原核诱导表达汇总.pdf

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1、1 原核诱导表达的标准操作程序（SOP） 一目的： 使本实验室工作人员了解诱导表达的操作过程，并能实际动手进行原核诱导表达一系 列实验。 二适用范围： 本 SOP 适用于对新基因克隆的表达，并针对新基因产生的可溶性蛋白。 三实验原理： E.coli的乳糖操纵子含Z、 Y 及 A 三个结构基因，分别编码半乳糖苷酶、透酶和 乙酰基转移酶，此外还有一个操纵序列O、一个启动序列P 及一个调节基因I。I 基因 编码一种阻遏蛋白，后者与O 序列结合，使操纵子受阻遏而处于关闭状态。在启动序 列 P 上游还有一个代谢物基因激活蛋白（CAP ）结合位点。由P 序列、 O 序列和CAP 结合位点共同构成lac 操

2、纵子的调控区，三个酶的编码基因即由同一调控区调节，实 现基因产物的协调表达。在没有乳糖存在时，lac 操纵子处于阻遏状态。此时，I 序 列在PI 启动序列操纵下表达的Lac 阻遏蛋白与O 序列结合，阻碍RNA聚合酶与P 序列结合，抑制转录起动。当有乳糖存在时，lac 操纵子即可被诱导。在这个操纵子 体系中，真正的诱导剂并非乳糖本身。乳糖进入细胞，经b半乳糖苷酶催化，转变 为半乳糖。后者作为一种诱导剂分子结合阻遏蛋白，使蛋白构象变化，导致阻遏蛋白 与 O 序列解离、发生转录。异丙基硫代半乳糖苷（IPTG ）是一种作用极强的诱导剂， 不被细菌代谢而十分稳定，因此被实验室广泛应用。 四、试剂准备:

3、（一）实验器材的灭菌： 枪头的灭菌： 1mL ， 200 L， 20 L 的枪头放入枪头盒，用报纸包住（2 层），放入高压灭菌锅 中灭菌，121， 20min 。 80烘箱中烘干，常温放置。 螺口管及离心管的灭菌： 将螺口管和离心管分别放入铝制饭盒中（盖子要拧松，离心管的管盖打开），放 入高压灭菌锅中灭菌，121， 20min 。80烘箱中烘干，常温放置。 50mL 离心管的灭菌： 将 50mL离心管用报纸包住（2 层） ，放入高压灭菌锅中灭菌，121， 20min 。 80烘箱中烘干，常温放置。 （二） LB 培养基的配制 液体 LB 培养基（1L ） ：蛋白胨10g 氯化钠10g 酵母提取

4、物5g 调 PH 值到7.5，高压灭菌，4保 存。 固体 LB 培养基（1L ） ：蛋白胨10g 2 氯化钠10g 酵母提取物5g 琼脂粉15g 高压灭菌，不烫手的情况下加入抗性，抗性：培养基=1：1000（氨苄，卡那通常 浓度），混匀。马上在无菌操作台中倒平板，并开大风吹干。用封口膜封住，倒置放 于 4保存。 （三） 1M IPTG的配制： 经过计算，10g IPTG可以配42ml 的 1M IPTG 。买来的粉末状的IPTG 一般全部 配成 1M IPTG 。 1、无菌操作台紫外线照射，后通风。 2、用少量去离子水将IPTG 溶解完全，并定容。 3、在无菌操作台中，用 0.22 m 的滤器

5、将配好的IPTG 滤入灭菌后的1.5ml 离心管 中，过滤除菌，-20 保存。 注意事项：在用滤器将IPTG 滤入离心管时，先用针头吸IPTG ，然后将枪头拔 掉，排出气体，滤头加入IPTG 液，在使针管与滤器相连，保证整个装置无气体进入。 滤的过程中，手不能碰滤头。 （四） 3 SDS-PAGE loading buffer的配制： 3 SDS-PAGE loading buffer 10ml 1M Tris-Hcl (PH 6.8) 1.5ml SDS 0.6g BPB( 溴酚蓝 ) 30mg 甘油（丙三醇）3ml 去离子水5.5ml 1将除BPB 以外的药品完全溶解。SDS 常温下很难溶

