供复制能力或整合能力 3）为外源基因扩增或表达提供必要的条件,克隆载体(cloning vector) 为使插入的外源DNA序列被扩增而特意设计的载体称为克隆载体。 表达载体(expression vector) 为使插入的外源DNA序列可转录翻译成多肽链而特意设计的载体称为表达载体。,载体应具备的条件,1） 至少有一个克隆位点； 2） 至少有一个复制起点； 3） 必须含有标记基因； 4） 安全的：不含有对受体细胞有害的基
2、因；分子量小，拷贝数多，易分离等。,质粒载体（plasmid) 噬菌体载体 柯斯质粒（cosmid) 单链DNA噬菌体M13 动、植物病毒克隆载体 染色体克隆载体,载体种类,质粒载体,质粒载体的一般特征 ： 它是一种裸露的比病毒更简单，有自主复制能力的DNA分子，处于生命与非生命的的界线上。广泛存在于细菌细胞中，在蓝藻、霉菌、酵母甚至真菌细胞中都发现有质粒分子的存在。,特点：能在宿主细胞内独立自主复制；带有某些遗传信息, 会赋予宿主细胞一些遗传性状。,质粒的类型,1 接合型质粒-能自我转移 除自我复制外还带有一套控制细菌配对和质粒接合转移的基因。如：F质粒（F因子） 2非接合型质粒-不能自我转
3、移 符合基因工程的安全要求。比如：R质粒（抗性质粒）；Col质粒,质粒的复制类型,1） 严紧型质粒（stringent plasmid） 2） 松弛型质粒（relaxed plasmid）,质粒载体的构建,天然质粒的局限性： 1）分子量大，拷贝数低； 2）筛选标志不理想； 3）减少限制性内切核酸酶的酶切位点 ； 4）质粒安全性能的改造； 5）改造或增加基因表达的调控序列。,人工质粒的一般特征,a 分子量尽量小 b 载体分子上的基因位置，限制性内切酶的 作用位点甚至核苷酸序列为已知 c 载体易繁殖：松弛型拷贝 d 具选择标记基因 e 应最大限度的具有各种常用限制性内切酶的单一切割位点,阅读框架的
4、选择，防止移码突变,思考题：E. coli beta-D-galactosidase LacZ ： 5-ATG ACC ATG ATT ACG GAT-3- 5-TG GTC TGG TGT CAA AAA TAA -3,噬菌体载体,噬菌体的一般特性 噬菌体是一类细菌病毒（Bacteriophage）的总称，简称phage。由遗传物质核酸和其外壳组成。 结构：蛋白质外壳内包裹着DNA（双链、单链、线性、环状等）。,噬菌体的生活周期,噬菌体载体的分类,1)双链噬菌体载体载体 2)单链噬菌体载体M13,噬菌体的特点,1)长度为48502 bp 2)双链线性DNA； 3)在两端有cos位点，可以环化
5、。,噬菌体载体的构建策略,1) 删除噬菌体的非必需区，留识别位点作克隆位点 2) 在非必须区引进选择标记 3) 突变某些基因，使它成为安全载体 4) 删除或甲基化必须区段上常用的限制酶切点，防止外源基因插入必须区！ 5）不小于36.4kb,柯斯质粒,1978年Collins和Hohn构建一种新型的大肠杆菌克隆载体，命名为cosmid（柯斯质粒）。它是用正常的质粒同噬菌体的cos位点构成。例如，柯斯质粒pHC79系由质粒pBR322和噬菌体的cos位点的一段DNA构成 。,柯斯质粒特点,1）具噬菌体特点 2）具有质粒DNA的特性 3）高容量的克隆能力，用于构建基因组文库 4）具有与同源序列的质粒
6、重组的能力。,柯斯质粒一般长46kb，是可以插入片段的1/10，易出现载体同载体自身连接。 容易错配 柯斯质粒制成的基因文库常常不太稳定，插入的大片段外源DNA有可能通过同宿主基因组交换而致丢失等，所以最常使用的还是噬菌体载体。,柯斯质粒作载体的缺点,病毒克隆载体,构建的基本策略： 消除致病性，保留转导或转染特性 。,常用于植物转化的病毒载体,Ti质粒 35S启动子表达载体,双元表达载体系统,双元载体系统的构建的原理是Ti质粒上的Vir基因可以反式激活TDNA 的转移。 双元表达载体系统主要包括两个部分 :一部分为辅助Ti质粒，这类Ti质粒由于缺失了TDNA 区域，完全丧失了致瘤作用，主要是提
7、供Vir基因功能，激活处于反式位置上的TDNA的转移。 另一部份是微型Ti质粒(Mini-Ti plasmid)，它在TDNA左右边界序列之间提供植株选择标记如NPTII基因以及Lac Z基因等。,含外源基因的质粒可在农杆菌内自主复制并保留下来。 农杆菌侵染植物细胞后，植物的创伤信号启动Ti质粒上 的Vir基因，随后将穿梭质粒的T-DNA切割下来，转移到植物 细胞中。,一般植物表达载体是成套使用的，一个是带有可以供插入 外源表达基因的MCS和筛选标签的融合蛋白（通常是GFP 或Gus）的普通载体。另一个载体就是双元载体（binary-vector）。 先将外源基因插入带有筛选标记的载体，然后将
8、此载体上的35S promoter-expression gene-gfp这段全部切下，然后构件亚克隆，其过程就是将上述的片断插入双元载体的LB和RB之间，其插入方向是可以任意的。然后将带有35S promoter-expression gene-gfp的双元载体转化农杆菌， 在通过农杆菌转染植物，最后可以通过农杆菌特有的ti-DNA 转染机制，将双元载体的LB和RB之间的片段融合进宿主的基因组上。,几乎所有双子叶植物都容易受到土壤农杆菌感染，而产生根瘤。它是一种革兰氏阴性土壤杆菌（A. tumefaciens）。其致瘤特性是由Ti（tumorinducing）质粒介导的。农杆根瘤菌之所以会感
9、染植物根部是因为植物根部损伤部位分泌出酚类物质乙酰丁香酮和羟基乙酰丁香酮，这些酚类物质可以诱导Vir（Virulence region)基因的启动表达，Vir基因的产物将Ti质粒上的一段TDNA单链切下，而位于根瘤染色体上的操纵子基因产物则与单链TDNA结合，形成复合物，转化植物根部细胞。TDNA上有三套基因，其中两套基因分别控制合成植物生长素与分裂素，促使植物创伤组织无限制地生长与分裂，形成冠瘿瘤。第三套基因合成冠瘿碱，冠瘿碱有四种类型：章鱼碱（octopine）、胭脂碱（nopaline）、农杆碱（agropine）、琥珀碱（succinamopine），使农杆菌生长必需的物质。,农杆菌的Ti质粒与T-DNA的整合机制,