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1、中国药科大学生化实验四 SDS-PAGE测定酪蛋白分子量 吴旭日 实验目的 了解SDS-PAGE垂直板型电泳法的 基本 原理及操作技术。 学习并掌握 SDSPAGE法测定蛋白质相 对分子量 的技术。 SDS-PAGE简介 电泳带电颗粒在电场作用下，向着与其电荷 相反的电极移动的现象。 PAGE 聚丙烯酰胺凝胶（PAG ）是由 单体 丙烯酰 胺(Acr) 和交联剂 甲叉双丙烯酰胺 (Bis) 在加速 剂四甲基乙二胺 (TEMED) 和催化剂 过硫酸铵 (AP) 的作用下 聚合交联而成的三维网状结构的凝胶。 以此凝胶作为支持介质的电泳称为PAGE 。 PAGE 具有电泳和分子筛的双重作用。 C
2、H2=CH C=O NH 2 丙烯酰胺 N, N -甲叉 双丙烯酰胺 CH2=CH C=O NH CH2 NH C=O CH2=CH 聚丙烯酰胺 CH2-CH C=O NH2 CH2-CH C=O NH CH2 NH C=O CH2-CH CH2CH C=O NH2 CH2-CH C=O NH2 CH2-CH CH2-CH CH2-CH C=O NH2 CH2-CH CH2-CH ( )n ( )n ( )m ( )m SDS-PAGE 的特点 (1) 在一定浓度时，凝胶透明，有弹性，机械性能好 ； (2) 化学性能稳定 ，与被分离物不起化学反应，在很多溶剂 中不溶； (3) 对pH和温度变化
3、较稳定 ； (4) 几乎无吸附和电渗作用，只要Acr纯度高，操作条件一 致，则 样品分离重复性好 ； (5) 样品不易扩散，且用量少，其灵敏度可达 10-6g (6) 分辨率高 ，尤其在不连续凝胶电泳中，集浓缩、分子筛 和电荷效应为一体 。因而较醋酸纤维薄膜电泳、琼脂糖 电泳等有更高的分辨率。 SDS-PAGE 的原理 ? PAGE可分为连续系统和不连续系统两大类 。 ? 连续系统： 电泳体系中缓冲液 pH 值及凝胶 浓度相同，带电颗粒在电场作用下，主要靠 电荷和分子筛效应 ? 不连续系统中 带电颗粒在电场中泳动不仅有 电荷效应 、分子筛效应 ，还具有浓缩效应， 因而其分离条带清晰度及分辨率均
4、较佳。 SDS-PAGE 的原理 有许多蛋白质是 由亚基或两条以上 肽链组成的，在 SDS 和巯基乙醇 作用下， 解离成亚基或单条 肽链，因此这一类 蛋白质，测定的只 是亚基或单条肽链 的MW 。 蛋白质分子 结合SDS 阴离子后，所带负电荷的量远远超 过了它原有的净电荷，从而消除了不同种蛋白质之间所 带净电荷的差异。蛋白质的电泳迁移率主要决定于亚基 的相对分子质量。而与其所带电荷的性质无关。 SDS-PAGE 测定MW的原理 ? 当分子量在 15 ，000Da 到200 ，000Da 之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数 呈线性关系 。 lgMW = K bm R MW是蛋白质分子量 ,K为