6、解，可以在37水浴溶 解。完全溶解后，再加入BPB ，进行溶解。 2把溶好的buffer 分装到1.5ml 的离心管中，1ml/ 管，常温放置。 3使用前，每管加入30 L 巯基乙醇。 注意事项：巯基乙醇为危险品，加入的过程在通风橱中完成，并且带好手套。 （五） 10 PBS 的配制： 0.1M PBS （ 10 PBS）1L NaH2PO4.2H2O 2.83g Nacl 85g Na2HPO4.12H2O 28.98g 3 用去离子水将以上药品进行溶解。（溶解的非常慢，可能需要过夜） 调 PH 值到 7.2，用 0.4 m 的滤膜过滤。常温保存。 工作时用的是1 PBS。 （六） 1.5M

7、 Tris-Hcl (PH 8.8) 的配制： 1.5M Tris-Hcl 250ml Tris 45.425g 1 用 200ml 去离子水将Tris 溶解。 2用浓盐酸调PH 值到 8.8。 3调好PH 的 Tris-Hcl定容到250ml 。 4 0.4 m 的滤膜过滤，常温保存。 注意事项：Tris 的缓冲能力很强，调PH 值时，费些时间，但不要调过。 （七） 1M Tris-Hcl (PH 6.8) 的配制： 1M Tris-Hcl 250ml Tris 30.275g 1用200ml 去离子水将Tris 溶解。 2用浓盐酸调PH 值到 6.8 3调好PH 的 Tris-Hcl定容到

8、250ml 。 4 0.4 m 的滤膜过滤，常温保存。 （八） 30% 丙烯酰胺的配制： 30%丙烯酰胺250ml 丙烯酰胺 72.5 ml BIS 甲叉丙烯酰胺2.5 ml 1把药品用去离子水溶解后定容到250ml 。 2用滤纸过滤，放在棕色瓶子中，4保存。 注意事项：两种药品有毒性，配制过程要带手套和口罩。 （九） 10%SDS 的配制： 1 1g SDS 加入 10ml 去离子水进行溶解。 2分装到1.5ml 离心管中，-20保存。 （十） 10%过硫酸铵的配制： 1 1g 过硫酸铵加入10ml 去离子水进行溶解。 2分装到1.5ml 离心管中，-20保存。 4 （十一）5 SDS-PA

9、GE 电泳缓冲液的配制： 5 SDS-PAGE 电泳缓冲液1L Tris 15.1g Glycine （甘氨酸）94g SDS 5g 将以上药品用去离子水溶解后定容到1L，常温保存。工作时用的是1 SDS-PAGE 电泳缓冲液。 （十二）考马斯亮蓝R-250 染色液的配制： 考马斯亮蓝R-250 染色液1L 1 往 1g 考马斯亮蓝R-250 中加入 250ml 异丙醇，在磁力搅拌器上搅拌六小时以上。 2 加入 650ml 去离子水，磁力搅拌器搅拌过夜。 3 再加入 100ml 冰醋酸进行溶解，磁力搅拌器搅拌。 4 在通风橱内用滤纸进行过滤。常温保存。染色液只能反复用两次。 注意事项：在磁力搅

10、拌器上搅拌时，要把容器封口。 （十三）脱色液的配制： 脱色液1L 醋酸（冰乙酸）100ml 乙醇（无水乙醇）50ml 去离子水850ml 常温保存。 四实验步骤： （一）：质粒的转化 1使用无菌操作台之前先用75%的酒精擦拭， 然后将灭菌的培养基以及所有要用到的 器具放到超净台上，在开紫外照射30min 左右。操作之前，关掉紫外，打开通风橱，将手 用酒精擦拭后开始操作。 2从 -80 的冰箱中取出表达菌（BL21 ）的感受态细胞（每管100 L） ，在 -80 冰水中融化。 3载体 （ PET32a 等） 与基因片段的连接后质粒1 L，缓慢的加入到100 L BL21 感受态中，冰置15min

