禽胚培养检查法.docx

1、禽胚培养检查法病毒培养可用动物接种、禽胚培养和组织培养法。许多感染人和动物的病毒，特别是禽类的病毒都能在禽胚上生长繁殖，因此禽胚培养是常用的病毒分离培养方法之一。用于这些病毒的分离、鉴定、制备抗原、疫苗生产以及研究病毒性质等方面。来自禽类的病毒，均可在鸡胚中繁殖，哺乳动物的病毒如蓝舌病病毒、流感病毒等也可在鸡胚中增殖。目前鸡胚尤其是SPF鸡胚被广泛利用于分离病毒、制造疫苗和抗原等，其来源丰富，操作简便。除病毒外，衣体、立克次氏体也可用鸡胚来培养，衣原体可在鸡胚卵黄囊繁殖，致死鸡胚；部分立克次氏体也可在卵黄囊中繁殖。下面我们来学习一下病毒的鸡胚接种技术。一、实验材料白壳鸡胚、孵化箱、ImL注射器

2、蛋架、新城疫I系和II系弱毒苗等。二、实验准备1 .鸡胚的选择和孵化应选健康无病鸡群的新鲜受精蛋。为便于照蛋观察，以来航鸡蛋或其他白壳蛋为好。用孵卵箱孵化，要特别注意温度、湿度和翻蛋。孵化条件一般选择相对湿度为60%,最低温度36C,一般37.5C。每日翻蛋最少3次，开始可以将鸡胚横放，在接种前2d立放,大头向上，注意鸡胚位置，如胚胎偏在一边易死亡。孵化34d,可用照蛋器在暗室观察。鸡胚发育正常时，可见清晰的血管及活的鸡胚，血管及其主要分枝均明显，呈鲜红色，鸡胚可以活动。未受精和死胚胚体固定在一端不动，看不到血管或血管消散,应剔除。鸡胚的日龄根据接种途径和接种材料而定，卵黄囊接种，用6-8日

3、龄的鸡胚；绒毛尿囊腔接种，用910日龄鸡胚；绒毛尿囊膜接种，用913日龄的鸡胚；血管注射，用1213日龄鸡胚；羊膜腔和脑内注射，用10日龄鸡胚。2 .接种前的准备病毒接种材料的处理怀疑污染细菌的液体材料，加抗生素（青霉素100500国际单位和链霉素100500微克）置室温中Ih或冰箱1224h高速离心取上清液，或经滤器滤过除菌。如为患病动物组织，应剪碎、研磨、离心取上清液，必要时加抗生素处理或滤过。照蛋以铅笔划出气室、胚胎的位置，若要作卵黄囊接种或血管注射，还要划出相应的部位。打孔用碘酊在接种处的蛋壳上消毒，并在该处打孔。三、鸡胚的接种方法鸡胚接种一般用结核菌素注射器注射，注射完后均应用熔化的

4、石蜡将接种孔封闭。1.绒毛尿囊腔内注射取9一10日龄鸡胚，用锥子在酒精灯火焰烧灼消毒后，在气室顶端和气室下沿无血管处各钻一小孔，针头从气室下沿小孔处插入，深L5cm,即已穿过了外壳膜且距胚胎有半指距离，注射量约0.10.2mL。注射后以石蜡封闭小孔，置孵育箱中直立孵育。2 .卵黄囊内注射取68日龄鸡胚，可从气室顶侧接种(针头插入33.5cm),因胚胎及卵黄囊位置已定，也可从侧面钻孔，将针头插入卵黄囊接种。侧面接种不易伤及鸡胚但针头拔出后部分接种液有时会外溢，需用酒精棉球擦去。其余同尿囊腔内注射。3 .绒毛尿囊膜接种人工气室法取10-11日龄鸡胚，先在照蛋灯下检查鸡胚发育状况，划出气室位置,并选

5、择绒尿膜发育区作一“记号”。将胚蛋横卧于蛋座上，绒尿膜发育区“记号”朝上。用碘酒消毒记号处及气室中心部，在气室中心部锥小孔。然后用锥子轻锥记号处蛋壳，约0.5mm深，使其卵壳穿孔而壳膜不破。用洗耳球吸去气室部空气的同时，随即因上面小孔进入空气而绒尿膜陷下形成一个人工气室，天然气室消失。接种时针头与卵壳成直角。自上面小孔直刺破卵膜进入人工气室约3-5mm,注人0.l0.2mL病料，正好在绒尿膜上。接种完毕用熔化石蜡封闭两孔，人工气室向上，横卧于孵化箱中，逐日观察。直接接种法将鸡胚直立于蛋座上，气室向上气室区中央消毒打孔，用针头刺破壳膜，接种时针头先刺入卵壳约0.5cm,将病料滴在气室内的壳膜上(