5、常数 ,b为斜率， mR 是电泳相对迁移率 相对迁移率 m R = 蛋白质样品迁移距离 (cm) 溴酚蓝区带距加样端距离(cm) SDS-PAGE 测定MW的原理 4 4.2 4.4 4.6 4.8 5 5.2 00.10.20.30.40.50.60.70.80.91 图1 标准蛋白质与待测样品电泳图谱 图2 电泳迁移率与 logMW 之间的关系 94 000 62 000 43 000 31 000 20 100 14 400 胶槽 1 23 注：胶槽 1 标准蛋白；胶槽2、3 样品蛋白 将已知分子量的 标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可获得一 条标准曲线 ，未知蛋白质 在相同条件下
6、进行电泳，根据它的电泳迁 移率即可在标准曲线上求得分子量。 SDS-PAGE 电泳过程 浓缩效应 浓缩胶（ 大孔胶 ） 浓缩胶缓冲液 pH6.8 Tris-HCl, 电极缓冲液 pH8.3 Tris-Gly 解离度 ： Cl 蛋 Gly pI Gly =6.0 有效迁移率很小 ?凝胶中 Cl 为快离子，Gly 为 慢离子，蛋白质样品被夹在中 间。快慢离子之间的区域，电 导小、电势陡，慢离子推动样 品在分离胶之前浓缩。 缓冲液 样品 浓缩胶 分离胶 浓缩效应 样品进入浓缩胶有一个堆积 浓缩效应 ( 缓冲液 pH8.3) 蛋白质从“”极向“” 极移动，从浓缩胶进入分离 胶，速度变慢，堆积浓缩。 缓
7、冲液 样品 浓缩胶 分离胶 浓缩效应 样品进入浓缩胶有一个堆积 浓缩效应 ( 缓冲液 pH8.3) 蛋白质从“”极向“” 极移动，从浓缩胶进入分离 胶，速度变慢，堆积浓缩。 缓冲液 样品 浓缩胶 分离胶 浓缩效应 样品进入浓缩胶有一个堆积 浓缩效应 ( 缓冲液 pH8.3) 蛋白质从“”极向“” 极移动，从浓缩胶进入分离 胶，速度变慢，堆积浓缩。 缓冲液 浓缩胶 样品 分离胶 浓缩效应 样品进入浓缩胶有一个堆积 浓缩效应 ( 缓冲液 pH8.3) 蛋白质从“”极向“” 极移动，从浓缩胶进入分离 胶，速度变慢，堆积浓缩。 缓冲液 浓缩胶 样品 分离胶 分子筛效应 蛋白质样品进入分离胶（小孔 胶）
8、后pH增大(pH 8.8 Tris- HC1 )，Gly 解离度增大，不存 在快、慢离子之分，蛋白质样 品在均一电场强度和 pH条件下 泳动。 由于各种蛋白质分子量不同， 因此质点的有效迁移率不同， 形成不同区带。 缓冲液 浓缩胶 分离胶 分子筛效应 分离胶的孔径小，各分子由 于大小和形状不同，所受阻 力不同，表现出不同的泳动 速度，即分子筛作用。分子 量小，形状为球形的泳动速 度最快。 缓冲液 浓缩胶 分离胶 SDS-PAGE 原理中的五个不连续性 1.凝胶层 的不连续性 2.缓冲液离子成分 的不连续性 3. pH值的不连续性 4.电位梯度 的不连续性 SDS-PAGE 实验操作 、搭好制胶
9、台，制作分离胶和浓缩胶 注意 2块玻璃片底部保持水平，凹口（较短的玻璃片） 正对自己，同时搬动两只扣子向外扣紧。如下图所示。 将制胶架（红色部分）卡入制胶台，注意玻璃片底部 要保持平齐，并完全卡入制胶台底部的红色橡胶中。 SDS-PAGE 实验操作 1）分离胶的制备 （按表1配制10% 的分离胶 ） 将制备的分离胶溶液，用滴管加至长、短玻璃板间的 窄缝内，加胶高度距顶部约1cm （约第一道红线处）。用 滴管加一层重蒸水, 用于隔绝空气，使胶面平整。约30 min凝胶完全聚合。将贮槽的蒸馏水倒去。 2、凝胶的制备 注意凝胶时间 约15 min SDS-PAGE 实验操作 2）浓缩胶的制备（ 按表