11、 。 （无菌操作） 342下热激90s，随后在冰水中冰置5min 。 4涂板：先将涂布棒用酒精棉球擦，然后用酒精灯火焰烧，放置等它凉却。把 处理后的感受态点在含有抗性的固体培养基（氨苄或卡那等）上。用冷却的涂布棒进 行涂布，左手把该盖拿起，小指轻轻转动培养基，右手来涂，涂到培养基表面快干。 （无菌操作） 5放在37培养箱中，倒置培养过夜。 5 注意事项： 1质粒的转化时，质粒是冻在-20 的冰箱中，等它完全化了在进行吸取，往感 受态中加入质粒时，一定要缓慢，因为感受态非常脆弱，防止感受态受伤。 2质粒的转化时，热激的时间90s，一定要控制好时间。 3质粒的转化时，涂布棒在涂布前，一定要晾凉涂布

12、棒。防止感受态被烫死， 或固体培养基的损坏。 （二）：挑菌与接菌： 1无菌操作台紫外线照射，后通风。将转化后的平板取出。 2 在无菌操作台中，把消毒后的螺口管（一般一个基因取四个螺口管，进行平行实验） 取出，在酒精灯的外焰上灼烧螺口管管口。 3 灭菌后的LB 培养基从冰箱中取出，在酒精灯的外焰上烧一下培养基瓶口。吸取 LB 培养基 （一般 5.5mL）加入螺口管中，后加入抗性（氨苄霉素、卡那等） 。氨苄霉素 （卡那）： LB 培养基 =1:1000（5.5 L） ，抗性由载体决定。 4镊子用酒精棉球擦拭，并在酒精灯的外焰上灼烧，将镊子晾凉。用晾凉的镊子， 夹取 20 L 小枪头，在转化后的平板

13、上挑取单菌落，扔到培养基中。 5 接好菌的螺口管，进行摇菌。 37， 180rpm 。 摇到菌的对数期（ OD600值 0.4-0.6 ） ， 时间大概2-3h。可以模糊看到手即可。（注意不要摇过） 6用完的平板用封口膜封住，倒置放于4保存。 7若直接用菌液进行接菌，接菌比例为，菌液：LB 培养基 =1：100。 注意事项： 1 接菌吸培养基时，把放置培养基的三角瓶倾斜才吸取培养基，移液枪尽量不 要插进三角瓶中。 2接菌时一定要加入抗性，挑菌落时，要挑单个的菌落，且不要把培养基也扣 起来。 3摇菌不要过了它的对数期，2 小时后随时注意其生长状态。 （三）小量保菌： 1无菌操作台紫外线照射，后通

14、风。 2将摇到标准OD 值的菌液进行小量保菌，先在酒精灯的外焰上灼烧螺口管管口。 3保菌：从灭菌的饭盒中取出4 个 1.5ml 的灭菌的离心管，加入50 L 的灭菌后的 80%的甘油， 并分别加入相应的350 L 菌液。 一个基因的四个平行实验菌都要进行保菌。 （若不保菌，实验不能进行重复，只能从头做） 4标清保菌的类别，名称，时间，如“ BL21 PET32a VAV 1 号 2010.7.14” ,其中的 1 号 是平行对照中它排几号。 5混匀， -20保存。 注意事项： 1在小量保菌中，一个基因的四个平行对照都要保菌，否则得重新摸条件。 2在小量保菌中，菌液与甘油一定要混匀在保存，否则菌

15、会被冻死。 6 （四）蛋白诱导表达条件摸索 1无菌操作台紫外线照射，后通风。 2小量保菌后的四个平行实验组，分别加入不同终浓度的IPTG，在不同的温度条件 下进行诱导（如下图） ： 对照编号IPTG 终浓度诱导温度诱导温度 1 号1 mmol/L 3h 37 2 号0.1 mmol/L 3h 37 3 号1 mmol/L 3h 30 4 号0.1 mmol/L 3h 30 （五）小量收菌 1将诱导完成的四个平行实验组菌液，分别取出1mL，对应装于4 个不同的1.5ml 离 心管中并做好标记。剩余的平行实验组菌液放入4保存。 2离心 7000rpm，2min，使菌沉淀。 3把上层培养基倒掉，用1

