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1、目标导航,预习导引,1.会提取和分离血液中的血红蛋白。 2.体验从复杂体系中提取生物大分子的基本过程和方法。 3.能说出色谱法、电泳法等分离生物大分子的原理。,目标导航,预习导引,一,二,三,一、基础知识 蛋白质的各种特性的差异,如分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度、吸附性质和对其他分子的亲和力,等等,可以用来分离不同种类的蛋白质。 1.凝胶色谱法 (1)概念:凝胶色谱法也称做分配色谱法,是根据相对分子质量的大小分离蛋白质的有效方法。 (2)原理:大多数凝胶是由多糖类化合物构成的多孔球体,小球体内部有许多贯穿的通道,当相对分子质量不同的蛋白质通过凝胶时,相对分子质量较小的蛋白质容易
2、进入凝胶内部的通道,路程较长,移动速度较慢;而相对分子质量较大的蛋白质无法进入凝胶内部的通道,只能在凝胶外部移动,路程较短,移动速度较快。相对分子质量不同的蛋白质因此得以分离。,目标导航,预习导引,一,二,三,(3)凝胶材料:多孔性,多糖类化合物,如葡聚糖或琼脂糖。 (4)具体过程,蛋白质混合物上柱;洗脱开始,相对分子质量较小的蛋白质扩散进入凝胶颗粒内;相对分子质量较大的蛋白质则被排阻于凝胶颗粒之外;相对分子质量较小的蛋白质被滞留;相对分子质量较大的蛋白质向下移动;相对分子质量不同的分子完全分开;相对分子质量较大的蛋白质行程较短,已从层析柱中洗脱出来,相对分子质量较小的蛋白质还在行进中。,目标
3、导航,预习导引,一,二,三,2.缓冲溶液 (1)作用:在一定范围内,能够抵制外界的酸和碱对溶液pH的影响,维持pH基本不变。 (2)配制:通常由12种缓冲剂溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的使用比例就可以制得在不同pH范围内使用的缓冲液。 3.电泳 (1)概念:带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程。 (2)原理:许多重要的生物大分子,如多肽、核酸等都具有可解离的基团,在一定pH下,这些基团会带上正电或负电。在电场的作用下,这些带电分子会向着与所带电荷相反的电极移动。电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小、形状的不同,使带电分子产生不同的迁移速度,从而实现样品中各种分子的分
4、离。,目标导航,预习导引,一,二,三,(3)分类:琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳。 在测定蛋白质相对分子质量时通常使用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它所带净电荷的多少以及分子的大小等因素。而在SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳中,SDS能使蛋白质发生完全变性,由几条肽链组成的蛋白质复合体在SDS的作用下会解聚成单条肽链,因此测定的结果只是单条肽链的相对分子质量。同时SDS所带的大量负电荷大大超过了蛋白质分子原有的电荷量,因而掩盖了不同种蛋白质间的电荷差别,使电泳迁移率完全取决于分子的大小。,目标导航,预习导引,一,二,三,二、蛋白质的提取和分离 蛋白质的提取和分
5、离一般分为四步:样品处理、粗分离、纯化和纯度鉴定。 1.样品处理及粗分离 血液由血浆和各种血细胞组成,其中红细胞最多。在红细胞的组成中,除水分以外,约90%是血红蛋白。它由四条肽链组成,包括两条- 肽链和两条- 肽链。其中每条肽链环绕一个亚铁血红素基团,此基团可携带一分子氧或一分子二氧化碳。血红蛋白因含有血红素而呈现红色。,目标导航,预习导引,一,二,三,(1)红细胞的洗涤 目的:去除杂蛋白。 方法:采用低速短时间离心,如500 r/min离心 2 min。 (2)血红蛋白的释放,目标导航,预习导引,一,二,三,(3)分离血红蛋白溶液:将搅拌好的混合液离心后可观察到试管中溶液分为4层(从上往下