6、0.10.2mL),再继续刺入约1.01.5cm,拔出针头使病料液即慢慢渗透到气室下面的绒尿膜上，然后用石蜡封孔，放入孵化箱培养。本方法的原理为：壳膜脆，刺破后不能再闭合，而绒尿膜有弹性，当针头拔出后被刺破的小孔立即又闭合。4 .羊膜腔内接种所用鸡胚为10日龄，有两种方法。开窗法从气室处去蛋壳开窗，从窗口用小镜子剥开蛋膜，一手用平头镜子夹住羊膜腔并向上提另一手注射0.050.ImL病料液入腔内，然后封闭人工窗，使蛋直立孵化,此法可靠，但胚胎易受伤而死，而且易污染。盲刺法将鸡胚放在灯光向上照射的蛋座上，将蛋转动使胚胎面向术者。在气室顶部到边缘的半处打一孔，用40mm长的针头垂直插入，约深30mm

7、以上。如己刺入羊膜腔，能使针头拨动胚即可注入病料液0.10.2mL,如针头左右移动时胚胎随着移动，则针头己刺入胚胎，这时应将针头稍稍提起后再注射。拔出针头后石蜡封闭小孔。置孵化箱中培养。四、接种后检查接种后24h内死亡的鸡胚，系由于接种时鸡胚受损或其他原因而死亡，应该弃去，24h后，每天照蛋2次，如发现鸡胚死亡立即放入冰箱，于一定时间内不能致死的鸡胚亦放入冰箱冻死。死亡的鸡胚置冰箱中l2h即可取出收取材料并检查鸡胚病变。五、鸡胚材料的收获收获前应将鸡胚于4放置6h或过夜，使血液凝固以免收获时流出的红细胞与尿囊液或羊水中的病毒发生凝集，影响试验结果。1 .绒毛尿囊膜接种用碘酊消毒人工气室上卵壳，

8、将灭菌小剪刀插入气室内，沿人工气室的界线剪去壳膜,露出绒毛尿囊膜，用无菌镜子轻轻夹起绒毛尿囊膜，用无菌剪刀沿人工气室周围将接种的绒毛尿囊膜全部剪下，置于灭菌的平皿内，观察病变。病变明显的膜，可放入50%甘油保存。2 .尿囊腔接种用碘酊和乙醵消毒气室部位蛋壳，用镒子去除蛋壳和壳膜，撕破绒毛尿囊膜而不破坏羊膜。再用无菌镒子轻轻按住鸡胚，用灭菌吸管吸取尿囊液，装入灭菌容器内，多时可收集到58mL枚鸡胚。收集的液体应清亮，混浊则往往表示有细菌污染，需做无菌检验。如有少量血液混入，可以1500/min的速度离心IOmin,重新收获上清液。3 .卵黄囊接种在收集完绒毛尿囊液和羊水后，用吸管收集卵黄液。所有

9、收集到的材料通过无菌检查后均在一70C贮存备用。4 .羊膜腔接种先按照上述方法收集完绒毛尿囊液后，再用注射器插入羊膜腔内收集羊水，一般可获得ImL/枚鸡胚左右。六、消毒将用过的镜子、剪刀等放入煮沸锅内消毒5min,取出后擦干包好，高压灭菌待用。卵壳、鸡胚等置于消毒液中浸泡过夜，然后弃掉。无菌室内用紫外线灯消毒30min.七、注意事项（1）鸡胚污染即可引起发育鸡胚死亡或影响病毒的培养，故整个操作应在无菌室或超净工作台内完成，做到无菌操作。（2）鸡胚培养是在生的活鸡胚中进行操作，接种后的鸡胚必须带毒发育定时间才有利于病毒的增殖，故必须谨慎操作，以免影响鸡胚的生理活动或引起死亡。（3）培养条件如温度、湿度、翻动等必须适当，并全程保持稳定。（4）病毒液使用前及收获后，必须先做无菌检验，确定无菌后方能使用或保藏。