16、ml 1 PBS 把表达菌重悬，再次离心7000rpm，2min，使菌 沉淀。 4把上层 1 PBS 倒掉，再次离心同步骤3。 5用 80 L 1 PBS 把表达菌体重悬。 6在四个平行的重悬液中，分别加入80 L 3 SDS-PAGE loading buffer 。 （ 把 3 SDS-PAGE loading buffer当成 2 SDS-PAGE loading buffer用） 7煮样8min 。 （打开锅盖煮） 8离心13000rpm,10min。吸上清。 9进行SDS-PAGE 电泳。 注意事项：在煮样时要打开锅盖煮，防止小样进水，若样进水，则不能再用。 （六） SDS-PAGE

17、胶的配制 1分离胶的配制 （ 1）找出配套的胶板，用擦镜纸擦干净，并固定在配胶器上。随后用去离子水 试漏。 （ 2）若胶板不漏水，就进行分离胶的配制。依次将水、30% 丙烯酰胺、1.5M Tris-Hcl （ PH 8.8） 、 10%SDS 、 10%过硫酸铵加到干净的小烧杯中（如下图），混匀。 （1mm 的胶板，一般配一块胶用5ml 。所配的胶浓度一般为12% ，但浓度也要视情况 而定。蛋白越小，胶的浓度越大。） 7 （ 3）将胶板中的水倒掉，并用滤纸吸干水分（不要将滤纸塞到胶板底部）。 （ 4）小烧杯中再加入TEMED ，混匀。 （TEMED可使胶凝固，所以最后加） （ 5）灌胶：混匀的

18、分离胶沿着胶板边缘轻轻灌下，防止产生气泡。 （ 6）用水将分离胶压平。（用水灌满，同时加水时要缓慢加入，防止把胶吹起） 2浓缩胶的配制 （1）待分离胶与水中间形成明显的横线，即分离胶凝固。随后进行浓缩胶的配制，依 次将水、30%丙烯酰胺、1.0M Tris-Hcl （PH 6.8 ） 、 10%SDS 、 10%过硫酸铵加到干净 的小烧杯中（如下图） (2) 将分离胶上层的水倒掉，并用滤纸吸干水分。（尽量不要把滤纸插入） （3）小烧杯中再加入TEMED ，混匀。 （ 4）灌胶。然后插入梳子。 （ 5）把制胶器倒过来，胶仍然不会往外流，或可以明显看出梳子中两个齿之间的 胶面明显凹下去，说明浓缩胶

19、凝固。将凝固的胶板装入电泳槽内，并在电泳槽内加入 SDS-PAGE电泳缓冲液，把胶浸泡一段时间，时间越长越好。（防止梳子与胶相连， 8 或胶因湿度不够而萎缩） （6）点样时，再把梳子拔出来，拔时动作要轻，防止胶齿被拔断。 （七）未诱导和空载的制备 在诱导表达中，有两个重要的对照组，即空载诱导和未诱导。 1未诱导的制备 （1）未诱导是我们所做一个基因除了四个平行实验外，再做的一个对照组菌，唯一不 同的是它不进行诱导（接菌步骤如上） ，在 37下，进行摇菌， 不加 IPTG，摇起来即可。（和 表达完的菌浓度差不多即可） （2）未诱导的菌进行小量处理，见上面的小量收菌。 2空载诱导的制备 （1）空载