6、)。 第1层:无色透明的甲苯层。 第2层:脂溶性物质的沉淀层白色薄层固体。 第3层:血红蛋白的水溶液红色透明液体。 第4层:其他杂质的暗红色沉淀物。 将液体用滤纸过滤,除去脂溶性沉淀层,于分液漏斗中静置片刻后,分出下层的红色透明液体。 (4)透析:取1 mL的血红蛋白溶液装入透析袋中,将其放入盛有300 mL的物质的量浓度为20 mmol/L的磷酸缓冲液中(pH为7.0),透析12 h。 透析袋一般是用硝酸纤维素(又称玻璃纸)制成的,能使小分子自由进出,而将大分子保留在袋内。透析可以去除样品中相对分子质量较小的杂质,或用于更换样品的缓冲液。,目标导航,预习导引,一,二,三,2.纯化凝胶色谱操作
7、 处理后的样品还含有其他种类的蛋白质分子(如呼吸酶等),因此要将杂蛋白与血红蛋白进行分离。 第一步要制作凝胶色谱柱。第二步要装填凝胶色谱柱。因为干的凝胶和用缓冲液平衡好的凝胶的体积差别很大,所以装柱前需要根据色谱柱的内体积计算所需要的凝胶量。在装填凝胶柱时,不能有气泡存在。第三步是样品的加入和洗脱。 3.纯度鉴定SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 判断纯化的蛋白质是否达到要求,需要进行蛋白质纯度的鉴定。鉴定方法中使用最多的是SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。,目标导航,预习导引,一,二,三,三、注意事项 1.红细胞的洗涤 洗涤次数、离心速度与离心时间十分重要。洗涤次数过少,无法除去血浆蛋白;离心速度过高和时
8、间过长会使白细胞等一同沉淀,达不到分离的效果,影响后续血红蛋白的提取纯度。 2.色谱柱填料的处理 商品凝胶是干燥的颗粒,使用前需直接放在洗脱液中膨胀。为了加速膨胀,可以将加入洗脱液的湿凝胶用沸水浴加热,逐渐升温至接近沸腾。这种方法不仅节约时间,还能除去凝胶中可能带有的微生物,排除胶粒内的空气。,目标导航,预习导引,一,二,三,3.凝胶色谱柱的装填 装填凝胶时要尽量紧密,从而降低颗粒之间的空隙。不能有气泡存在,因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序,降低分离效果。洗脱液不能流干,露出凝胶颗粒,否则需重新装填。 4.蛋白质的分离 分离过程中,仔细观察红色区带在洗脱过程中的移动情况。如果色谱柱装填成
9、功、分离操作正确,能清楚地看到红色区带狭窄、平整、均匀一致地随着洗脱液缓慢移动;如果红色区带歪曲、散乱、变宽,说明分离效果不好,与凝胶色谱柱的装填有关。,知识梳理,典例透析,一,二,三,四,一、血红蛋白提取和分离的过程 血红蛋白提取和分离的程序可分为四大步,分别是样品处理、粗分离、纯化和纯度鉴定。首先通过洗涤红细胞、血红蛋白的释放、离心等操作收集到血红蛋白溶液,即样品的处理;再经过透析去除相对分子质量较小的杂质,即样品的粗分离;然后通过凝胶色谱法将相对分子质量较大的杂质蛋白除去,即样品的纯化;最后经聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯度鉴定。 特别提醒不是所有种类的蛋白质的提取和分离都是这样的。蛋白质的来
10、源和性质不同,其分离方法差别很大。 规律总结提取血红蛋白的实验材料要选择哺乳动物的血液,因为其红细胞中无细胞核,结构简单,血红蛋白含量高。而提取DNA的实验材料要选择鸡的红细胞,因为其具有细胞核,含有DNA。,五,知识梳理,典例透析,一,二,三,四,二、缓冲溶液 在一定范围内,能对抗少量外来强酸、强碱或具有稍加稀释不引起溶液pH发生明显变化的作用叫做缓冲作用,具有缓冲作用的溶液叫做缓冲溶液。缓冲溶液通常是由一种或两种化合物(缓冲剂)溶解于水中制得的,调节缓冲剂的使用比例就可制得在不同pH范围内使用的缓冲液。缓冲溶液的作用是维持反应体系的pH基本不变。生物体内的各种生物化学反应过程都是在一定的p
11、H下进行的,受到氢离子浓度的严格调控。为了能够在实验室条件下准确地模拟生物体内的过程,就必须保持体外溶液的pH与体内环境的pH基本一致。 特别提醒透析实验中缓冲液用量要远多于血红蛋白溶液量,这有利于杂质分子充分地向外扩散。,五,知识梳理,典例透析,一,二,三,四,五,三、蛋白质分子在凝胶中的运动情况分析,知识梳理,典例透析,一,二,三,四,五,四、两种电泳方法的比较,知识梳理,典例透析,一,二,三,四,五,特别提醒(1)琼脂糖凝胶电泳操作简单,电泳速度快,样品不需要事先处理;电泳后区带易染色,样品极易洗脱,便于定量测定。 (2)测定蛋白质的相对分子质量常用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,这是因为该