10、2配制3% 的浓缩胶） 将制备的浓缩胶溶液加到长、短玻璃板的窄缝内，直至短 玻璃上缘，然后插入梳子。静臵20 min左右，浓缩胶即可 聚合，轻轻取出样品槽模板。 2、凝胶的制备 注意凝胶时间 约8 min SDS-PAGE 实验操作 1）标准蛋白质样品的处理 低分子量标准蛋白 : 兔磷酸化酶 B MW=97,400 牛血清白蛋白MW=66,200 鸡卵白蛋白MW=43,000 牛碳酸酐酶MW=31,000 胰蛋白酶抑制剂MW=20,100 鸡蛋清溶菌酶MW=14,400 每管15 l已分装好 ，用微量注射器吸取 15 l 2上样缓冲液 混合， 沸水浴中加热 3-5min后上样。 3、蛋白质样品
11、的处理 SDS-PAGE 实验操作 2）待测样品处理 用微量注射器吸取 15 l 酪蛋白样品于小离 心管内（ ep管），再用微量注射器吸取15 l 2上样缓冲液混合，盖上盖子，在沸 水浴中加热 3 min，取出冷却后加样。 SDS-PAGE 实验操作 5、加样 用移液器分别取20 l 样品液，小心将样品加到凝胶凹 形样品槽底部。并 做好标记 。 4、搭好电泳装置 从制胶台上轻轻取下玻片（含有凝胶）。两块胶配对， 同时安装在电泳架上， 注意凹口向里 ，检查卡紧无误 后，将电泳架装入电泳槽中，并向内槽和外槽分别倒 入电泳缓冲液。 SDS-PAGE 实验操作 浓缩胶 分离胶 SDS-PAGE 实验操
12、作 6、电泳 将电泳仪的正极与红色插头连接，负极与黑色插头连接， 打开电泳仪开关，电压为200V，当溴酚蓝染料距凝胶底 部时，停止电泳，关闭电源。 SDS-PAGE 实验操作 7、染色与脱色 电泳结束后，拆除电泳装置，用塑料铲撬开短玻璃板，从 凝胶板上切下一角作为加样标记。加入染色液染色，60度 水浴加热 15 min，再用脱色液脱色（60度水浴加热 15min）， 直至蛋白质区带清晰，即可计算相对迁移率。 SDS-PAGE 实验操作 8、 结果处理 量出加样端距溴酚蓝染料的距离(cm)以及各蛋白质 样品区带中心与加样端的距离(cm)，按下式计算相对迁 移率m R： 相对迁移率 m R= 蛋白
13、质样品迁移距离 (cm) 溴酚蓝区带距加样端距离(cm) 注意事项 ? 1.新电泳槽价值比较昂贵（2500RMB/ 套），若有 破损应由学生照价进行赔偿（玻璃 10元/块, 金属丝 100元/根）。 ? 2.分离胶和浓缩胶的制备按每班2大组进行 ，按每 班32名同学计算， 4位同学 1组，每班共 8组，2组 （8名）同学公用 1只电泳槽 。16位同学公配一组 分离胶和浓缩胶。 ? 3.Acr和Bis具有神经毒性，请同学们带上一次性手 套完成实验。 搭好制胶台 制作分离胶 制作浓缩胶 加至距顶部 1cm 处，注 入蒸馏水使胶面平整 加好浓缩胶后，及时插 入梳子 制备样品 用微量注射器吸取上样 缓冲液，与样品和 MARKER 混合 保持玻璃片底部平齐， 并紧紧卡入红色橡胶 安装电泳槽装置 凹口向内，注意卡紧， 添加内外槽电泳缓冲液 上样 用微量注射器上样，每 孔15 l，注意排掉气泡 电泳 电压200V 剥胶、染色、脱色 流水冲洗胶片剥离， 60度 水浴条件下染色和脱色 观察、记录结果 思考题 ? 1. 用SDS-凝胶电泳法测定蛋白质分子量时为什 么要用巯基乙醇？ ? 2用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质的分 子量，为什么有时和凝胶层析法所得结果有所不 同？是否所有的蛋白质都能用SDS-凝胶电泳法测 定其分子量？为什么？