20、的转化： 将不连基因片段的空载体质粒，转入表达菌（和前面的试验用一个表达菌），如 “ BL21 -PET32a-VAV 质粒 ” 转入 “ BL21表达菌 ” ，其空载应当是“ BL21 -PET32a” 转入 “ BL21表 达菌 ” 。转化步骤同上。 （2）空载接一个菌（实验组），并摇菌摇到对数期（步骤同上）。 （3）空载的诱导： 空载的诱导条件固定为温度37，时间3h. ，IPTG 终浓度为1mmol/L 。 （诱导步骤 如上） 。 （4）空载的菌进行小量处理，见上面的小量收菌。 （八）蛋白诱导表达条件摸索的SDS-PAGE 电泳 1拔掉SDS 胶上的梳子，并用小针调整齿的位置（使它们都

21、平行）。 2点样。用20 L 的小枪头，吸煮过的样品10 L，对准胶孔点样，注意不要把 样品点在外面。我们用的marker 是低分子量蛋白marker 。 一般的点样顺序是： 1 2 3 4 5 6 7 空载未诱导样品 1 号样品 2 号样品 3 号样品 4 号marker 3开始电泳，电泳仪正负极接好，打开电源。浓缩胶：电压low 100V 分离胶：电压high 150V 。 4卸胶染色。等胶内的所有的蓝色都跑出去，电泳停止，一般时间为1 小时 45 分。 把胶板从电泳仪上卸下，用刀片把胶板撬开，胶的浓缩胶部分割除，放入考马斯亮蓝R-250 染色液中进行常温过夜染色。 5脱色。将过夜染色的S

22、DS-PAGE 胶放入脱色液中进行脱色，直到背景发白。 （九）四个平行实验组菌液的选择 1 将脱好的胶拿出进行观察，看四个平行实验组菌液是否进行了蛋白表达。一般来说， 未诱导没有过量的蛋白表达，而空载有一处蛋白的过量表达（大小由表达载体决定），四个 平行实验组也有一处蛋白的过量表达，它比空载表达的蛋白要大，大出的那一部分即我们的 目的蛋白。 2若平行实验组中无过量蛋白表达，尤其是37， 1mmol/L ，3h 无过量蛋白表达， 则说明蛋白无表达。 3若平行实验组中有过量蛋白表达，但它的大小与空载的大小相同。这说明蛋白进行 了漏表达。 9 4 若蛋白表达正常， 则选择诱导温度最低，IPTG 浓度

23、最低的实验组 （30， 0.1 mmol/L ， 3h） ，进行下面的小量超声实验。 （十）表达菌的小量超声实验 1把以上做的四个平行实验组菌液从4中拿出。 2将最有条件的实验菌全部收集在1.5ml 的小离心管中。 （其他平行实验组的菌进行 灭菌） 3离心 7000rpm，2min，使菌沉淀。 4把上层培养基倒掉，用1ml 1 PBS 把表达菌重悬，再次离心7000rpm，2min，使菌 沉淀。 5把上层 1 PBS 倒掉，再次离心同步骤3。 6用 500 L 1 PBS 把表达菌重悬。 7将菌液放入小玻璃管中，准备进行超声。 8将超声仪打开预热20min ，并准备冰盒。 9将呈菌液的小玻璃管

24、放入冰盒进行超声，超声效率为3050HZ，超声 3s，停 5s。 直到菌液超澄清（透明呈现鸡蛋清色）。 10将超开的菌液进行离心，13000rpm，10min。 11离心产物上清取出100 L，加入100 L3 SDS-PAGE loading buffer。 12上清倒掉，沉淀用1ml 1 PBS 把表达菌重悬，再次离心13000rpm，10min。 13重复 11 步。 14上清倒掉，用100 L 将沉淀悬起，加入100 L3 SDS-PAGE loading buffer。 15上清和沉淀都进行煮样，开锅盖，8min。 16离心13000rpm,10min。吸上清。 17进行 SDS 电