12、方法分离蛋白质完全取决于分子的大小,而与其所带电荷的性质和分子的形状无关。,知识梳理,典例透析,一,二,三,四,五,五、用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质的相对分子质量 使用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质的相对分子质量时,可选用一组已知相对分子质量的标准蛋白同时进行电泳,根据已知相对分子质量的标准蛋白的电泳区带位置,用电泳迁移率和相对分子质量的对数作标准曲线,可以测定未知蛋白质的相对分子质量。 特别提醒SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的成功关键之一是电泳过程中,特别是样品制备过程中蛋白质与SDS的结合程度。 由于用于制备凝胶的丙烯酰胺和双丙烯酰胺具有很强的神经毒性,并且容易被皮肤吸收,因此
13、操作必须在通风橱内或通风处进行。TEMED(四甲基乙二胺)和过硫酸铵对黏膜和上呼吸道组织、眼睛、皮肤等有很大的毒害作用,因此在进行电泳操作时一定要按照实验要求和步骤,在老师的指导下完成。操作时要戴好一次性手套。,知识梳理,典例透析,题型一,题型二,题型三,题型一 凝胶色谱法的原理与操作 【例题1】 利用凝胶色谱法分离蛋白质时,什么样的蛋白质先洗脱出来? ( ) A.相对分子质量较大的 B.溶解度高的 C.相对分子质量较小的 D.所带电荷多的 解析:相对分子质量较小的蛋白质能进入凝胶内部通道,路程较长,移动速度较慢;相对分子质量较大的蛋白质,路程较短,移动速度较快,首先洗脱出来。 答案:A 反思
14、领悟凝胶色谱法是根据相对分子质量的大小分离蛋白质的有效方法。,典例透析,题型一,题型二,题型三,知识梳理,题型二 电泳技术的原理与操作 【例题2】 下列关于电泳的说法,错误的是( ) A.电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程 B.带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动 C.蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它所带净电荷的多少 D.用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质时,蛋白质的电泳迁移率完全取决于分子的大小,典例透析,题型一,题型二,题型三,知识梳理,解析:蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它所带净电荷的多少以及分子的大小等因素。SDS能与各种蛋白质形成蛋白质-SDS复合物
15、,SDS 所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子原有的电荷量,因而掩盖了不同种蛋白质间的电荷差异,使SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳中蛋白质的电泳迁移率完全取决于分子的大小。 答案:C 反思领悟电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小、形状的不同,使带电分子产生不同的迁移速度,从而实现样品中各种分子的分离。,典例透析,题型一,题型二,题型三,知识梳理,题型三 蛋白质的提取和分离 【例题3】 下列有关“血红蛋白提取和分离”的相关叙述,正确的是( ) A.用蒸馏水进行红细胞的洗涤,其目的是去除细胞表面杂蛋白 B.将血红蛋白溶液进行透析,其目的是去除相对分子质量较大的杂质 C.血红蛋白释放时加入有机溶剂,其目的是使血红蛋白溶于有机溶剂 D.分离蛋白质的过程中不断用磷酸缓冲液处理,是为了维持血红蛋白的结构,典例透析,题型一,题型二,题型三,知识梳理,解析:红细胞的洗涤用的是生理盐水,其目的是去除血浆蛋白等杂质,有利于后续步骤的分离纯化;而本实验中蒸馏水的作用是涨破红细胞,使血红蛋白释放。将血红蛋白溶液进行透析,其目的是去除相对分子质量较小的杂质。血红蛋白释放时加入有机溶剂,其目的是溶解细胞膜。分离蛋白质的过程中不断用磷酸缓冲液处理,是为了维持血红蛋白的结构。 答案:D,