1、输血科放散试验技术操作规程1、目的：规范实验室工作人员的操作程序，确保实验过程及结果的准确性与可靠性。2、范围：本规程适用于本实验室放散试验操作。3、职责3.1工作人员应对放散试验技术操作熟悉掌握。4、程序4.1 基本原理红细胞上的抗原和血清中的抗体在适合条件下发生凝集或致敏,这种结合是可逆的，如改变某些物理条件，抗体又可从结合的细胞上放散，再以相应的红细胞鉴定放散液内抗体的种类并测定其强度，用以判定原来红细胞上抗原的型别。这种方法常用于ABO亚型的鉴定、全凝集或多凝集红细胞的定型、类B的鉴定以及新生儿溶血病的诊断等。放散试验的方法很多，ABO血型新生儿溶血病的IgG抗A、抗B以及IgM血型抗
2、体以热放散法常用。Rh血型IgG抗体以乙酸放散法常用。4.2 方法步骤4.2.1 热放散法1）试剂与器材:直接抗球蛋白试验（DAT）阳性红细胞，用大量盐水洗涤4-6次。待放散红细胞末次洗涤的盐水上清。2）操作：在大试管中，加等体积洗涤后的压积红细胞和生理盐水，混匀。56,孵育10分钟。孵育期间，定时摇动试管。（900-1000）Xg离心2-3分钟。立即转移上清放散液至一新试管，和红细胞末次洗涤的盐水上清平行试验。3）注意事项：对于冷抗体，红细胞应用冷盐水洗涤，防止结合的抗体在放散前解离。4.2.2 乙醛放散法D操作：取具有相应抗原的抗凝血，离心后吸去血浆，加大量生理盐水，洗涤三次，离心，取压积
3、红细胞备用。将适量的受检者血清和压积红细胞混匀后，放在适当的温度中1小时，在此期间要摇匀1-2次。（800-100O）Xg离心5分钟，将上清液吸出另放1管，鉴定上清液中的抗体，以判断待检血清除被吸收的抗体外，是否还有其他血型抗体。将红细胞用生理盐水洗涤3次，离心压积红细胞。取1体积压积红细胞，加1体积AB型血清（无意外抗体）或生理盐水、2体积乙醛，用力颠倒振摇1分钟，然后以（900-1000）g离心3分钟。离心后即分成3层，最上层是乙醛，中层是红细胞基质，下层是具有抗体的放散液，其色深红。用清洁的吸管吸出放散液。若有混浊，可再离心1次。将放散液放置37。C水浴中10分钟，除尽乙酸。（900-1
4、000）g离心2分钟，取上层深红色放散液鉴定抗体。2）注意事项本试验适用于鉴定Rh抗体。最大优点用于检查获得性溶血性贫血，此类患者的红细胞为直接抗球蛋白试验阳性，说明在体内已有自身抗体吸附在红细胞上。这种抗体常常有Rh特异性。氯仿放散法与乙醛放散法步骤相一致，只是最后的分层结果相反，即具有抗体的放散液在上层，中层是红细胞基质，最下层是氯仿。加入AB浆是对放散下来的抗体起到保护作用，延长抗体的保存时间和活性。4.2.3 磷酸氯唾法当红细胞包被IgG抗体，直接抗球蛋白试验阳性时，例如抗-Fya抗体，血型鉴定会有些困难，不能用酶法或抗球蛋白试验作血型鉴定，这属于方法学错误。使用二磷酸氯唾可以分离红细
5、胞上的IgG抗体，并能同时保持红细胞膜的完整性和抗原的活性。D操作：取0.2ml洗涤压积红细胞加0.8ml二磷酸氯喳溶液，同样处理对照红细胞（用已知抗原的细胞，判定放散效果是否过度）。混匀，置室温孵育30分钟。取1滴红细胞悬液用盐水洗涤4次。用抗IgG检测洗涤红细胞。若与抗IgG不凝集，可洗涤全部处理的红细胞用于试验；若仍与IgG反应，要重复孵育和检测，但总的孵育时间不要超过2小时。2）注意事项此方法不能将蛋白从细胞膜上完全分离，如果细胞被IgG和补体包被，氯喳处理后只能用于测定抗IgG.孵育时间不要超过2小时，延长室温孵育时间或在37。C孵育可能引起溶血或红细胞抗原的丢失。可能发生Rh抗原变
6、性作用，当红细胞孵育后发生溶血或有盐水反应或使用化学修饰的抗Rh试剂时，这种情况最要引起注意。做磷酸氯喳处理的红细胞试验应该使用高蛋白试剂，并做对照。当磷酸氯喳处理的红细胞用于抗原定型，但不是Rh系统时,应该有平行对照试验。例如6%牛白蛋白。此方法不能完全从致敏红细胞上去除抗体，DAT阳性的结果（特别是最初试验DAT阳性，放散后试验结果）可能仅仅是强度减弱而已。另外可用于除去自身抗体,此方法可以从红细胞去除Bg（HLA）相关抗原。4.3 结果判定4.3.1 放散结果视为有效：在任何介质中，3份Al细胞（或B细胞）均与放散液呈阳性反应；对照组呈阴性反应。4.3.2 若平行对照与A细胞（或B细胞）呈阳性反应，而放散液与A细胞（或B细胞）却呈阴性反应，则提示分型试剂未被全部洗掉，仍有残余。或者是结合于弱抗原上的抗体在洗涤过程中被洗脱。433单克隆抗体对pH、浓度的变化较为敏感，不适合用于吸收放散试验。
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