25、泳。 注意事项： 1小样超声时，要超彻底，一般超45 分钟即澄清。若仍然不澄清，则可能是包涵 体。超的过程中不要超糊。 2在洗超声离心物的沉淀时，要洗干净。 （十一）破菌超声的SDS-PAGE 电泳 1配胶、点样、电泳的步骤如上。破菌超声的点样顺序一般为： 1 2 3 4 5 6 marker 未诱导空载全菌破菌上清破菌沉淀 未诱导，空载，全菌为摸索表达条件时所用的样品。 注：我们破的几号菌，就上几号的全菌样。 2若破菌上清表达的蛋白与全菌的蛋白分子量一致（目的蛋白），且破菌沉淀中没有， 这说明蛋白可溶；若破菌沉淀中有目的蛋白，而破菌上清中没有，说明蛋白为包涵体。 （十二）目的蛋白的大量表达（

26、1L） 1配制培养基1L，每大瓶500ml ，高压灭菌4保存。 2一级接菌：摸索完条件的表达菌进行接菌3 管，每管5ml。抗性：培养基=1:1000, 菌液：培养基 =1:100。 （菌液为针对可溶条件的小量保菌液）步骤如上。37， 120rpm，过 夜摇菌。 10 3标准保菌： 100 L 灭菌甘油加入700 L 过夜菌。混匀，-20保存。（写好名称 日期，如上，放入表达菌的库中） 3二级接菌：对大瓶进行接菌，抗性：培养基=1:1000，菌液：培养基 =1:100。即每瓶 5ml。 4摇菌： 37， 180rpm，摇到对数期，摇到菌的对数期（OD600值 0.4-0.6 ） ，时间 大概 2

27、-3h。可以模糊的看到手即可。（注意在摇过程中随时观察状态，不要摇过） 5诱导：依据摸索好的条件进行诱导。 （十三）大量诱导的收菌： 150ml 离心管灭菌烘干，待用。 2找出两个50ml 离心管，管盖和管壁上做标记，并称重。 36个 50ml 离心管 （包括称重的两个） ，倒入菌液 （4045ml） 。配平，离心 7000rpm， 10min。 4倒掉上清，用1 PBS 把菌重悬，离心7000rpm ， 10min 。 5重复4。 6倒掉上清，称菌体的重量。 7悬菌。1g 菌体加入35ml 的纯化时用的上样缓冲液悬起。-20 保存。 （十四）大量表达菌的超声 1把表达菌从-20拿出，在流水中

28、融化。 2把完全融化的表达菌，放入小烧杯中准备超声。 3将超声仪打开预热20min ，并准备冰盒。 4将呈菌液的小烧杯放入冰盒进行超声，超声效率为30 50HZ ，超声3s，停 5s。直到菌液超澄清，呈现鸡蛋清色。（一般超20-30min ，注意不要吵时间太长，使 菌超糊） 5将超开的菌液进行离心，13000rpm ， 10min 。 6将上清收集在灭菌的50ml 离心管中，进行纯化。 五促进原核表达的蛋白可溶的方法： 一般来说，人们认为包涵体的形成是因为新生多肽链不能在正确位置形成二硫 键，二硫键错配，进而错误折叠的结果。而IPTG 浓度越低，温度越低，一般蛋白的 可溶性越大，因为这样的条件

29、下，可以减慢蛋白的形成，减少蛋白的二硫键错配，从 而促进蛋白的可溶。 1使蛋白可溶的条件并不是固定的，一般来说，以上条件就可是蛋白可溶（有 时2/4条 件 可 以 把IPTG浓 度 提 的 高 一 点 ） 。 但 如 果 仍 不 可 溶 的 话 ， 可 以 试 一 下 0.025mmol/L，常温，过夜诱导。这种条件是IPTG 使用量的最小浓度，可以使包涵体 部分可溶。 2180rpm 摇菌摇对数时，不要摇过。对数期时，是表达菌产蛋白的最佳时期。 表达菌浓度太大，对菌中蛋白的可溶性影响会很大。所以在摇菌到2h 后，一定密切 关注菌的浓度，随时用分光光度计测OD 600 值。这就意味着在接菌时，

30、多接一些菌（由 实际情况而定）。 3蛋白的可溶与表达菌也有关系。 菌株内源的蛋白酶过多，可能会造成外源表达产物的不稳定，所以一些蛋白酶缺 陷型菌株往往成为理想的起始表达菌株。堪称经典的BL21 系列就是lon 和 ompT 11 蛋白酶缺陷型，也是我们非常熟悉的表达菌株。大名鼎鼎的BL21(DE3)融源菌则是添 加 T7 聚合酶基因， 为 T7 表达系统而设计。BL21(DE3)即我们做表达是常用的表达菌。 真核细胞偏爱的密码子和原核系统有不同，因此，在用原核系统表达真核基因的 时候，真核基因中的一些密码子对于原核细胞来说可能是稀有密码子，从而导致表达 效率和表达水平很低。改造基因是比较麻烦的

31、做法，Rosetta 2 系列就是更好的选 择 这 种 携 带pRARE2质 粒 的BL21衍 生 菌 ， 补 充 大 肠 杆 菌 缺 乏 的 七 种 （AUA,AGG,AGA,CUA,CCC,GGA 及 CGG ）稀有密码子对应的tRNA ，提高外源基 因、尤其是真核基因在原核系统中的表达水平。（已经携带有氯霉素抗性质粒） 当要表达的蛋白质需要形成二硫键以形成正确的折叠时，可以选择K-12衍生菌 Origami 2系列， thioredoxin reductase (trxB)和 glutathione reductase (gor)两条主要还原 途径双突变菌株，显著提高细胞质中二硫键形成几

32、率，促进蛋白可溶性及活性表达。 （卡那霉素敏感） Rosetta- gami? 2 则是综合上述两类菌株的优点，既补充7 种稀有密码子，又能够 促进二硫键的形成，帮助表达需要借助二硫键形成正确折叠构象的真核蛋白。（卡那 霉素敏感） Origami B 是衍生自lacZY 突变的BL21 菌株，这个突变能根据IPTG 的浓度精 确调节表达产物，使得表达产物量呈现IPTG 浓度依赖性。（四环素敏感） 在决定试用这些名字古怪的菌株时，有几个小Tips 是要注意的，一个是不同菌株 有时已经携带某个质粒或者已经具有某种抗生素抗性，要注意自己的表达质粒是否能 与之兼容。比如Rosetta 2 已经携带有氯

33、霉素抗性质粒，不能再用氯霉素筛选等等。 现象可能原因改进方案建议菌株 无蛋白表达 E. coli 的密码子偏移性 补充稀有密码子的 tRNA ；将稀有密码子突变为 普通大肠杆菌密码子 Rosetta 2 Rosetta-gami 2 Rosetta-gami B RosettaBlue 出现截短蛋白 包涵体 二硫 键形成困难 降低宿主胞质的还 原性； 利用促进二硫键形成的 各种载体标签 Origami 2 Rosetta-gami 2 Rosetta-gami B 表达 过快，表达量过高 控制优化表达水 平：降温，IPTG 浓度优化 Tuner Rosetta-gami B 蛋白无活性蛋白错误

34、折叠 降低宿主胞质的还 原性； 利用促进二硫键形成的 各种载体标签 Origami 2 Rosetta-gami 2 Rosetta-gami B 控制优化表达水 平：降温，IPTG 浓度优化 Tuner Rosetta-gami B 细胞死亡，生长 极困难 毒性 蛋白 更严格的本底表达 控制 pLysS 菌株 无克隆生长 过高 本底表达 更严格的本底表达 控制 pLysS 、 pLysE 菌株 4若实在不可溶，只能把蛋白截短，这样可溶性会明显增加。 12 六 SDS-PAGE的相关技巧： 1 SDS-PAGE 电泳的原理： SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS（十二

35、烷基硫 酸钠），SDS 会与变性的多肽，并使蛋白带负电荷，由于多肽结合SDS 的量几乎总 是与多肽的分子量成正比而与其序列无关，因此SDS 多肽复合物在丙稀酰胺凝胶电 泳中的迁移率只与多肽的大小有关，在达到饱和的状态下，每克多肽可与1.4g去污 剂结合。当分子量在15KD到 200KD之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线 性关系，符合下式：logMW=K-bX，式中： MW 为分子量，X 为迁移率，k、b 均为常 数，若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲线， 未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子 量。 2 SDS-PAG

36、E 电泳遇到的相关问题及解答。 （1）配胶缓冲液系统对电泳的影响？ 在 SDS PAGE 不连续电泳中，制胶缓冲液使用的是Tris HCL 缓冲系统，浓 缩胶是pH6.7 ，分离胶pH8.9 ；而电泳缓冲液使用的Tris 甘氨酸缓冲系统。在浓缩 胶中，其pH 环境呈弱酸性，因此甘氨酸解离很少，其在电场的作用下，泳动效率低； 而 CL 离子却很高，两者之间形成导电性较低的区带，蛋白分子就介于二者之间泳动。 由于导电性与电场强度成反比，这一区带便形成了较高的电压剃度，压着蛋白质分子 聚集到一起，浓缩为一狭窄的区带。当样品进入分离胶后，由于胶中pH 的增加，呈 碱性，甘氨酸大量解离，泳动速率增加，直

37、接紧随氯离子之后，同时由于分离胶孔径 的缩小， 在电场的作用下，蛋白分子根据其固有的带电性和分子大小进行分离。所以， pH 对整个反应体系的影响是至关重要的，实验中在排除其他因素之后仍不能很好解 决问题的情况，应首要考虑该因素。 （2）提高SDS-PAGE电泳分辨率的途径？ 聚丙烯酰胺的充分聚合，可提高凝胶的分辨率。建议做法：待凝胶在室温凝固 后，可在室温下放置一段时间使用。忌即配即用或4 度冰箱放置，前者易导致凝固不 充分，后者可导致SDS 结晶。一般凝胶可在室温下保存4 天， SDS 可水解聚丙烯酰 胺。 （4） “ 微笑 ” （两边翘起中间凹下）形带原因？ 主要是由于凝胶的中间部分凝固不

38、均匀所致，多出现于较厚的凝胶中。处理办 法：待其充分凝固再作后续实验。 （5） “ 皱眉 ” （两边向下中间鼓起）形带原因？ 主要出现在蛋白质垂直电泳槽中，一般是两板之间的底部间隙气泡未排除干净。 处理办法：可在两板间加入适量缓冲液，以排除气泡。 （6）为什么带出现拖尾现象？ 主要是样品融解效果不佳或分离胶浓度过大引起的。处理办法：加样前离心； 选择适当的样品缓冲液，加适量样品促溶剂；电泳缓冲液时间过长，重新配制；降低 凝胶浓度。 13 （7）为什么带出现纹理现象？ 主要是样品不溶性颗粒引起的。处理办法：加样前离心；加适量样品促溶剂。 （8）什么是“ 鬼带 ” ，如何处理？ “ 鬼带 ” 就是

39、在跑大分子构象复杂的蛋白质分子时，常会出现在泳道顶端（有时 在浓缩胶中）的一些大分子未知条带或加样孔底部有沉淀，主要由于还原剂在加热的 过程中被氧化而失去活性，致使原来被解离的蛋白质分子重新折叠结合和亚基重新缔 合，聚合成大分子，其分子量要比目标条带大，有时不能进入分离胶。但它却于目标 条带有相同的免疫学活性，在WB 反应中可见其能与目标条带对应的抗体作用。处理 办法：在加热煮沸后，再添加适量的DTT 或 Beta 巯基乙醇，以补充不足的还原剂； 或可加适量EDTA 来阻止还原剂的氧化。 （9）为什么溴酚蓝不能起到指示作用？ 我们在实验中常会遇到溴酚蓝已跑出板底，但蛋白质却还未跑下来的现象。主 要与缓冲液和分离胶的浓度有关。处理办法：更换正确pH 值的Buffer ；降低分离胶 的浓度。 (10) 为什么电泳的条带很粗？ 电泳中条带很粗是常见的事，主要是未浓缩好的原因。处理办法：适当增加浓缩 胶的长度；保证浓缩胶贮液的pH 正确（ 6.7）；适当降低电压。